林葉邦，徐蕾，楊振德，3，韋善方

(1. 廣西大學林學院，廣西南寧 530000；2. 欽州市林業(yè)科學研究所，廣西欽州 535000；3. 廣西森林生態(tài)與保育重點實驗室，廣西南寧 530004；4. 巴馬瑤族自治縣自然資源局核桃產業(yè)發(fā)展中心，廣西巴馬 547500)

鐵核桃(Juglans sigillataDode)屬胡桃科(Juglandaceae)胡桃屬(Juglans)植物，別名漾濞核桃、泡核桃等，主要分布在我國西南地區(qū)，為我國原產樹種[1]。 鐵核桃為優(yōu)質的食用油原料，耐濕熱不耐干旱，抗寒力弱，品種類型繁多，堅果大小和形狀多種多樣，品質優(yōu)良，能夠滿足多種育種目標的需要[2]。 細香核桃(J.sigillatacv. ‘Xixiang’)、龍佳核桃(J.sigillatacv. ‘Niangqing’×J.sigillatacv. ‘Yangbidapao’)和娘青核桃(J.sigillatacv. ‘Niangqing’)均屬鐵核桃，具有較大的深加工價值，市場前景良好[3-5]。 云斑天牛(Batocera lineolata)屬鞘翅目(Coleoptera)天?？?Cerambycidae)昆蟲，主要寄主有核桃(Juglans regis)、桉樹(Eucalyptus robusta)、楊樹(Populus tomentosa)、桑樹(Morus alba)等，廣泛分布于我國廣東、廣西、湖南、貴州、四川等多個省份和自治區(qū)[6]，對我國林業(yè)生態(tài)環(huán)境建設的發(fā)展造成嚴重影響，目前已經被定為高度危險性林業(yè)有害生物[7]。 調查發(fā)現(xiàn)，廣西河池市多個縣的核桃林出現(xiàn)了云斑天牛，對核桃樹造成毀滅性傷害[8]。

昆蟲體內存在大量微生物[9]。 研究表明，腸道微生物在昆蟲的多種生命活動中都有參與，提高了昆蟲的生態(tài)適應和生存能力[10]。 昆蟲腸道微生物與宿主的相互作用主要體現(xiàn)于參與宿主食物消化、補給養(yǎng)分、提高宿主抗逆性以及影響宿主的壽命和繁殖能力[11-14]。 微生物在昆蟲克服寄主防御中發(fā)揮重要作用，如紅脂大小蠹(Dendroctonus valensLeConte)腸道細菌可以幫助昆蟲降解寄主油松(Pinus tabuliformisCarrière)的單萜[15]；玉米根蟲(Diabrotica virgifera virgiferaLeConte)腸道細菌可以促進其對玉米(Zea mays)和非寄主大豆(Glycine max)輪作的適應力[16]；桉樹枝癭姬小蜂(Leptocybe invasa)部分伴生細菌可降解桉樹次生代謝物質來幫助小蜂克服植物抗性完成定殖等[17]。 許多研究表明，不同寄主植物會影響昆蟲腸道微生物多樣性，比如:桉樹枝癭姬小蜂分別取食巨園桉DH 201-2 和窿緣桉后體內細菌群落豐富度和多樣性存在明顯差異[18]；桃小食心蟲(Carposina sasakiiMatsumura)在不同果園取食蘋果和梨后，寄主植物和生境能夠顯著影響該蟲的腸道菌群[19]。 為了探究不同寄主植物對云斑天牛腸道可培養(yǎng)細菌多樣性的影響，本研究以云斑天牛成蟲為材料，利用傳統(tǒng)微生物分離技術與16S rDNA 序列分析相結合的方法，對分別取食3種不同品種核桃后云斑天牛腸道可培養(yǎng)細菌進行分離鑒定，為進一步研究云斑天牛腸道微生物菌群與寄主防御機制的相互關系及為選育對云斑天牛具有優(yōu)良抗性的核桃優(yōu)良品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試細香核桃、龍佳核桃和娘青均為1 年生嫁接苗，從廣西河池市金城江區(qū)東江鎮(zhèn)木友村(108°4＇E，24°45＇N)各取10 株，種植于廣西大學林學院教學實踐基地(108°17＇E，22°51＇N)。 砧木來源于云南省大理白族自治州漾濞彝族自治縣漾江鎮(zhèn)(99°56＇E，25°47＇N)，細香接穗來源于云南省保山市昌寧縣柯街鎮(zhèn)扁瓦村(99°31＇E，24°50＇N)，龍佳接穗來源于云南省大理白族自治州漾濞彝族自治縣馬廠鄉(xiāng)馬廠村馬廠林場(99°59＇E，25°40＇N)，娘青接穗來源于云南省大理白族自治州漾濞彝族自治縣太平鄉(xiāng)太平村(99°52＇E，25°37＇N)。

試驗用云斑天牛成蟲采自廣西河池市巴馬瑤族自治縣核桃種植基地(107°15＇E，24°9＇N)。

1.2 試驗設計

參照胡建軍等[20]的人工接蟲方法。 將16 目鐵絲網(wǎng)裁剪成60 cm × 50 cm 大小，在核桃樹基部圍成一個高約40 cm 的籠子，然后將云斑天牛成蟲放入籠中用鐵絲將籠子封嚴，1 個籠中放1 只云斑天牛，取食7 天，每個品種做3 個重復。

1.3 云斑天牛腸道可培養(yǎng)細菌的分離與純化

試驗前饑餓處理48 h，排空體內食物殘渣。在超凈工作臺內將成蟲完全浸泡于75%乙醇中5 min 進行體表消毒，之后用濾紙吸干表面殘余液體，解剖出腸道移至玻璃勻漿器中加5 mL 無菌水，研磨充分后制成云斑天牛腸道勻漿液。

將制備好的腸道勻漿液按照10 倍梯度稀釋方法制成10-1～10-7不同濃度的菌液，通過平板劃線法在LB 培養(yǎng)基上進行分離純化，得到單一菌落后把帶菌平板送至北京睿博興科生物技術有限公司進行16S rDNA 測序。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

測序結果在NCBI 網(wǎng)站的GenBank 上進行BLAST 比對分析，將測序菌株鑒定至屬。 將各菌株相對應Blast 結果中一致性最高的菌株序列下載，利用MEGA 11.0 軟件中Neighbor-Joining(NJ)法(bootstrap 設置為1000)構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 不同品種核桃對云斑天牛成蟲腸道細菌組成的影響

利用LB 培養(yǎng)基，從取食3 種核桃的云斑天牛成蟲腸道中分離得到19 株可培養(yǎng)細菌。 NCBI數(shù)據(jù)庫比對結果(表1)表明，從取食龍佳核桃的云斑天牛成蟲腸道中分離出可培養(yǎng)細菌5 株，分屬于5 個屬，分別是拉烏爾菌屬(Raoultella)、腸球菌屬(Enterococcus)、沙雷氏菌屬(Serratia)、腸桿菌屬(Enterobacter)和克雷伯氏菌屬(Klebsiella)；從取食娘青核桃的云斑天牛成蟲腸道中分離出可培養(yǎng)細菌7 株，分屬于7 個屬，分別是拉烏爾菌屬、腸球菌屬、沙雷氏菌屬、克雷伯氏菌屬、假單胞菌屬(Pseudomonas)、乳球菌屬(Lactococcus)和泛菌屬(Pantoea)；從取食細香核桃的云斑天牛成蟲腸道中分離出可培養(yǎng)細菌7 株，分屬于7 個屬，分別是拉烏爾菌屬、腸球菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、Gibbsiella屬、泛菌屬和假單胞菌屬。

表1 云斑天牛成蟲腸道可培養(yǎng)細菌的分離鑒定

將3 組云斑天牛成蟲腸道分離得到的菌屬繪制成韋恩圖，結果(圖1)表明，這些菌屬中有3 個屬是共有的，取食娘青和細香核桃的云斑天牛分別分離出1 種特有菌屬。

圖1 取食不同核桃品種的云斑天牛成蟲腸道可培養(yǎng)細菌群落結構韋恩圖

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

對測序得到的云斑天牛成蟲腸道可培養(yǎng)細菌的16S rDNA 序列進行系統(tǒng)進化分析。 結果表明，LJ1-9 菌株屬于厚壁菌門，LJ1-12、LJ3-8、LJ3-13和LJ1-11 菌株屬于變形菌門(圖2)；NQ1-18 和NQ2-2 菌株屬于厚壁菌門，NQ1-2、NQ2-9、NQ2-7、NQ2-17 和NQ1-20 菌株屬于變形菌門(圖3)； XX2-13 菌株屬于厚壁菌門，XX1-9、XX1-7、XX3-4、XX1-13、XX3-17 和XX2-4 菌株屬于變形菌門(圖4)。 表明變形菌門是取食3 種核桃后云斑天牛成蟲腸道可培養(yǎng)細菌的優(yōu)勢菌群。

圖2 基于16S rDNA 序列取食龍佳核桃后云斑天牛成蟲腸道內可培養(yǎng)細菌系統(tǒng)發(fā)育進化樹

圖3 基于16S rDNA 序列取食娘青核桃后云斑天牛成蟲腸道內可培養(yǎng)細菌系統(tǒng)發(fā)育進化樹

圖4 基于16S rDNA 序列取食細香核桃后云斑天牛成蟲腸道內可培養(yǎng)細菌系統(tǒng)發(fā)育進化樹

3 討論與結論

本試驗結果表明，取食3 個品種核桃的云斑天牛成蟲腸道中可培養(yǎng)細菌在門分類水平上均為變形菌門和厚壁菌門，且變形菌門為優(yōu)勢菌門。眾多研究表明，大部分鱗翅目與鞘翅目昆蟲腸道中可培養(yǎng)細菌均屬于變形菌門和厚壁菌門，推測它們可能在昆蟲的生命活動中發(fā)揮重要作用。 在小菜蛾[Plutella xylostella( L.)][21]、仁扇舟蛾(Clostera restitura)[22]、松褐天牛(Monochamus alternatus)[23]、桑天牛(Apriona germari)[24]、新西蘭助翅鰓金龜(Costelytra zealandica)[25]等昆蟲腸道中的可培養(yǎng)細菌優(yōu)勢菌門也均為變形菌門，證明不同昆蟲之間的腸道可培養(yǎng)細菌種類存在一定的相似性。

食物為昆蟲體內微生物多樣性的重要影響因子之一[26]。 本研究發(fā)現(xiàn)取食不同核桃的云斑天牛成蟲腸道可培養(yǎng)細菌的組成存在明顯差異。 取食龍佳核桃的云斑天牛成蟲腸道中分離出的菌屬最少；取食娘青核桃和細香核桃的云斑天牛分離出來的菌屬數(shù)量相等，但在菌屬組成上存在差異。已有研究表明，一些植物的次生代謝物質，如丹寧[27]、黃酮[28]和一些酚類物質[29]等均會對細菌的生長發(fā)育產生影響，因此推測造成取食不同寄主植物的云斑天牛腸道可培養(yǎng)菌屬組成存在差異的原因是不同寄主植物的次生代謝物質的含量存在差別。

在本研究中，拉烏爾菌屬、腸球菌屬和克雷伯氏菌屬為3 個處理中的共有菌屬，這3 個屬可能對維持取食核桃的云斑天牛成蟲的生理代謝活動具有特殊影響。 相對于取食娘青核桃和細香核桃的云斑天牛來說，取食龍佳核桃的云斑天牛成蟲腸道未分離出假單胞菌屬和泛菌屬菌株。 有研究指出從感染潰瘍病的獼猴桃組織中分離出假單胞菌屬菌株[30，31]；從感染核桃細菌性黑斑病的組織中分離出泛菌屬菌株[32]，表明這兩個屬中存在植物致病菌，本次研究分離出來的假單胞菌屬和泛菌屬的菌株對取食寄主是否有致病力還需進一步研究。 取食細香核桃的云斑天牛成蟲腸道中分離出來特有菌屬Gibbsiella，目前國內對該菌的研究較少。 周會先等[33]對普氏蹄蝠(Hipposideros pratti)進行腸道細菌多樣性研究時發(fā)現(xiàn)了Gibbsiella屬細菌的存在，他提出普氏蹄蝠胃腸道中存在的大部分細菌屬于致病菌，且對人類與動物有害，因此推測Gibbsiella屬細菌也是屬于致病菌的一種；此外在取食桉樹的云斑天牛幼蟲腸道中也分離出該屬菌株[34]。 在國外研究中，從有樹皮裂紋等病害癥狀的栓皮櫟(Quercus roburL.)中分離出了Gibbsiella屬細菌，發(fā)現(xiàn)該菌與急性櫟樹衰退(AOD)有關[35]；伊朗也發(fā)現(xiàn)了一種新的櫟樹(Quercusspp.)病害，發(fā)現(xiàn)Gibbsiella菌是與櫟樹莖出血癥和潰瘍病有關的潛在致病菌[36]；伊朗西北部爆發(fā)的一種核桃新發(fā)疾病，經鑒定為Gibbsiella quercinecans引起的核桃細菌性潰瘍病[37]。 至于該菌是天牛腸道中的共生菌還是通過取食寄主后進入到體內的、在天牛腸道中起到什么作用、Gibbsiella屬細菌的具體功能等還需進一步研究。

綜上所述，不同核桃寄主植物能夠對云斑天牛成蟲腸道細菌的多樣性產生影響，這些細菌是否能夠對云斑天牛的生命活動產生影響及是否會對寄主植物造成二次傷害，還有待后續(xù)研究。