黃艷艷, 許理文, 王鳳格, 康定明, 陳全家

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 烏魯木齊 830052;2.北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心,玉米DNA指紋及分子育種北京市重點實驗室, 北京 100097)

玉米雜種優(yōu)勢類群劃分和雜種優(yōu)勢模式構(gòu)建是玉米自交系選育和雜交組合組配的重要依據(jù),對提高玉米育種效率具有重要意義。雜種優(yōu)勢劃分通常用形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、配合力表現(xiàn)[1]以及系譜分析等方法[2],但在人工的干擾下,以及遺傳漂移的作用和系譜資料的丟失等原因,這些方法在進(jìn)行遺傳變異分析時有一定的局限性[3]。近年來,分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展迅速,為自交系雜交優(yōu)勢群的劃分提供了一定的分子學(xué)依據(jù),劃分結(jié)果更加準(zhǔn)確。國內(nèi)外學(xué)者利用SNP[4]、SSR[5]、InDel等分子標(biāo)記分別對親緣關(guān)系明確的玉米材料進(jìn)行雜種優(yōu)勢群劃分,所得結(jié)果與系譜資料基本吻合[6-9]。

插入/缺失(Insertion-Deletion,InDel)是指基因組中一個或多個核苷酸的插入或缺失所產(chǎn)生的長度多態(tài)性。其具有以下特點: 1) 分布廣泛[10-11]; 2) 穩(wěn)定性強(qiáng)(復(fù)發(fā)性突變發(fā)生的幾率較小)[12]; 3) 地理上分離的群體間等位基因頻率存在顯著差異,有可能作為祖先信息標(biāo)記[13-14]; 4) 小的InDel可以在短的擴(kuò)增子中進(jìn)行分析(InDel序列長度小于10 bp),且能對高度降解的DNA樣品進(jìn)行準(zhǔn)確分型。InDel標(biāo)記作為最近幾年新興的分子標(biāo)記,被廣泛應(yīng)用于玉米種質(zhì)遺傳多樣性研究。林峰等[15]利用135對InDel分布在玉米10條染色體上的分子標(biāo)記引物,系統(tǒng)分析了491份玉米自交系的遺傳多樣性,為組配優(yōu)良玉米雜交種提供了遺傳信息。

本研究利用北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心構(gòu)建的多重擴(kuò)增靶向捕獲測序基因分型InDel標(biāo)記組合(包含1 618個InDel標(biāo)記),對102份玉米自交系進(jìn)行InDel標(biāo)記的基因分型,旨在對新選、引育的優(yōu)良自交系進(jìn)行雜種優(yōu)勢群劃分,為種質(zhì)改良、擴(kuò)增和創(chuàng)新及雜交組合的親本選配提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

本實驗收集的玉米材料屬于中國玉米育種中應(yīng)用的新種質(zhì),并且具有較為廣泛的代表性和時效性,玉米材料共有102份,其中有X 178、鄭58、Mo 17、昌7-2、B 73、丹340等標(biāo)準(zhǔn)測驗種(表1)。

表1 供試玉米自交系名稱

圖1 1 618個(a)和1 011個(b)InDel標(biāo)記的基因分型

1.2 儀器及耗材

光照培養(yǎng)箱、離心管(2 mL、1.5 mL)、鋼珠、剪刀、液氮罐、組織研磨器、離心機(jī)、恒溫水浴鍋、燒杯、量筒、微波爐、離心管架、移液器(2.5 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、300 μL、1 000 μL)、醫(yī)用毛細(xì)管、一次性手套、衛(wèi)生紙、Qubit?4.0熒光計、-20 ℃冰柜、4 ℃冰箱、振蕩器、96孔PCR儀、qPCR儀、Ion Chef儀器、Ion Gene Studio S 5 prime測序儀。

1.3 方 法

1.3.1DNA的提取和質(zhì)檢

采用CTAB法提取102個樣品的基因組DNA,用Qubit?4.0熒光計進(jìn)行DNA質(zhì)量檢測和濃度測定。

1.3.2DNA工作液制備

使用Qubit?4.0熒光計(Thermo Fisher Scientific Company Carlsbad,USA)對上述DNA進(jìn)行定量,每個樣品使用10 ng的DNA。將待測樣品的DNA溶液稀釋到2.5 ng/μL,作為基因組DNA工作液待用。

1.3.3擴(kuò)增體系和程序

多重擴(kuò)增靶向捕獲體系為20 μL,4 μL 5× Ion AmpliSeq HiFi Master Mix,10 μL 2× 1 011 InDel標(biāo)記多重擴(kuò)增預(yù)混引物,4 μL DNA工作液和2 μL無核酸酶水。

多重擴(kuò)增程序如下:99 ℃ 2 min,99 ℃ 15 s的17個循環(huán),60 ℃ 4 min,然后保持10 ℃不超過2 h。

1.3.4引物部分消化

多重擴(kuò)增結(jié)束后用2 μL FuPa試劑對多重擴(kuò)增靶向捕獲產(chǎn)物進(jìn)行部分消化引物,在SimpliAmpTM熱循環(huán)儀上進(jìn)行,程序如下:50 ℃ 10 min,55 ℃ 10 min,60 ℃ 20 min,最后10 ℃下保溫不超過1 h。

1.3.5測序接頭和Barcode的連接

加入Ion P 1 Adapter(測序接頭)和Ion XpressTMBarcode(文庫條形碼),并加入DNA Ligase(DNA連接酶),連接反應(yīng)也在SimpliAmpTM熱循環(huán)儀上進(jìn)行,程序如下:在22 ℃ 30 min,68 ℃ 5 min,72 ℃ 5 min,10 ℃下保溫不超過2 h。

1.3.6文庫的純化和測序

利用Ion Library TaqMan定量試劑盒,在QuantStudio 6 Flex實時PCR系統(tǒng)上對構(gòu)建的待測樣品的多重擴(kuò)增靶向捕獲測序文庫進(jìn)行準(zhǔn)確定量,再將文庫統(tǒng)一稀釋到100 pmol/L,然后取等量混合,取25 μL混合后的文庫,利用Ion 540 KIT試劑套裝在Ion Chef儀器進(jìn)行自動化模板制備。

1.3.7類群分析

用PowerMarker 3.0軟件計算系之間的遺傳距離和遺傳相似度,計算出的遺傳距離用MEGA 7的UPGMA法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因分型分析

在本實驗中,利用多重靶向測序基因分型InDel試劑盒對102份供試材料進(jìn)行InDel基因分型,共計獲得7.8 G數(shù)據(jù),大約60 M的reads,InDel標(biāo)記的平均測序深度305倍,測序深度最高的達(dá)到1 500倍,個別InDel沒有測序數(shù)據(jù),說明玉米InDel靶向測序Panel還有優(yōu)化空間。如圖1(a)所示,在1 618個InDel標(biāo)記中,510個InDel的基因分型成功率(Call Rate)為100%,基因分型成功率大于80%的總共有1 035個?；贗nDel標(biāo)記測序數(shù)據(jù)深度和基因分型成功率對玉米InDel標(biāo)記靶向測序Panel進(jìn)行優(yōu)化,淘汰測序數(shù)據(jù)深度小于100倍和基因分型成功率低于80%的InDel標(biāo)記。如圖1(b)所示,獲得一個包含1 011個InDel標(biāo)記的玉米InDel標(biāo)記靶向測序Panel,取名為MaizeIDP 1 K。

2.2 引物多態(tài)性

利用PowerMarker 3.0軟件對1 270個InDel引物進(jìn)行統(tǒng)計計算,等位基因數(shù)為2 540個,平均等位基因數(shù)為2個,總的基因型個數(shù)為3 810個,平均基因型個數(shù)為3個,多態(tài)信息含量PIC值為0.228 0～0.375 0,平均值為0.364 2。當(dāng)PIC≥0.5時屬于高度多態(tài),0.25≤PIC<0.5屬于中度多態(tài),PIC<0.25屬于低度多態(tài)[1]。InDel標(biāo)記的PIC分析結(jié)果說明所選InDel標(biāo)記主要是中度多態(tài)性標(biāo)記(圖2)。

圖2 1 011個InDel標(biāo)記組合的PIC值分布

2.3 聚類分析

利用構(gòu)建的多重擴(kuò)增靶向捕獲測序InDel標(biāo)記組合對102個玉米自交系材料進(jìn)行基因分型,獲得了1 011個InDel標(biāo)記的基因分型數(shù)據(jù)。導(dǎo)入PowerMarker 3.0軟件計算自交系材料間的遺傳距離,將自交系材料間的遺傳距離矩陣數(shù)據(jù)導(dǎo)入MEGA 7,利用UPGMA法構(gòu)建了102個玉米自交系材料的聚類圖。如圖3所示,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)測驗種所代表的中國玉米生產(chǎn)主要應(yīng)用的雜種優(yōu)勢群,在聚類分析劃分的群中包括以CML 162為代表的亞熱帶混血群,以昌7-2為代表的黃改群,以B 73為代表的瑞德群,以Mo 17為代表的蘭卡斯特群,以丹340為代表的旅大紅骨群,以X 178為代表的P群。利用1 101個InDel標(biāo)記對102份自交系材料的雜種優(yōu)勢群劃分結(jié)果,與現(xiàn)有的雜種群和已知譜系高度一致[74-75],說明利用InDel標(biāo)記對玉米材料的雜種優(yōu)勢群分析是正確的,效果很好。結(jié)果證明InDel標(biāo)記也適合類群劃分,為InDel標(biāo)記在其他作物的類群劃分研究上的應(yīng)用提供了參考依據(jù)。

注:圖中分支的顏色代表了不同的雜種優(yōu)勢群,黃色代表黃改群,寶藍(lán)代表亞熱帶混血群,綠色代表瑞德群,紫紅色代表蘭卡斯特群,蔚藍(lán)色代表旅大紅骨群,紅色代表P群。

3 討 論

對于InDel基因分型的方法來說,使用靶向測序比其他方法更具有高通量、省時、省事和性價比高等優(yōu)點。郭子楓等[16]利用捕獲測序技術(shù)開發(fā)了一系列具有不同標(biāo)記數(shù)的玉米SNP標(biāo)記Panel,并驗證其效率。成本效益分析表明,其平臺不僅適合不同的應(yīng)用,而且育種者負(fù)擔(dān)得起,特別是中小型公司和發(fā)展中國家。

雜種優(yōu)勢群的劃分是新選、引育優(yōu)良自交系的前提,種質(zhì)改良和雜交組合的親本選配之前必須要進(jìn)行雜種優(yōu)勢的劃分。故本試驗利用多重靶向測序InDel標(biāo)記組合對102個玉米自交系進(jìn)行基因分型,從而對其進(jìn)行雜種優(yōu)勢劃分,其結(jié)果與系譜一致。