常馨月, 萬路生, 楊小林, 蔣 騰, 楊雯靜, 劉 峰, 趙墾田

(1.西藏大學理學院, 拉薩 850000; 2.重慶三峽學院生物與食品工程學院, 重慶 萬州 404000;3.西藏農(nóng)牧學院資源與環(huán)境學院, 西藏 林芝 860000;4.華能西藏雅魯藏布江水電開發(fā)投資有限公司, 西藏 林芝 860000;5.中國電建集團成都勘測設計研究院有限公司, 成都 610000;6.華能西藏水電安全工程技術研究中心, 西藏 林芝 860000)

巨柏(Cupressusgigantea)系柏科(Cupressaceae)柏木屬(Cupressus)高大喬木[1],為我國西藏特有物種,主要散生分布在雅魯藏布江及其支流沿岸的林芝市巴宜區(qū)、米林縣和朗縣等地,或在海拔3 000～3 400 m的陽坡形成疏林。因種群數(shù)量稀少和天然更新困難等原因,巨柏被確定為國家一級保護物種,并在2004年列入中國物種紅色名錄[2]。

目前,巨柏的研究主要集中在苗木培育、群落生態(tài)學和種子繁育等方面[3-9],且研究發(fā)現(xiàn)巨柏群落存在天然更新困難等問題。通過對巨柏種子萌發(fā)過程中的生理指標進行研究分析,明確巨柏種子萌發(fā)的生理變化規(guī)律,以期更深層次地了解巨柏種子繁育機制,促進巨柏種質(zhì)資源保護,進而為巨柏的天然更新和種群擴大提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

巨柏采種林分位于西藏自治區(qū)林芝市朗縣洞嘎鎮(zhèn)扎西塘村,地理坐標為28°59′49″N,93°18′0″E,海拔3 060 m。研究地為高山峽谷地帶,具有干熱河谷氣候特征,年降水量在400 mm左右,降水主要集中在4—9月,且以6、7月最高,是溫帶半濕潤至半干旱的過渡區(qū)。

于2020年8月在雅魯藏布江右岸的階地巨柏林進行采種,分別采集3棵巨柏母樹樹冠下部不同方位的球果混合備用,自然風干取種,5 ℃貯藏。種子千粒重為4.137 g,含水量為7.59%。

1.2 方 法

2020年11月,將供試種子用0.5%的高錳酸鉀溶液進行消毒后用20 ℃蒸餾水浸種2 d[8],采用沙培法[9]進行發(fā)芽試驗。在巨柏種子萌發(fā)過程中,自浸種開始每2 d進行一次取樣,觀察種子形態(tài)特征,并測定各時期的主要生理生化指標,包括含水量、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、過氧化氫酶(CAT)活性和過氧化物酶(POD)活性。

采用考馬斯亮藍G-250染色法和蒽酮-H2SO4比色法分別測定種子的可溶性蛋白含量和可溶性糖含量。采用紫外吸收(Tris-HCl)法和愈創(chuàng)木酚法分別測定CAT活性和POD活性[10]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用Excel 2003軟件和Origin 9.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計、數(shù)據(jù)處理和圖表制作,用R軟件和SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 巨柏種子萌發(fā)過程中形態(tài)特征的變化

通過觀察發(fā)現(xiàn),巨柏種子萌發(fā)過程的第1～2天為巨柏種子吸脹時期;第4天巨柏種子種殼破裂露白;第6天胚根長度達到2 mm,約為巨柏種子長度的一半,開始記錄種子萌發(fā);第8天胚根長度達到1 cm,巨柏種子萌發(fā)達到高峰時期,可測定其種子發(fā)芽勢;第12天胚根長度為2～2.5 cm,可觀察到子葉生長,并有極少數(shù)種子的種皮脫落、子葉開始展開;第16天胚根長度為2.5～3.0 cm,子葉完全展開,萌發(fā)基本結束。

根據(jù)巨柏種子的萌發(fā)特征將巨柏種子的萌發(fā)過程劃分為7個階段:第一階段為未處理時期;第二階段為吸水膨脹的時期;第三階段為種殼破裂,出現(xiàn)露白的時期;第四階段為胚根長度達到2 mm的時期;第五階段為胚根長度達到1 cm的時期;第六階段為出現(xiàn)子葉的時期;第七階段為子葉展開的時期。

2.2 巨柏種子萌發(fā)過程中含水量的變化

巨柏種子萌發(fā)過程中含水量呈增長趨勢,不同時期的含水量存在顯著差異。由表1、圖2可知,巨柏種子的含水量在浸種前最低,吸脹期間含水量顯著升高,日增長速率達到12.97%,種子含水量由7.59%變?yōu)?3.53%;而后日增長速率降低,為2.045%,含水量緩慢增長,巨柏種子的含水量在種殼破裂和種子開始萌動時分別為36.82%和45.80%;胚根開始生長后,含水量再一次顯著升高,日增長速率約為4.12%,當子葉完全展開時,巨柏種子的含水量可達78.77%。

圖1 巨柏種子萌發(fā)過程的形態(tài)特征

圖2 巨柏種子萌發(fā)過程中含水量的變化

表1 巨柏種子萌發(fā)過程中生理指標的差異性分析

2.3 巨柏種子萌發(fā)過程中可溶性蛋白和可溶性糖含量的變化

巨柏種子萌發(fā)過程中可溶性蛋白的含量呈先降后升的變化趨勢,可溶性糖的含量呈先升后降再升的變化趨勢,見圖3。不同時期的可溶性蛋白和可溶性糖含量均存在顯著性差異,見表1。

圖3 巨柏種子萌發(fā)過程中可溶性蛋白和可溶性糖含量的變化

巨柏種子中可溶性蛋白的含量在種子吸脹時期幾乎沒有變化;隨著種子種殼破裂、出現(xiàn)露白,巨柏種子中可溶性蛋白的含量發(fā)生顯著變化,由292.62 mg/g降低為102.10 mg/g;在胚根生長時期,巨柏種子中可溶性蛋白含量的降低速率減慢,但仍出現(xiàn)顯著性變化,并在第8天達到整個萌發(fā)時期的最低含量(80.00 mg/g);而后隨著子葉的出現(xiàn)和生長,可溶性蛋白含量顯著升高。

巨柏種子中可溶性糖含量在種子吸脹時期顯著升高;成熟的巨柏種子中可溶性糖含量較高,為28.10 mg/g。第4天種殼破裂、出現(xiàn)露白時,巨柏種子可溶性糖含量達到最高,為41.08 mg/g;而后胚根開始生長,可溶性糖含量逐漸降低,在第12天能觀察到子葉生長時達到最低值,為1.07 mg/g;之后隨著子葉的生長,可溶性糖含量迅速顯著升高。

2.4 巨柏種子萌發(fā)過程中CAT和POD活性的變化

巨柏種子萌發(fā)過程中CAT和POD活性均呈先升后降的變化趨勢,且均存在顯著性差異。

由表1、圖4可知,巨柏種子的CAT活性在種殼破裂、出現(xiàn)露白之前沒有明顯變化,CAT活性顯著較低,約為0.79～2.70 U/g;隨著種殼破裂,種子開始萌發(fā),CAT活性顯著升高,第8天達到巨柏種子萌發(fā)過程的最高值(134.63 U/g);子葉出現(xiàn)后,CAT活性略有降低但不存在顯著性變化,而后隨著子葉的生長,CAT活性開始顯著下降。

圖4 巨柏種子萌發(fā)過程中CAT和POD活性的變化

巨柏種子的POD活性在子葉出現(xiàn)之前隨著種子的萌發(fā)逐漸升高,吸脹期間升高速率最快,可達22.71 μg/(g·d),POD活性升高為68.97 μg/g;之后速率降低,在第8天種子萌發(fā)達到高峰時,巨柏種子的POD活性達到整個萌發(fā)過程的最高值(108.62 μg/g);而后隨著胚根和子葉的生長,POD活性顯著下降。

2.5 巨柏種子萌發(fā)過程中生理指標的相關性分析

由表2可知,在巨柏種子萌發(fā)過程中,萌發(fā)時間與含水量、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量和CAT活性均存在顯著相關性,其中萌發(fā)時間與含水量和CAT活性存在極顯著正相關,相關系數(shù)為0.943和0.608;與可溶性蛋白含量存在極顯著負相關,相關系數(shù)為-0.713;與可溶性糖含量存在顯著負相關,相關系數(shù)為-0.470。含水量與可溶性蛋白含量和CAT活性存在顯著相關性,其中含水量與CAT活性存在顯著正相關,相關系數(shù)為0.543;與可溶性蛋白含量存在極顯著負相關,相關系數(shù)為-0.595?？扇苄缘鞍缀颗c可溶性糖含量和CAT活性存在顯著相關性,其中可溶性蛋白含量與可溶性糖含量存在顯著正相關,相關系數(shù)為0.477;與CAT活性存在極顯著負相關,相關系數(shù)為-0.694。可溶性糖含量與CAT活性存在極顯著負相關,相關系數(shù)為-0.854。

表2 巨柏種子萌發(fā)過程中生理指標的相關性分析

3 討 論

本研究中可溶性蛋白含量呈先降后升的變化趨勢,與露水草和川續(xù)斷種子萌發(fā)過程中蛋白質(zhì)含量的變化規(guī)律相同[11-12]。蛋白質(zhì)是種子中重要的營養(yǎng)物質(zhì)。成熟的巨柏種子中可溶性蛋白的含量較高,當其開始萌發(fā)后,種子內(nèi)貯藏的蛋白質(zhì)在酶的作用下被不斷分解成氨基酸并輸送至胚根,為種子萌發(fā)提供營養(yǎng),可溶性蛋白含量迅速下降[13]。而后隨著子葉的生長,巨柏種子的可溶性蛋白含量升高,這可能是萌發(fā)的巨柏種子進入新的代謝模式,合成大量新的蛋白質(zhì)。

可溶性糖含量的變化代表植物體內(nèi)碳水化合物的代謝過程,反映了種子內(nèi)部復雜的生理生化反應規(guī)律。本研究中,可溶性糖含量呈先升高后降低再升高的變化趨勢,與青蒿和掌葉木種子萌發(fā)過程中可溶性糖含量的變化規(guī)律相同[14-15]。種子萌發(fā)過程中的代謝活動自種子吸脹開始,巨柏種子萌發(fā)初期,種子吸脹并于內(nèi)部進行物質(zhì)代謝,可溶性糖含量逐漸升高,為種子進一步萌發(fā)積蓄能量;胚根突破種皮的階段是種子萌發(fā)過程中物質(zhì)代謝最活躍的時期,隨著種殼破裂、出現(xiàn)露白,可溶性糖含量急劇下降,這可能是種子萌發(fā)過程需要大量的營養(yǎng)物質(zhì)和能量,使得種子內(nèi)貯藏的可溶性糖被大量分解、消耗[16];之后隨著子葉的生長,萌發(fā)后的巨柏種子生理機能逐漸完善,葉片開始進行光合作用并合成大量可溶性糖,巨柏種子的可溶性糖含量升高。

CAT和POD是植物組織內(nèi)廣泛存在的兩種酶,兩者可以協(xié)同反映種子萌發(fā)的活力大小和細胞的生長分化狀況[17],進而反映植物的抗衰老能力。多數(shù)研究認為,種子內(nèi)POD的活性隨著種胚的生長逐漸升高,且提高種子內(nèi)POD活性,可有效促進種子萌發(fā)[18]。成熟的巨柏種子中CAT和POD活性較低,種子抗衰老能力較強,極耐儲存。巨柏種子萌發(fā)過程中CAT和POD活性呈先升后降的變化趨勢,與浦梅[19]對滇重樓種子的研究結果一致。在巨柏種子萌發(fā)初期,種子萌發(fā)活力較大,細胞快速分化,CAT活性和POD活性升高,這與巨柏種子萌發(fā)過程中表現(xiàn)出的特征一致;而后隨著胚根和子葉的生長,種子萌發(fā)活力減弱,細胞分化速率減慢,CAT活性和POD活性降低。巨柏種子萌發(fā)過程中POD活性的變化規(guī)律可能與以種子為主的代謝方式轉變?yōu)橐匀~片為主的代謝方式有關。

4 結 論

巨柏種子萌發(fā)過程劃分為7個階段。巨柏種子萌發(fā)過程中含水量呈增長趨勢,可溶性蛋白含量呈先降后升的變化趨勢,可溶性糖的含量呈先升后降再升的變化趨勢,CAT活性和POD活性均呈先升后降的變化趨勢。

萌發(fā)時間與含水量和CAT活性存在極顯著正相關,與可溶性蛋白含量存在極顯著負相關,與可溶性糖含量存在顯著負相關;含水量與CAT活性存在顯著正相關,與可溶性蛋白含量存在極顯著負相關;可溶性蛋白含量與可溶性糖含量存在顯著正相關,與CAT活性存在極顯著負相關;可溶性糖含量與CAT活性存在極顯著負相關。