李幸兒, 趙 艷, 李 雪, 任玉玲, 李 萍

(青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院, 西寧 810016)

血滿草(SambucusadnataWall. ex DC.)屬忍冬科(Caprifoliaceae)接骨木屬(Sambucus)多年生高大草本或半灌木,是一種傳統(tǒng)的藥用植物,主要分布于山西、甘肅、青海、四川、貴州、云南、寧夏和西藏等省區(qū),特別是在西藏東南部和西藏南部的低海拔地區(qū)[1-2]。從血滿草中分離出了多種化合物,包括苯丙酸類、酚類、黃酮類、三萜類、甾體類和芳香族酸[3],這些化合物具有祛風(fēng)、利尿、促進(jìn)血液循環(huán)和疏通絡(luò)脈等功效,因此血滿草被臨床用于治療急性和慢性腎炎、風(fēng)濕病和其他疾病[4]。目前,關(guān)于血滿草的研究主要集中在其化學(xué)成分分析[5-9]、多糖提取[10-12]、藥用價(jià)值[13-14]以及遺傳結(jié)構(gòu)[15-16]等方面,而關(guān)于其葉綠體基因組信息和進(jìn)化分析還未見報(bào)道。

葉綠體是植物細(xì)胞內(nèi)最重要、最普遍的質(zhì)體;細(xì)胞中由雙層膜圍成,含有葉綠素,能進(jìn)行光合作用的細(xì)胞器是細(xì)胞能量轉(zhuǎn)換和儲存的場所,其遺傳方式以母系遺傳為主。葉綠體基因組在細(xì)胞中有多種構(gòu)型,最常見的結(jié)構(gòu)是雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu),包括一個(gè)小的單拷貝區(qū)(SSC)和一個(gè)大的單拷貝區(qū)(LSC),這兩個(gè)區(qū)域被一對反向重復(fù)區(qū)域(IRa,IRb)分開,形成典型的雙鏈環(huán)狀四分體結(jié)構(gòu)[17]。20世紀(jì)50年代,當(dāng)時(shí)的植物生物學(xué)家通過對葉綠體基因組的研究,首次發(fā)現(xiàn)葉綠體含有自身的DNA[18],Jansen等[19]在2005年發(fā)現(xiàn),質(zhì)體基因組的大小在35～217 kb之間,但絕大多數(shù)光合生物的大小在115～165 kb之間,而葉綠體基因組序列的長度往往由IR區(qū)的長度決定[20]。隨著測序技術(shù)的不斷完善和推廣,二代測序憑借其測序性能強(qiáng)、周期短、無須參考基因組等優(yōu)點(diǎn),成為探究植物全基因組序列、遺傳多樣性的有效技術(shù)[21],為植物葉綠體基因組相關(guān)研究提供了技術(shù)支持,為后續(xù)系統(tǒng)發(fā)育、居群遺傳和譜系地理等方面的研究提供了有效途徑[22]。

雖然血滿草的化學(xué)成分和生物活性已有報(bào)道,但對其基因組的相關(guān)研究鮮見報(bào)道。完整的葉綠體基因組通常被用來研究系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和稀有物種的保護(hù)[23]。因此,本研究基于Illumina測序?qū)ρ獫M草的葉綠體基因組進(jìn)行了分析,并與其他屬的葉綠體基因組序列進(jìn)行了比較,以期促進(jìn)忍冬科的系統(tǒng)發(fā)育研究,為血滿草的保護(hù)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 血滿草葉片的采集

血滿草新鮮葉片樣品采集于青海孟達(dá)天池山(102°674′9″E,35°791′7″N),經(jīng)液氮快速冷凍處理后,-80 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩Ｖ参飸{證樣本保存于青海大學(xué)藏藥研究中心(TMSGS 21004)。

1.2 基因組DNA提取和測序

采用改良的CTAB方法[24]提取總基因組DNA,隨后在百邁克生物科技有限公司(北京,中國)的IlluminaHiseqX-ten平臺(圣地亞哥,美國)上對高質(zhì)量的DNA進(jìn)行測序。

1.3 葉綠體基因組組裝和注釋

葉綠體基因組組裝采用SPAdes(3.9.0)軟件[25],注釋采用cpGAVAS 2軟件,利用在線工具OGDRAW(http://ogdraw.mpimp-golm.mgp.de/cgi-bin/ogdraw.pl)分析繪制血滿草葉綠體基因組圖譜。將葉綠體基因組全序列提交Genbank獲得其登錄號(MZ 962405)。

1.4 密碼子偏好性和SRR分析

借助軟件 CodonW 1.4.2[26](http://mobyle. pasteur/fr/cgi-bin/portal.py?from=codonw)統(tǒng)計(jì)分析血滿草葉綠體基因組的密碼子偏好性 RSCU(Relative Synonymous Codon Usage);在網(wǎng)站(https://webblast. ipk-gatersleben. de/misa/index.php?action=1)對血滿草葉綠體基因組序列開展微衛(wèi)星掃描。

1.5 血滿草及其近緣種系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載忍冬科植物葉綠體全基因組序列,以人參(LG 149410)為外類群,將所有參試物種的葉綠體基因組序列選擇MAFFT進(jìn)行多序列比對,并將比對后的序列進(jìn)行手動(dòng)校正,使用PhyloSuite軟件[27]中的RAxML構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,Bootstrap值設(shè)為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 血滿草葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征

經(jīng)過測序,共獲得10 508 826 bp較高質(zhì)量的數(shù)據(jù)(Clean reads),3 146 741 892 bp較高質(zhì)量的堿基(Clean bases),其中Q 20為97.15%,Q 30為92.46%(表1)。將注釋得到的血滿草葉綠體基因組提交到GenBank,登錄號為MZ 962405。通過組裝及可視化作圖分析發(fā)現(xiàn),血滿草葉綠體全基因組是一個(gè)長度為158 610 bp的環(huán)狀DNA分子,包含典型的4個(gè)部分:87 345 bp的大單拷貝區(qū)域、18 937 bp的小單拷貝區(qū)域及26 164 bp的兩個(gè)反向重復(fù)序列(圖1)。對血滿草葉綠體基因組的堿基組成進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)GC含量占總堿基數(shù)的37.61%,其中IR區(qū)域中的GC含量(42.99%)高于LSC區(qū)域(36.27%)和SSC區(qū)域(31.89%)(表2)。

表1 血滿草基因組測序的數(shù)據(jù)評估統(tǒng)計(jì)

圖1 血滿草完整的葉綠體基因組圖譜

表2 血滿草葉綠體基因組信息

2.2 血滿草葉綠體基因組注釋基因歸類

從血滿草葉綠體基因組中共檢測到131個(gè)基因,包括86個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因、37個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因和8個(gè)核糖體RNA基因,其中有18個(gè)基因在IR區(qū)域呈現(xiàn)雙拷貝,分別是trnV-GAC、trnR-ACG、trnN-GUU、trnL-CAA、trnI-GAU、trnI-CAU、trnA-UGC、rrn23、rrn16、rrn5、rrn4.5、rps7、rps12、rpl2、rpl23、ndhB、ycf2、ycf1(表2,表3)。與光合作用有關(guān)的基因有45個(gè),包括5個(gè)光合系統(tǒng) Ⅰ 基因、15個(gè)光合系統(tǒng)Ⅱ基因、6個(gè)ATP合成酶基因、6個(gè)細(xì)胞色素復(fù)合物編碼基因、11個(gè)NADH脫氫酶基因、1個(gè)核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亞基基因和1個(gè)依賴ATP蛋白酶單元p基因;與轉(zhuǎn)錄和翻譯有關(guān)的基因包含了4個(gè)DNA依賴性RNA聚合酶、9個(gè)核糖體大亞基基因和12個(gè)核糖體小亞基基因,還有9個(gè)其他功能基因(表3)。在大多數(shù)被子植物葉綠體基因組中發(fā)現(xiàn)的3個(gè)基因(rps16、infA和ycf4),包括早期分支譜系的代表[28-30]均存在于血滿草葉綠體基因組中。

表3 血滿草葉綠體基因組注釋基因歸類

表4 基于核苷酸重復(fù)單位數(shù)血滿草葉綠體SSR的長度分布

2.3 重復(fù)序列分析

重復(fù)序列又稱為簡單序列重復(fù)(SSR)或微衛(wèi)星序列,在基因組中廣泛存在,通常包含1～6個(gè)核苷酸,一般用于分析群體遺傳學(xué)、進(jìn)化關(guān)系以及物種鑒別等[31]。通過對血滿草葉綠體基因組的SSR分析(表5),共發(fā)現(xiàn)6種類型的SSR,包括4種單核苷酸、2種二核苷酸,A/T單核苷酸重復(fù)是最多的一類,占總SSR的84.62%,AT/TA二核苷酸重復(fù)占總SSR的15.38%,A/T單核苷酸重復(fù)在其他物種中也較為多見[32],說明短的A/T單核苷酸重復(fù)是葉綠體基因組的普遍特征[33]。在血滿草葉綠體基因組中沒有發(fā)現(xiàn)三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸以及六核苷酸重復(fù)的SSR,這些結(jié)果表明,SSR參與了血滿草葉綠體基因組遺傳多樣性的鑒定。

表5 血滿草葉綠體基因組中含有內(nèi)含子的基因以及內(nèi)含子和外顯子長度

2.4 葉綠體基因組內(nèi)含子分析結(jié)果

17個(gè)基因包含1個(gè)或2個(gè)內(nèi)含子,其中11個(gè)位于蛋白質(zhì)編碼基因中,6個(gè)位于tRNA基因中(表5)。在血滿草中,蛋白質(zhì)編碼基因rpl2包含1個(gè)673 bp的單個(gè)內(nèi)含子,在包含內(nèi)含子的基因中,trnK-UUU具有最大的內(nèi)含子(2 519 bp),最小的內(nèi)含子位于trnG-UCC(58 bp)中,ycf3基因有2個(gè)717 bp和749 bp的內(nèi)含子。

2.5 葉綠體基因組密碼子偏好性分析

一般來說,不同生物體核苷酸序列的同義密碼子蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的使用頻率并不相同,但是密碼子之間的選擇相同[34]。同義密碼子的不平等使用,被稱為密碼子使用偏差,被視為自然選擇、突變壓力和遺傳漂變的復(fù)雜組合結(jié)果[35-36]。根據(jù)血滿草葉綠體基因組131個(gè)基因序列,得出血滿草葉綠體基因組的相對同義密碼子使用情況(RSCU)[37],如圖3。血滿草葉綠體基因組密碼子的使用反映了AT/GC偏倚。86個(gè)蛋白編碼基因包含80 364 bp,編碼26 788個(gè)密碼子。在這些密碼子中,2 842 個(gè)(10.61%)編碼亮氨酸,304個(gè)(1.13%)編碼半胱氨酸,分別是最普遍和最少的氨基酸。異亮氨酸(Ile)中AUU的密碼子使用率最高,亮氨酸(Leu)和異亮氨酸(Ile)的密碼子使用量也較高,起始密碼子ATG被鑒定了649次(2.42%),所有3種終止密碼子均存在,其中UAA是最常用的密碼子(UAA 51.16%,UGA 24.42%,UAG 24.42%)。

圖2 血滿草葉綠體基因組中含有內(nèi)含子的基因以及內(nèi)含子和外顯子長度

注:柱狀圖上方柱子的高度代表該氨基酸所有同義密碼子RSCU值的總和,柱狀圖下部分方塊代表每種氨基酸的所有同義密碼子。

2.6 最優(yōu)密碼子篩選

血滿草葉綠體基因組密碼子使用性檢測結(jié)果表明,RSCU值大于1的密碼子有30個(gè),其中以A/U堿基結(jié)尾的有29個(gè)(96.67%);RSCU值小于1的密碼子有32個(gè),其中以G/C堿基結(jié)尾的有29個(gè)(90.63%),說明在血滿草葉綠體基因組中的密碼子更傾向以A/U堿基結(jié)尾;色氨酸(Trp)和甲硫氨酸(Met)的RSCU值為1,無密碼子偏向性(表6)。對于血滿草密碼子使用偏好性的直觀展示見圖3。

表6 葉綠體基因組密碼子使用率

2.7 葉綠體全基因組系統(tǒng)發(fā)育分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載了14條忍冬科植物葉綠體全基因組序列,以人參(LG 149410)為外類群,利用15種葉綠體基因組序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。通過MEGA[38]軟件中的最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,程序設(shè)置1 000步長檢驗(yàn)。采用MrBayes v 3.2.6[39]完成貝葉斯推理(BI)分析(圖2)。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明,血滿草與接骨木(NC_051521和MT 457823)親緣關(guān)系密切,該完整的血滿草葉綠體基因組為進(jìn)一步研究血滿草及其相關(guān)屬的系統(tǒng)發(fā)育和物種的進(jìn)化以及資源的保護(hù)和利用提供了參考。

3 討論與結(jié)論

國內(nèi)外關(guān)于血滿草的研究報(bào)道較少,而關(guān)于血滿草葉綠體的研究更是鮮有報(bào)道。隨著新一代測序技術(shù)的發(fā)展,高通量測序技術(shù)的應(yīng)用越來越廣泛,植物葉綠體基因組序列為分類學(xué)、物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育提供了有價(jià)值的遺傳信息,并被廣泛用于評估物種遺傳多樣性和物種親緣關(guān)系。為了開發(fā)國產(chǎn)藥源,近年來對血滿草進(jìn)行了比較系統(tǒng)的研究。沈笑媛等[5]研究了血滿草的化學(xué)成分,對血滿草乙醇提取物的乙酸乙酯、正丁醇溶解部分進(jìn)行分離純化,得到4種化合物,分別為對羥基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid, 1)、齊墩果酸(oleanolic acid, 2)、熊果酸(ursolic acid, 3)、3,5-dimethoxy-4-hydroxy-1-O-β-D-glucopyranoside(4);唐柳怡等[6]對采自峨眉山的血滿草進(jìn)行了化學(xué)成分研究, 從氯仿部分及總浸膏的水懸浮液中分離得到5種化合物,分別是1-(3-羥基-4-甲氧基)乙烷-1′,2′-二醇(1-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)-1′,2′-ethane-diol,1),熊果酸(ursolic acid,2),1-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙烷-1′,2′-二醇(1-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-1′,2′-ethanediol,3),落葉松脂醇(lariciresinol,4),5,7,3′,4′-四羥基黃酮-3-O-吡喃鼠李糖(1→6)吡喃葡萄糖苷(5,7,3′,4′-tetramethoxyflavone-3-O-rhamnopyranosyl-(1→6)-glucopyranoside,5)。在提取血滿草中多糖成分時(shí)發(fā)現(xiàn),血滿草粗多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖構(gòu)成,而后又從血滿草葉片中分離純化出了一種均一性酸性多糖SPS-1,并制備了其硫酸化多糖SSPS-1[10-12]。對藥用價(jià)值的研究表明,血滿草的提取物具有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛作用,可以治療跌打損傷,骨折疼痛,小劑量可興奮血管中樞,使腎區(qū)血流量增加起利尿作用;王鳳瓊,周紅[14]研究表明,用血滿草熱浴局部治療新生兒硬腫癥效果較好。楊青松等[15]對血滿草的遺傳結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn),不同海拔血滿草居群之間遺傳分化不明顯,遠(yuǎn)低于異交生物平均水平。另外,譜系分析也表明,血滿草不同居群之間的系統(tǒng)關(guān)系不清晰,與地理分布和海拔分布的關(guān)系不明顯。無論是居群間還是居群內(nèi),供試血滿草的遺傳多樣性均較低,居群間的遺傳分化較小,可能還屬于同一個(gè)大的居群[15-16]。盡管目前對血滿草有所研究,但是針對血滿草基因組信息尤其是細(xì)胞器基因組信息十分欠缺。

圖4 基于15個(gè)葉綠體全基因組序列構(gòu)建的血滿草系統(tǒng)發(fā)育樹

在光合植物中,葉綠體基因組以單性遺傳的方式傳遞遺傳物質(zhì),一般來說,大多數(shù)被子植物是母系遺傳,而大多數(shù)裸子植物卻為父系遺傳[40-41]。血滿草植物屬于被子植物門,葉綠體基因組全長158 610 bp,呈現(xiàn)出與大多數(shù)被子植物,如海甘藍(lán)[42]、密花香薷[43]、暴馬丁香[44]等一樣的由一個(gè)SSC區(qū)、一個(gè)LSC區(qū)、兩個(gè)IR區(qū)構(gòu)成典型四分體結(jié)構(gòu),與多數(shù)已發(fā)表的忍冬科物種葉綠體基因組相似,如苦糖果、冠果忍冬、盤葉忍冬、葶子藨、錦帶花、雙盾木、忍冬和蝟實(shí)[45]。密碼子是體內(nèi)遺傳信息傳遞的基礎(chǔ)部分,密碼子的使用偏好性對于外源基因的表達(dá)具有重要意義,近年來,隨著基因組測序的不斷增加,關(guān)于密碼子偏好性分析的論文也越來越多。之前已有藜蘆屬[46]、大黃[47]、菜頭腎[48]、刺五加[49]等藥用植物的密碼子偏好性分析,相關(guān)研究為重要經(jīng)濟(jì)和藥用植物的基因工程改良奠定了基礎(chǔ)。

葉綠體基因組中的SSR基因通常是揭示種間和種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的有力工具[50]。目前應(yīng)用葉綠體基因組中的SSR研究的藥用植物有益智[51]、鴉膽子[52]、苦參[53]等。本研究結(jié)果表明,血滿草葉綠體基因組中的SSR包含高頻率的A或T重復(fù),與很多植物如魚腥草[54]等葉綠體基因組SSR序列的組成相似。本研究中14條忍冬科葉綠體基因組序列,以人參為外類群,構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中發(fā)現(xiàn),血滿草與接骨木親緣關(guān)系密切,接骨木藥用價(jià)值很高,具有疏通經(jīng)絡(luò),活血化瘀止痛等作用,臨床上也被廣泛應(yīng)用于風(fēng)濕痹痛、跌仆傷痛、水腫及小便不利等癥;據(jù)植物志[55]記載,血滿草為民間跌打損傷藥,能活血散瘀,亦可去風(fēng)濕,利尿。這兩種植物的藥用價(jià)值在一定程度說明該物種的藥用成分可能具有高度的相似性,這可能是由于化學(xué)物質(zhì)構(gòu)效關(guān)系引起的,因?yàn)橹参矬w內(nèi)的化學(xué)成分都是相關(guān)基因家族通過特定的生物合成途徑生成的,故相近化學(xué)成分和藥理作用的物種間可以根據(jù)需要互相增補(bǔ)和調(diào)換使用[56]。本研究可為忍冬科物種鑒定、分子進(jìn)化和遺傳系統(tǒng)發(fā)育研究提供重要的參考。