韓云，安嬌艷，王海蓮，王潤(rùn)豐，張燕，趙影星，劉賓，張華文，夏徽

(1. 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第四師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆可克達(dá)拉 835219；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100091；3. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/山東省特色作物工程實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100)

低溫冷害是影響冷敏感作物生長(zhǎng)發(fā)育、地域分布、產(chǎn)量和品質(zhì)的主要逆境因子，是世界性自然災(zāi)害，也是我國(guó)北方主要?dú)庀鬄?zāi)害之一[1，2]。 高粱起源于非洲，是喜溫作物，對(duì)溫度的變化表現(xiàn)敏感。 高粱萌發(fā)的最低土溫為8～10℃，出苗的最低溫度為10～12℃，但萌發(fā)溫度較低時(shí)會(huì)減緩高粱生長(zhǎng)，尤其是萌發(fā)期和幼苗期低溫影響嚴(yán)重。Upadhyaya 等[3]研究發(fā)現(xiàn)，12℃顯著影響高粱種子的萌發(fā)能力。 我國(guó)北方春季高粱播種后，經(jīng)常遭遇低溫天氣(倒春寒)，致使高粱發(fā)芽、出苗困難，嚴(yán)重時(shí)發(fā)生爛種(粉種)[4-6]，造成缺苗斷壟。種子萌發(fā)和幼苗階段低溫冷害已經(jīng)成為影響高粱產(chǎn)量的重要因素之一[7]。 此外，持續(xù)低溫脅迫還會(huì)使高粱幼苗更易感染絲黑穗病。 因此，研究外源物質(zhì)對(duì)低溫脅迫下高粱種子萌發(fā)的影響，對(duì)高粱生產(chǎn)具有重要意義。

利用外源物質(zhì)引發(fā)種子技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。 外源物質(zhì)引發(fā)下種子發(fā)芽率均不同程度提高。 因此，采取種子引發(fā)技術(shù)，促進(jìn)低溫環(huán)境中的作物種子萌發(fā)，對(duì)北方春播作物種子萌發(fā)、幼苗健康生長(zhǎng)及產(chǎn)量形成十分重要。 除梁佳等[8]利用隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)干旱脅迫下外源物質(zhì)的引發(fā)效應(yīng)外，大多數(shù)研究?jī)H停留在單一外源物質(zhì)的引發(fā)效應(yīng)上，鮮有比較多種外源物質(zhì)引發(fā)高粱種子耐低溫效應(yīng)的綜合評(píng)價(jià)報(bào)道。 為此，本試驗(yàn)以粒用高粱品種濟(jì)粱3 號(hào)為材料，研究低溫脅迫條件下外源物質(zhì)蕓苔素內(nèi)酯(epibrassinolide，EBR)、水楊酸(salicylic acid，SA)、赤霉素(gibberellin，GA3)、褪黑素(melatonin，MT)、硫酸錳(MnSO4)和硅酸鉀(K2SiO3)對(duì)高粱種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響，以期篩選出最佳的外源物質(zhì)及其濃度，同時(shí)為這6 種外源物質(zhì)促進(jìn)高粱抗低溫脅迫的生理機(jī)制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用干凈飽滿、大小一致、種子發(fā)芽率85%以上的濟(jì)粱3 號(hào)高粱種子。

赤霉素(純度≥96%)、褪黑素、硅酸鉀和蕓苔素內(nèi)脂均購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。水楊酸(分析純)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。 硫酸錳(分析純)，購(gòu)自天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

試驗(yàn)于2022 年4—7 月在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。 MnSO4、MT 和SA 等6種外源物質(zhì)均設(shè)計(jì)5 個(gè)濃度梯度，詳見(jiàn)表1。

表1 6 種外源物質(zhì)的5 個(gè)濃度梯度

挑選干凈飽滿的濟(jì)粱3 號(hào)種子，用5%次氯酸鈉消毒10 min，去離子水洗凈。 分別挑選25 份大小均勻一致種子各10 g，將其分別倒入25 個(gè)直徑9 cm 的培養(yǎng)皿中，分別添加不同濃度的硫酸錳、褪黑素等6 種物質(zhì)溶液1 mL，充分搖動(dòng)2 min，使溶液均勻地粘在種子表面，然后黑暗悶種2 h。 在鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿(直徑9 cm)中加蒸餾水5 mL，然后將處理好的種子均勻擺放其上。 每處理分別選擇30 粒種子，重復(fù)3 次。 第1 天將培養(yǎng)皿置于黑暗條件下培養(yǎng)，10℃下10 h，20℃下14 h。從第2 天開始將培養(yǎng)皿置于夜/晝溫度10℃/20℃(低溫脅迫)、光周期10 h 光/14 h 暗、白天光照12000 lx、相對(duì)濕度60%的人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)。常溫對(duì)照培養(yǎng)條件:光周期12 h/12 h、白天光照12000 lx、溫度25℃和相對(duì)濕度60%。 每天觀測(cè)培養(yǎng)皿中種子萌發(fā)生長(zhǎng)情況并及時(shí)加蒸餾水。

1.3 指標(biāo)測(cè)定及方法

1.3.1 發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù) 胚根長(zhǎng)至種子長(zhǎng)度且胚芽長(zhǎng)大于等于種子長(zhǎng)度的一半作為高粱種子的發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)。 從第3 天開始統(tǒng)計(jì)發(fā)芽種子數(shù)并計(jì)算種子發(fā)芽勢(shì)，第8 天計(jì)算發(fā)芽率。

發(fā)芽勢(shì)(%)＝第3 天發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100 ；

發(fā)芽率(%)＝第8 天發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100 。

萌發(fā)指數(shù)(PI)＝(1.00nd2+0.75nd4+0.50nd6+0.25nd8)/N。 式中，nd2、nd4、nd6、nd8分別為第2、4、6、8 天萌發(fā)種子數(shù)，N 為種子總數(shù)。

1.3.2 生物學(xué)指標(biāo) 第8 天，各處理每個(gè)培養(yǎng)皿隨機(jī)取10 株幼苗，用吸水紙擦干表面水分，切分出胚根與胚芽，用萬(wàn)分之一天平稱取胚芽和胚根鮮重，并測(cè)量根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用標(biāo)準(zhǔn)化處理即相對(duì)值(處理指標(biāo)值/對(duì)照指標(biāo)值)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以消除環(huán)境因子影響，并利用相對(duì)值評(píng)價(jià)6 種外源物質(zhì)對(duì)高粱種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的抗低溫效應(yīng)。

相對(duì)發(fā)芽率(RGR)、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)(RGP)和相對(duì)發(fā)芽指數(shù)(RGI)采用梁佳[8]、Amooaghaie[9]和Li[10]等的方法計(jì)算。

1.4 抗低溫脅迫效應(yīng)綜合評(píng)價(jià)

利用隸屬函數(shù)法建立綜合評(píng)價(jià)體系，分析高粱種子在萌發(fā)期及幼苗期抗低溫脅迫的能力。 有關(guān)隸屬函數(shù)及權(quán)重等的計(jì)算方法[4，8]如下:

式中，Yij為第i 個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)第j 個(gè)處理的隸屬值；Uij為i 個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)第j 個(gè)處理的測(cè)定值，Umax為該指標(biāo)中的最大值，Umin為該指標(biāo)中的最小值；為第i 個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的均值，n 為處理個(gè)數(shù)；Vi為第i個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)差系數(shù)；Wi為第i 個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，m 是評(píng)價(jià)指標(biāo)的個(gè)數(shù)；Dj為第j 個(gè)處理的綜合評(píng)價(jià)得分值。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010 整理并繪圖，采用SPSS 19 軟件進(jìn)行方差分析。 利用聚類分析就低溫脅迫條件下外源物質(zhì)對(duì)高粱種子引發(fā)的效應(yīng)進(jìn)行分類。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度外源物質(zhì)對(duì)低溫脅迫下高粱種子萌發(fā)的影響

圖1 ～圖3 表明，低溫脅迫下，6 種外源物質(zhì)間、不同濃度間及其交互作用均極顯著影響高粱種子的相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽指數(shù)(Sig.值小于0.01)。 高粱種子經(jīng)同一外源物質(zhì)處理后，隨其濃度增加，種子相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽指數(shù)均表現(xiàn)出先升后降趨勢(shì)。 其中EBR處理的種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均優(yōu)于其它處理，濃度為0.030 μmol·L-1時(shí)其相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)和相對(duì)發(fā)芽指數(shù)均達(dá)到最高值。這6 種外源物質(zhì)濃度過(guò)大或者過(guò)小均影響高粱種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)，因此，適宜濃度可有效引發(fā)高粱種子的萌發(fā)及生長(zhǎng)。

圖1 不同濃度外源物質(zhì)對(duì)低溫脅迫下高粱相對(duì)發(fā)芽率的影響

圖2 不同濃度外源物質(zhì)對(duì)低溫脅迫下高粱相對(duì)發(fā)芽勢(shì)的影響

圖3 不同濃度外源物質(zhì)對(duì)低溫脅迫下高粱相對(duì)發(fā)芽指數(shù)的影響

2.2 不同外源物質(zhì)對(duì)低溫脅迫下高粱幼苗生長(zhǎng)的影響

圖4 ～圖9 表明，不同外源物質(zhì)間、不同濃度間及其交互作用均極顯著影響低溫脅迫下高粱幼苗生長(zhǎng)(Sig.值小于0.01)。隨著外源物質(zhì)濃度增加，這6 種物質(zhì)引發(fā)的幼苗各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)均先增后降。圖4、圖6 中，GA3引發(fā)幼苗的相對(duì)芽長(zhǎng)、相對(duì)芽鮮重均高于其它處理，MT 處理次之，其中6.0 μmol·L-1GA3(G3)處理的相對(duì)芽長(zhǎng)、相對(duì)芽鮮重值均最大。然而GA3處理的相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)根鮮重、相對(duì)根干重均比其它外源物質(zhì)處理總體偏低。 用0.5 mmol·L-1MT(M5)處理種子，其幼苗相對(duì)根鮮重、相對(duì)根干重值均達(dá)到最大(圖7和圖9)，其次是1.0 mmol·L-1SA(S3)處理。 50 mmol·L-1硅酸鉀引發(fā)的種子其幼苗相對(duì)根長(zhǎng)最長(zhǎng)(圖5)。

圖4 不同濃度外源物質(zhì)對(duì)低溫脅迫下高粱幼苗相對(duì)芽長(zhǎng)的影響

圖5 不同濃度外源物質(zhì)對(duì)低溫脅迫下高粱幼苗相對(duì)根長(zhǎng)的影響

圖6 不同濃度外源物質(zhì)對(duì)低溫脅迫下高粱幼苗相對(duì)芽鮮重影響

圖7 不同濃度外源物質(zhì)對(duì)低溫脅迫下高粱幼苗相對(duì)根鮮重的影響

圖8 不同濃度外源物質(zhì)對(duì)低溫脅迫下高粱幼苗相對(duì)芽干重的影響

圖9 不同濃度外源物質(zhì)對(duì)低溫脅迫下高粱幼芽相對(duì)根干重的影響

2.3 不同外源物質(zhì)引發(fā)下高粱種子萌發(fā)期的抗低溫效應(yīng)分析

表2 中D 值代表外源物質(zhì)不同濃度下高粱種子萌發(fā)期抗低溫的綜合效應(yīng)，D 值越大其抗低溫脅迫的效應(yīng)就越強(qiáng)[11]。 由表2 可知，本試驗(yàn)中相對(duì)發(fā)芽勢(shì)的權(quán)重系數(shù)最大，達(dá)到0.3365，其次是相對(duì)根鮮重和相對(duì)芽長(zhǎng)的權(quán)重系數(shù)，三者之和達(dá)65.4%。濃度為0.5 mmol·L-1MT 處理的綜合得分最高，為0.7244。 各處理綜合得分高低順序如下:M3＞E3＞S3＞M4＞M2＞E4＞G3＞E2＞Mn2＞G4＞G2＞K3＞M1＞Mn3＞K2＞S4＞K4＞S2＞G1＞E1＞0＞Mn4＞K1＞Mn1＞S1。

2.4 不同濃度外源物質(zhì)緩解高粱低溫脅迫效應(yīng)的聚類分析

根據(jù)綜合得分D 值進(jìn)行聚類分析，當(dāng)歐氏距離為5 時(shí)，25 個(gè)不同濃度外源物質(zhì)引發(fā)處理可分為3 類(圖10)。 其中，第1 類D 值在0.4268 ～0.7244之間，為排名前8 的處理，有M3、E3、S3、M4、M2、E4、G3 和E2；0.2616≤D≤0.3695 為第2類，有Mn2、G4、G2、K3、M1、Mn3、K2 共7 個(gè)處理；0.1097≤D≤0.2358 為第3 類，有S4、K4、S2、G1、E1、0、Mn4、K1、Mn1、S1 共10 個(gè)處理。

圖10 25 個(gè)引發(fā)處理聚類分析譜圖

3 討論

3.1 外源物質(zhì)對(duì)低溫脅迫條件下高粱種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響

低溫脅迫對(duì)高粱種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)影響的指標(biāo)主要有發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、幼苗芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)及干物質(zhì)重等。 其中，發(fā)芽勢(shì)是反映種子萌發(fā)整齊度和萌發(fā)速度的主要指標(biāo)，發(fā)芽指數(shù)則可反映種子活力。 有研究表明低溫脅迫對(duì)種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)有較明顯的抑制作用[12，13]。 本研究表明，適宜濃度的EBR 處理能顯著增強(qiáng)低溫脅迫后的種子發(fā)芽勢(shì)，這與黃斌[14]、周偉江[15]等的結(jié)論相同。 說(shuō)明適宜濃度的EBR 處理可以加快低溫脅迫下的高粱種子出苗速度，提高出苗率，可為保全苗、穩(wěn)增產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，又可預(yù)防或減輕低溫對(duì)高粱種子和幼苗生長(zhǎng)的危害。 GA3處理的種子其相對(duì)芽長(zhǎng)、相對(duì)芽鮮重優(yōu)于其它外源物質(zhì)處理，但高粱幼苗生長(zhǎng)管理的目標(biāo)是培育壯苗，而不是高腳苗，因此GA3的濃度必須嚴(yán)格控制，以防造成高粱幼苗徒長(zhǎng)。 0.50 mmol·L-1MT 處理幼苗相對(duì)根鮮重及相對(duì)根干重均最大，其它物質(zhì)中1.0 mmol·L-1SA 處理的最高。 可見(jiàn)，不同外源物質(zhì)在低溫脅迫下其作用機(jī)制不一樣，因此可以進(jìn)一步研究利用不同性質(zhì)的外源物質(zhì)組配種子處理劑以抗低溫脅迫。

3.2 評(píng)價(jià)高粱種子萌發(fā)期抗低溫效應(yīng)的方法

本試驗(yàn)結(jié)果表明，高粱種子經(jīng)不同濃度供試外源物質(zhì)處理后，其萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)值差異較大。 為了防止用單個(gè)指標(biāo)評(píng)價(jià)某種外源物質(zhì)抗低溫脅迫能力的片面性[8]，本試驗(yàn)采用隸屬函數(shù)法的綜合得分值量化不同外源物質(zhì)及其濃度配比引發(fā)種子對(duì)低溫脅迫的效應(yīng)，這種綜合評(píng)價(jià)方法可避免因單參數(shù)評(píng)價(jià)引起的誤差。

3.3 外源物質(zhì)引發(fā)對(duì)高粱種子萌發(fā)期及幼苗抗低溫效應(yīng)的影響

本研究中，高粱種子相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)芽長(zhǎng)和相對(duì)根鮮重的權(quán)重系數(shù)之和達(dá)65.4%，說(shuō)明這3個(gè)指標(biāo)在本試驗(yàn)評(píng)價(jià)體系中占主導(dǎo)地位。 利用綜合得分D 值進(jìn)行聚類分析結(jié)果顯示，本試驗(yàn)25個(gè)處理可以分為3 類，其中第1 類處理的綜合分值為0.4268～0.7244，得分最高的3 個(gè)處理依次是M3(0.50 mmol·L-1MT)、E3(0.030 μmol·L-1EBR)和S3(1.0 mmol·L-1SA)，這3 個(gè)處理均能有效促進(jìn)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)，該結(jié)果與梁佳等[8]的研究結(jié)果類似，而第3 類處理的綜合分值為0.1097 ～0.2358，對(duì)提高種子萌發(fā)期的抗低溫脅迫效果不大。 本試驗(yàn)表明，EBR 處理種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)均優(yōu)于其它外源物質(zhì)處理，經(jīng)GA3引發(fā)的種子其芽長(zhǎng)及芽鮮重均優(yōu)于其它外源物質(zhì)處理，而MT 處理在促進(jìn)根系和幼芽方面均有促進(jìn)作用。一定濃度范圍內(nèi)SA、MnSO4和K2SiO3均可促進(jìn)高粱根系生長(zhǎng)。 根據(jù)北方高粱春播區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)際情況，本試驗(yàn)推薦的外源物質(zhì)處理為E3(0.030 μmol·L-1EBR)、M3(0.50 mmol·L-1MT)和S3(1.0 mmol·L-1SA)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，適宜濃度的外源物質(zhì)引發(fā)高粱種子可增強(qiáng)其萌發(fā)期及幼苗期的抗低溫脅迫能力，各處理綜合得分高低順序如下:M3 ＞E3 ＞S3＞M4＞M2＞E4＞G3＞E2＞Mn2＞G4＞G2＞K3＞M1＞Mn3＞K2＞S4＞K4＞S2＞G1＞E1＞0＞Mn4＞K1＞Mn1＞S1。 利用隸屬函數(shù)法建立的綜合評(píng)價(jià)體系，可量化并較為全面地評(píng)價(jià)低溫脅迫下供試外源物質(zhì)不同濃度引發(fā)種子萌發(fā)、生長(zhǎng)的抗低溫脅迫效應(yīng)。本試驗(yàn)中，0.030 μmol·L-1EBR 處理高粱種子的相對(duì)發(fā)芽勢(shì)和相對(duì)發(fā)芽指數(shù)最大，0.50 mmol·L-1MT、1.0 mmol·L-1SA 處理均能有效促進(jìn)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)，以0.50 mmol·L-1MT 處理引發(fā)種子后的效果最佳。