王麗暉,黃旭東,汪晶華,張 超,史永紅,楊新軍

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一,在國(guó)外該病是導(dǎo)致慢性腎功能衰竭的首位原因。隨著我國(guó)糖尿病發(fā)病率的升高,DN也逐漸成為國(guó)內(nèi)慢性腎功能衰竭的主要原因之一。有研究表明,多種細(xì)胞因子參與DN的發(fā)病過(guò)程,結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)在DN早期腎小球系膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白過(guò)度分泌過(guò)程中具有一定作用[1]。在高糖狀態(tài)下腎小球系膜細(xì)胞CTGF的表達(dá)受p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的調(diào)節(jié)[2]。絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)作為p38 MAPK磷酸化的調(diào)控因子,如何在腎小球系膜細(xì)胞CTGF表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白分泌過(guò)程中發(fā)揮作用,越來(lái)越受到研究人員關(guān)注[3]。MKP-1如何調(diào)節(jié)CTGF表達(dá)和系膜細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,目前尚無(wú)定論[4]。鈉-葡萄糖共運(yùn)蛋白2(SGLT2)抑制劑是一種新型降糖藥物,還能夠降低DN患者蛋白尿、延緩慢性腎功能衰竭的發(fā)生[5]。但是SGLT2抑制劑對(duì)DN保護(hù)作用的具體機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)觀察SGLT2抑制劑達(dá)格列凈對(duì)高糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞MKP-1表達(dá)的影響及機(jī)制,明確MKP-1與CTGF表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白分泌的關(guān)系,以期為達(dá)格列凈治療DN提供更充足的理論基礎(chǔ)和臨床證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

達(dá)格列凈(粉劑)由阿斯利康醫(yī)藥科技(北京)有限公司饋贈(zèng)。北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司負(fù)責(zé)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗羊IgG和羊抗兔IgG進(jìn)口分裝。兔抗大鼠MKP-1、CTGF多克隆抗體、SB203580購(gòu)自Santa Cruz公司;兔抗大鼠p38 MAPK和兔抗小鼠p-p38 MAPK購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology;RT-PCR試劑盒購(gòu)自Promega公司;聚偏二氟乙烯膜(PVDF)購(gòu)自美國(guó)Milipore公司;細(xì)胞上清液中CTGF和纖維連接蛋白(FN)的ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自蘇州瑞諾德生物科技有限公司;Ⅳ型膠原放射免疫試劑盒購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所有限公司。

1.2 系膜細(xì)胞培養(yǎng)及分組

大鼠腎小球系膜HBZY-1細(xì)胞株購(gòu)自武漢大學(xué)保藏中心,采取常規(guī)復(fù)蘇、胰酶消化法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。首先將細(xì)胞分為4組,正常對(duì)照組(5.5 mmol/L葡萄糖培養(yǎng))、滲透壓對(duì)照組(5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇培養(yǎng))、高糖組(30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng))、達(dá)格列凈干預(yù)組(30 mmol/L葡萄糖+10 μmol/L達(dá)格列凈培養(yǎng))。各組細(xì)胞均干預(yù)48 h后收集細(xì)胞,應(yīng)用相應(yīng)方法提取系膜細(xì)胞的蛋白質(zhì)和RNA,同時(shí)將細(xì)胞上清液收集到EP管中待測(cè)。

1.3 達(dá)格列凈對(duì)系膜細(xì)胞增殖影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的系膜細(xì)胞,經(jīng)胰酶消化后,吹打成單細(xì)胞懸液,接種于96孔板中,按照分組進(jìn)行干預(yù),觀察4組培養(yǎng)12、24、48 h系膜細(xì)胞增殖情況。另外,觀察不同濃度(0、1、10和20 μmol/L)達(dá)格列凈分別與30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)48 h后,系膜細(xì)胞的增殖情況。干預(yù)結(jié)束的各組細(xì)胞中加入MTT試劑(5 g/L),繼續(xù)培養(yǎng)4 h,然后分別加入DMSO,使用酶標(biāo)儀觀察波長(zhǎng)490 nm各組的吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

1.4 Western blotting檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

用冷PBS液將系膜細(xì)胞洗2遍,隨后加入細(xì)胞裂解液,進(jìn)行冰浴、離心操作。取樣本50 μg,采用Lowry法測(cè)定蛋白濃度,8% SDS-PAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。加入MKP-1、CTGF、p38 MAPK和p-p38 MAPK抗體,稀釋比例為1∶200,4 ℃過(guò)夜。再次洗膜操作后分別加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000稀釋)。洗膜,加ECL試劑。Western blotting檢測(cè)條帶采用ODYSSEY雙色紅外激光成像系統(tǒng)(美國(guó)LICOR公司)掃描,定量分析采用LabWorks 4.5(美國(guó)UVP公司),測(cè)定其吸光度值。

1.5 RT-PCR檢測(cè)

采用Trizol試劑提取系膜細(xì)胞總RNA,總RNA含量和純度應(yīng)用紫外分光光度儀測(cè)定。cDNA合成應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶催化。在Taq DNA聚合酶作用下以適量cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增過(guò)程主要包括:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性50 s進(jìn)入循環(huán),58 ℃和56.9 ℃分別為退火溫度,作用時(shí)間為60 s,72 ℃延伸8 min,循環(huán)30次。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳,應(yīng)用美國(guó)UVP公司生產(chǎn)的凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析,對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行吸光度掃描。用目的基因與GAPDH吸光度的比值來(lái)表示各基因的相對(duì)表達(dá)量。不同基因引物序列見(jiàn)表1。

1.6 細(xì)胞上清液CTGF和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白測(cè)定

收集系膜細(xì)胞上清液,應(yīng)用ELISA試劑盒檢測(cè)CTGF和FN含量,應(yīng)用放射免疫法檢測(cè)Ⅳ型膠原的含量,檢測(cè)步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 達(dá)格列凈對(duì)系膜細(xì)胞增殖的影響

與正常對(duì)照組比較,高血糖組培養(yǎng)12、24、48 h系膜細(xì)胞增殖程度增強(qiáng)(P<0.05,P<0.01)。與高糖組比較,達(dá)格列凈干預(yù)組培養(yǎng)24和48 h系膜細(xì)胞的增殖程度減弱(P<0.05)。見(jiàn)表2。0、1、10和20 μmol/L達(dá)格列凈分別與30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)48 h后,系膜細(xì)胞吸光度值分別為0.642±0.031、0.437±0.021、0.456±0.023和0.445±0.022。與0 μmol/L達(dá)格列凈比較,1、10和20μmol/L達(dá)格列凈干預(yù)能減弱系膜細(xì)胞增殖程度(P<0.05)。

表2 4組系膜細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖狀況比較

2.2 達(dá)格列凈對(duì)MKP-1、CTGF、p38 MAPK及p-p38 MAPK蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較,高糖組MKP-1蛋白表達(dá)降低,CTGF和p-p38 MAPK蛋白表達(dá)升高(P<0.01)。與高糖組比較,達(dá)格列凈干預(yù)組MKP-1蛋白表達(dá)升高,CTGF和p-p38 MAPK蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。4組p38 MAPK蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1、表3。

1.正常對(duì)照組;2.滲透壓對(duì)照組;3.高糖組;4.達(dá)格列凈干預(yù)組;正常對(duì)照組采用5.5 mmol/L葡萄糖培養(yǎng),滲透壓對(duì)照組采用5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇培養(yǎng),高糖組采用30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng),達(dá)格列凈干預(yù)組采用30 mmol/L葡萄糖+10 μmol/L達(dá)格列凈培養(yǎng);MKP-1為絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1,CTGF為結(jié)締組織生長(zhǎng)因子,MAPK為絲裂原活化蛋白激酶。圖1 達(dá)格列凈對(duì)系膜細(xì)胞MKP-1、CTGF、p38 MAPK及p-p38 MAPK蛋白表達(dá)的影響

表3 4組系膜細(xì)胞MKP-1、CTGF、p38 MAPK及p-p38 MAPK蛋白表達(dá)比較

2.3 達(dá)格列凈對(duì)系膜細(xì)胞CTGF和FN mRNA表達(dá)的影響

正常對(duì)照組、滲透壓對(duì)照組、高糖組和達(dá)格列凈干預(yù)組CTGF mRNA表達(dá)分別為0.21±0.02、0.22±0.02、0.78±0.24和0.59±0.02;FN mRNA表達(dá)分別為0.22±0.03、0.24±0.02、0.81±0.18和0.56±0.11。與正常對(duì)照組比較,高糖組CTGF和FN mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05)。與高糖組比較,達(dá)格列凈干預(yù)組CTGF和FN mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

1.正常對(duì)照組;2.滲透壓對(duì)照組;3.高糖組;4.達(dá)格列凈干預(yù)組;正常對(duì)照組采用5.5 mmol/L葡萄糖培養(yǎng),滲透壓對(duì)照組采用5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇培養(yǎng),高糖組采用30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng),達(dá)格列凈干預(yù)組采用30 mmol/L葡萄糖+10 μmol/L達(dá)格列凈培養(yǎng);CTGF為結(jié)締組織生長(zhǎng)因子,FN為纖維連接蛋白;與正常對(duì)照組比較,①P<0.05;與高糖組比較,②P<0.05。圖2 RT-PCR檢測(cè)4組系膜細(xì)胞CTGF和FN mRNA表達(dá)

2.4 達(dá)格列凈對(duì)細(xì)胞上清液CTGF及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白含量的影響

與正常對(duì)照組比較,高糖組細(xì)胞上清液CTGF、FN和Ⅳ型膠原含量明顯增加(P<0.01)。與高糖組比較,達(dá)格列凈干預(yù)組細(xì)胞上清液CTGF、FN和Ⅳ型膠原含量明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 4組系膜細(xì)胞上清液中CTGF和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白含量比較

3 討論

DN早期腎小球處于高灌注、高濾過(guò)狀態(tài),與之相對(duì)應(yīng)的病理改變是腎小球體積增大、系膜細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白分泌增多,隨著病程的延長(zhǎng),最終導(dǎo)致腎小球硬化[5-7]。CTGF作為促纖維化因子,能夠在糖尿病早期的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白分泌增多和晚期的腎臟纖維化過(guò)程中發(fā)揮作用[8]。有研究發(fā)現(xiàn),CTGF mRNA在DN早期腎小球中表達(dá)增強(qiáng),提示其參與了腎小球體積增大和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白分泌增多的過(guò)程[9]。另外,也有研究發(fā)現(xiàn),DN大鼠腎小管上皮細(xì)胞CTGF表達(dá)增強(qiáng),表明CTGF能夠在DN腎小管增生和腎間質(zhì)纖維化中發(fā)揮作用[10]。本實(shí)驗(yàn)在高糖狀態(tài)下體外培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞,觀察到細(xì)胞上清液CTGF、FN和Ⅳ型膠原含量均明顯增加,同時(shí)伴有系膜細(xì)胞CTGF蛋白和mRNA表達(dá)增強(qiáng),提示高糖刺激可以通過(guò)增強(qiáng)CTGF蛋白和mRNA表達(dá),進(jìn)一步促進(jìn)系膜細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。這與其他報(bào)道結(jié)果一致[11],表明高糖狀態(tài)下CTGF表達(dá)的增加或與高糖、糖基化終末產(chǎn)物、高壓力、腎素-血管緊張素Ⅱ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活等有關(guān)。

p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在高糖等因素刺激下,可使體外培養(yǎng)的系膜細(xì)胞CTGF表達(dá)上調(diào),細(xì)胞外基質(zhì)蛋白分泌增加[12]。抑制p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能夠影響系膜細(xì)胞的增殖狀態(tài),使CTGF表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白分泌減少,從另一個(gè)側(cè)面提示了p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了高糖狀態(tài)下CTGF表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白分泌[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,高糖能使系膜細(xì)胞p38 MAPK的磷酸化水平增高,但MKP-1蛋白表達(dá)降低。由于MKP-1位于細(xì)胞核內(nèi),是MAPK的天然負(fù)性調(diào)節(jié)因子,對(duì)MAPK的去磷酸化發(fā)揮重要作用[14]。雙特異性蛋白激酶磷酸化可以激活MAPK調(diào)節(jié)位點(diǎn)中保守的蘇氨酸或酪氨酸基團(tuán),使其去磷酸化,從而使MAPK活性下降。所以,活化的MAPK在MKP-1作用下發(fā)生去磷酸化過(guò)程,導(dǎo)致活性下降。MKP-1的特異性選擇底物是MAPK家族中的蛋白激酶,主要包括p38 MAPK、ERK1/2和JNK[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,高糖狀態(tài)下p38 MAPK可以作為MKP-1的底物,在MKP-1的作用下,去磷酸化過(guò)程減弱,p38 MAPK的活性增強(qiáng),參與CTGF的表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的分泌過(guò)程。以往實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),高糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞MKP-1蛋白表達(dá)明顯下降,而MKP-1 mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化,提示高糖并不能使MKP-1蛋白生成減少,但可致MKP-1蛋白降解增加[16]。本研究結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組比較,高糖組MKP-1蛋白表達(dá)降低,p-p38 MAPK蛋白表達(dá)明顯升高,提示高糖狀態(tài)下CTGF表達(dá)增強(qiáng)可能與MKP-1蛋白表達(dá)降低,p38 MAPK磷酸化增強(qiáng),p38 MAPK活化有關(guān)。

SGLT2抑制劑是一種新型降糖藥物,通過(guò)抑制腎臟近曲小管對(duì)葡萄糖的重吸收,使葡萄糖在尿液中的排泄增加,從而發(fā)揮降血糖作用[17-18]。另外,SGLT2抑制劑還具有腎臟保護(hù)作用,可以降低蛋白尿的發(fā)展和腎功能惡化的風(fēng)險(xiǎn),其機(jī)制包括控制血壓、降低腎小球內(nèi)壓和超濾、改變炎癥過(guò)程、減輕腎臟纖維化及缺血相關(guān)的腎臟損傷等[19-21]。有實(shí)驗(yàn)研究表明,應(yīng)用恩格列凈治療雄性db/db小鼠10周后,可以減輕FN和Ⅳ型膠原蛋白在腎小管的聚集,降低腫瘤轉(zhuǎn)化因子、CTGF以及腎臟損傷分子-1、中性粒細(xì)胞明膠酶的表達(dá)[22],提示恩格列凈可以減輕糖尿病小鼠腎組織的損傷和纖維化。在臨床試驗(yàn)中,與格列美脲比較,卡格列凈300 mg/d組血漿腫瘤壞死因子受體1、白細(xì)胞介素-6、基質(zhì)金屬蛋白酶7和FN1均明顯降低,表明卡格列凈可降低糖尿病患者血液中的纖維化因子[23]。上述研究均提示SGLT2抑制劑能減輕糖尿病患者腎組織細(xì)胞外基質(zhì)聚集,降低纖維化因子表達(dá),延緩腎臟纖維化進(jìn)程。但SGLT2抑制劑對(duì)高糖狀態(tài)下系膜細(xì)胞的作用如何,報(bào)道少見(jiàn)。本研究結(jié)果顯示,與高糖組比較,達(dá)格列凈干預(yù)組MKP-1蛋白表達(dá)升高,CTGF和p-p38 MAPK蛋白表達(dá)降低,細(xì)胞上清液CTGF、FN和Ⅳ型膠原含量降低,提示達(dá)格列凈可能通過(guò)增加MKP-1蛋白表達(dá),使p38 MAPK去磷酸化水平增強(qiáng),從而降低p38 MAPK活性,減少CTGF蛋白表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白分泌。進(jìn)一步表明達(dá)格列凈降低CTGF表達(dá)可能是通過(guò)增強(qiáng)MKP-1蛋白表達(dá),抑制p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述,達(dá)格列凈可以有效抑制高糖培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞CTGF表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白分泌,可能與激活MKP-1后,增強(qiáng)p38 MAPK去磷酸化有關(guān)。