吳永飛, 楊雪蓮, 顏 麗, 王 霞, 胡小京

(貴州大學農(nóng)學院, 貴陽 550025)

葉綠體是綠色植物細胞中的一種重要細胞器,能通過光合作用合成氨基酸、類脂、蛋白質(zhì)等物質(zhì),以供植物生長發(fā)育所需[1]。綠色植物葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)非常保守,大多數(shù)基因組為雙鏈環(huán)形DNA分子,呈四段式結(jié)構(gòu),包括一個大單拷貝區(qū)(LSC)、一個小單拷貝區(qū)(SSC)和兩個大小相同、方向相反的反向重復區(qū)(IRs)[2]。綠色植物的葉綠體是半自主的,具有獨立的遺傳物質(zhì),通常編碼110～130個基因,主要編碼參與光合作用、轉(zhuǎn)錄和翻譯的基因[3]。葉綠體基因組由于其小而簡單的結(jié)構(gòu)、保守的序列和中等的核苷酸替換率,成為鑒定物種和分析系統(tǒng)發(fā)育的有前景的工具[4]。隨著高通量DNA測序技術的發(fā)展,葉綠體基因組序列在植物系統(tǒng)進化研究中得到了廣泛應用,如裂葉獨活[5]、紅兜蘭[6]、景天[7]、陽春砂[8]、紫羅蘭[9]等。

閉鞘姜(Helleniaspeciosa(J.Koenig) S. R. Dutta)為閉鞘姜科閉鞘姜屬多年生草本植物,又叫雷公筍、水蕉花、樟柳頭、白石筍等,主要分布在亞洲亞熱帶地區(qū),在我國云南、貴州、廣東、廣西等省區(qū)較為常見[10]。閉鞘姜富含氨基酸、多種維生素、礦質(zhì)元素、果膠、纖維素等多種營養(yǎng)成分[10],以及甾類化合物、萜類化合物、黃酮類化合物等成分[11],具有抗氧化[12]、降糖活性[13]、抗菌[14]、抗炎[15]、抗腫瘤[16]等功效,可用于治療發(fā)熱、高血糖、皮疹、哮喘、支氣管炎和腸道蠕蟲,并可用于緩解燒灼感、便秘、麻風病、貧血和其他皮膚病[17]。此外,閉鞘姜花大且為白色,呈厚錐形頂生穗狀花序,具鮮紅色苞片和淡紅色小苞片,是一種極具開發(fā)前景的野生花卉資源[18]。目前,閉鞘姜的研究還停留在功能的描述和化學成分的研究上,對閉鞘姜遺傳和進化方面的研究較少。本研究以閉鞘姜為試驗材料,利用高通量測序技術對閉鞘姜的葉綠體基因組進行測序,并對其進行密碼子偏好性、重復序列和系統(tǒng)發(fā)育關系分析,為閉鞘姜的物種鑒定、遺傳多樣性等的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、DNA提取與測序

試驗材料為新鮮無病害的閉鞘姜葉片,采摘于貴州省貴陽市(26°38′52″N,106°37′49″E)。憑證樣本存放在貴州大學農(nóng)學院實驗室(HS 20210701 YX)。

采用改良的十六烷基三甲基溴化銨(Cetyltrimethylammonium Bromide,CTAB)法[19]從新鮮葉片中提取總基因組DNA,提取的基因組DNA經(jīng)檢測合格后,用超聲波法將DNA片段化;對片段化的DNA進行片段純化、末端修復、3′端加A、連接測序接頭,再用瓊脂糖凝膠電泳進行片段大小選擇,進行聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)擴增形成測序文庫;建好的文庫先進行文庫質(zhì)檢,質(zhì)檢合格的文庫用Illumina NovaSeq進行測序(深圳市惠通生物科技有限公司)。原始數(shù)據(jù)經(jīng)過去接頭污染,去除低質(zhì)量序列后得到1.51 G的干凈數(shù)據(jù)(Clean reads)。

1.2 閉鞘姜葉綠體基因組的組裝與注釋

原始測序數(shù)據(jù)使用NGS QC Tool Kit v 2.3.3[20]進行質(zhì)控,使用Denovo組裝軟件SPAdes v 3.11.0,從1.51 G的高質(zhì)量數(shù)據(jù)中組裝出完整的葉綠體基因組[21]。使用PGA軟件對完整的葉綠體基因組進行注釋[22]。用OGDRAW在線軟件繪制閉鞘姜葉綠體基因組圖譜。注釋完成后,序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫,序列登錄號:OK 641589。

1.3 閉鞘姜葉綠體密碼子偏好性和重復序列分析

運用CodonW 1.4.2軟件[23]統(tǒng)計分析閉鞘姜葉綠體基因組密碼子的偏好性(Relative Synonymous Codon Usage,RSCU)。利用Reputer軟件預測散在重復序列。即正向重復(F)、反向重復(R)、互補重復(C)、回文重復(P),最小重復長度設置為30 bp,最小排列值為50,最多堿基錯配為3。利用MISA軟件[24]提供的Perl程序分析簡單重復序列(Simple Sequence Repeat,SSR)位點,程序在WINDOWS命令窗口運行。其中單核苷酸最低重復次數(shù)設置為10,二核苷酸為5,三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的最低重復次數(shù)為4。

1.4 閉鞘姜葉綠體基因組系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

以石蒜科君子蘭屬的細葉君子蘭[Cliviagardenii(MW 561117)]作物外群,構(gòu)建閉鞘姜及其20個近源物種系統(tǒng)發(fā)育樹。利用MAFFT 7.037軟件[25]將所有物種的葉綠體基因組序列進行比對并校正;隨后,使用model-finder var 1.6軟件來選擇TVM+F+I+G 4模型[26],利用RAxML var 8.2.9軟件[27],基于最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。自舉檢測值為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 閉鞘姜葉綠體基因組基本特征

閉鞘姜葉綠體基因組序列由167 158 bp核苷酸組成,具有典型的四分體結(jié)構(gòu)特征,即一個大單拷貝區(qū)(LSC),一個小單拷貝區(qū)(SSC)和一對反向重復序列(IRs)(圖1)。

由表1可知,LSC長度為91 239 bp,SSC長度為19 955 bp,兩個反向重復序列長度為27 982 bp,全基因組的GC含量為36.3%。注釋結(jié)果顯示,閉鞘姜葉綠體基因組共編碼了134個基因,包括88個蛋白編碼基因(PCGs)、8個rRNA基因和38個tRNA基因。其中21個基因在IR區(qū)域復制,包括9個PCGs(ndhB、psbL、rps7、rps19、rpl2、rpl22、rpl23、ycf1、ycf2),8個tRNA基因(trnI-CAU、trnL-CAA、trnV-GAC、trnI-GAU、trnA-UGC、trnR-ACG、trnN-GUU、trnH-GUG)和全部4個rRNA基因(rrn4.5、rrn5、rrn16、rrn23)。

表1 葉綠體基因組基因基本特征

編碼基因根據(jù)其產(chǎn)物功能的不同可分為光合作用相關基因(44)、自我復制相關基因(59)、其他基因(5)和未知功能基因(4)。閉鞘姜葉綠體基因組中只有少部分基因含有內(nèi)含子,其中trnK-UUU、rps16、trnG-UCC、atpF、rpoC1、trnL-UAA、trnV-UAC、petB、petD、rpl2、ndhB、trnI-GAU、trnA-UGC、ndhA基因各含有一個內(nèi)含子,clpP、ycf3基因含有兩個內(nèi)含子,此外,rps12基因存在反式剪接情況(表2)。

表2 閉鞘姜葉綠體基因組注釋信息

2.2 閉鞘姜葉綠體基因組重復序列分析

閉鞘姜葉綠體基因組中共鑒定出50個散在重復序列,其中有22個正向重復(44%),2個反向重復(4%),1個互補重復(2%)和25個回文重復(50%)。除了1個回文重復序列較長(27 982 bp)外,其余重復序列長度均在30～81 bp范圍內(nèi)。各重復序列在基因編碼區(qū)(rps3、psaB、ycf1等)、基因間隔區(qū)(rpl22-psaA、accD-psaI、rps15-ycf1等)、tRNA(trnL-UAA、trnS-GGA)和ycf3基因內(nèi)含子區(qū)域均有分布,在ycf2基因中出現(xiàn)了多個嵌套的序列重復(表3)。

表3 閉鞘姜葉綠體基因組的重復序列

2.3 閉鞘姜葉綠體基因組簡單序列重復

鑒定到閉鞘姜葉綠體基因組中含70個SSR位點(表4),其中單核苷酸重復序列最多,由A/T組成的有36個,占總SSR位點的51.43%;其次是二核苷酸重復序列,有23個,包括2個AG/CT和21個AT/AT重復序列,占總SSR位點的32.86%;三核苷酸序列出現(xiàn)8個,包括1個ACT/AGT和7個AAT/ATT重復序列,占總SSR位點的11.43%;四核苷酸序列出現(xiàn)3次,占所有SSR的4.29%,序列為AAAT/ATTT,未檢測到五核苷酸序列和六核苷酸序列。

圖1 閉鞘姜葉綠體基因組圖譜

表4 閉鞘姜葉綠體基因組SSR序列

2.4 閉鞘姜葉綠體密碼子偏好性

密碼子使用情況顯示,閉鞘姜葉綠體基因組中共含有55 719個密碼子,共編碼了22種氨基酸,各氨基酸的使用頻率在1.31%～9.84%之間(表5)。其中,編碼亮氨酸(Leu)的密碼子數(shù)量最多,為5 483個,占密碼子總數(shù)的9.84%;色氨酸(Trp)出現(xiàn)的次數(shù)最少,為732個,占密碼子總數(shù)的1.31%。除了甲硫氨酸(Met)和色氨酸(Trp)只有1個密碼子外,其余氨基酸均含2～6個同義密碼子。閉鞘姜葉綠體基因組中RSCU值大于1.00的密碼子為32個,其中29個以A或U結(jié)尾,3個以G或C結(jié)尾。說明閉鞘姜葉綠體基因組的密碼子偏愛A或U結(jié)尾,不偏好G或C結(jié)尾。

表5 閉鞘姜各氨基酸相對同義密碼子使用度

圖2 基于22個物種葉綠體基因組序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 系統(tǒng)進化分析

以細葉君子蘭作物外群,將閉鞘姜葉綠體基因組序列與21個近源物種的葉綠體基因組序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,以獲取閉鞘姜的系統(tǒng)發(fā)育關系(圖2)。結(jié)果顯示,所有節(jié)點的支持率都大于90%,可信度高,其中閉鞘姜與綠苞閉鞘姜(Costusviridis)親緣關系最近,處于同一小支,支持率達100%,此外,閉鞘姜和綠苞閉鞘姜組成的分支與粉鳥蝎尾蕉(Heliconiacollinsiana)處于同一分支上,支持率同樣為100%。

3 討 論

由于閉鞘姜科物種形態(tài)變異復雜,含有一些顯著的特點,因此從姜科分離出來成為一個獨立的科,目前對閉鞘姜科物種科內(nèi)等級的劃分和系統(tǒng)學研究還存在較大困難,因此閉鞘姜科植物的遺傳背景和系統(tǒng)進化關系是植物學的研究熱點[28-29]。葉綠體是重要的細胞器,具有自己的基因組,能通過光合作用將光能轉(zhuǎn)化為碳水化合物,提供植物生長和生存所需的基本能量[30]。本研究以采自貴陽市的閉鞘姜為材料,對其葉綠體基因組全序列進行了高通量測序,對閉鞘姜科物種的遺傳背景及系統(tǒng)進化關系加以補充。結(jié)果顯示,閉鞘姜葉綠體全基因組全長167 158 bp,具有典型的四分體結(jié)構(gòu),與大多數(shù)被子植物相似,其葉綠體基因組大小在120 000～180 000 bp區(qū)間內(nèi)[31]。閉鞘姜葉綠體基因組編碼了134個基因(88個蛋白編碼基因、38個tRNA基因和8個rRNA基因),總GC含量為36.3%。本研究結(jié)果與同屬的綠苞閉鞘姜的葉綠體基因組研究結(jié)果相似[32],而相較于已報道的生姜[33]、砂仁[34]、蘘荷草[35]等姜科植物,其葉綠體基因組更長,表明閉鞘姜與姜科植物存在不同特點。

密碼子使用偏好性是生物進化過程中廣泛存在的同義密碼子非均衡使用的現(xiàn)象,對基因表達以及蛋白的功能具有重要作用[36]。研究發(fā)現(xiàn),閉鞘姜葉綠體基因組包含55 719個密碼子,除了終止密碼子外,為22種氨基酸編碼,編碼密碼子最多的氨基酸為亮氨酸(Leu),占密碼子總數(shù)的9.84%,其次是異亮氨酸(Ile),占總密碼子的8.89%,最少的是色氨酸(Trp),占總密碼子的1.31%,偏好使用A和U堿基,密碼子使用偏性現(xiàn)象與蕁麻[37]類似。本研究分析了閉鞘姜葉綠體基因組的密碼子使用頻率,確定了該物種偏好使用的密碼子,對于了解閉鞘姜的遺傳背景具有重要意義。

重復序列在葉綠體基因組中發(fā)揮著重要的進化作用,能促進葉綠體基因組重排,影響基因組結(jié)構(gòu)的變化,并且可以增加種群遺傳多樣性[38]。閉鞘姜葉綠體基因組中共含有50個散在重復序列,其中正向重復和回文重復為主要重復序列,占比超過90%,大多數(shù)重復序列分布在基因間隔區(qū)和ycf2基因中。重復序列分布現(xiàn)象與豆瓣菜葉綠體基因組[39]的研究結(jié)果一致。簡單重復序列(SSR)作為重要的分子標記技術,在植物基因組中具有高度可重復性、多態(tài)性、通常共顯性和豐富性,已成功用于園藝植物[40]、農(nóng)作物[41]、中藥材[42]等多種植物上,為植物遺傳多樣性和遺傳關系的研究提供了有用的信息。本研究發(fā)現(xiàn),閉鞘姜葉綠體基因組含有70個SSR位點,其中單核苷酸重復序列是最多的,且全部由A、T堿基組成,隨著拷貝數(shù)目增加,SSR數(shù)量逐漸減少,但重復序列也主要由A、T堿基構(gòu)成,進一步驗證了葉綠體基因組序列中的SSR主要由A或T堿基所構(gòu)成[43]。

為確定閉鞘姜的進化地位和親緣關系,本研究以22個物種葉綠體全基因組序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果表明,閉鞘姜與綠苞閉鞘姜處于同一小支,支持率達到100%,表明二者具有較近的親緣關系,這與Chen等[44]的研究結(jié)果相似。本研究為閉鞘姜科植物物種鑒定和等級劃分提供有用信息,為閉鞘姜的分子進化和遺傳系統(tǒng)發(fā)育研究提供重要的參考。