唐 靜，朱聞君，劉和平，蘇振佳，劉金鑫，舒少華*

· 藥材與資源?

茯苓細(xì)胞色素P450基因的克隆與序列分析

唐 靜1，朱聞君2，劉和平1，蘇振佳1，劉金鑫1，舒少華1*

1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070 2. 武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023

篩選與茯苓生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的細(xì)胞色素P450基因序列，進(jìn)一步豐富對(duì)茯苓生長(zhǎng)發(fā)育理解。通過(guò)分子克隆到1個(gè)茯苓細(xì)胞色素P450基因，并利用在線(xiàn)工具分析其序列，預(yù)測(cè)蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)域等分子特征；利用MEGA 5.0分別對(duì)氨基酸進(jìn)行多序列比對(duì)和進(jìn)化關(guān)系分析，并采用qRT-PCR方法檢測(cè)不同發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間6、8、10 d的相對(duì)表達(dá)量。從茯苓中克隆到的存在可變性剪切，2個(gè)選擇性剪切體和CDS區(qū)長(zhǎng)度分別為1590、1542 bp，分別編碼529、513個(gè)氨基酸。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)其均具有保守的P450結(jié)構(gòu)域，且具有信號(hào)肽和多個(gè)磷酸化修飾位點(diǎn)，屬于分泌型的不穩(wěn)定親水蛋白。氨基酸序列多重比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示PcCYP與擔(dān)子菌的CYP502距離最近，推測(cè)PcCYP和CYP502具有相似功能，即參與調(diào)控茯苓子實(shí)體的發(fā)育。定量PCR結(jié)果顯示，選擇性剪接變體的表達(dá)量較低，因此是基因的主要剪接體。與茯苓子實(shí)體的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，為進(jìn)一步研究在茯苓生長(zhǎng)發(fā)育、遺傳規(guī)律及育種等方面的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

茯苓；細(xì)胞色素P450；基因克隆；生物信息學(xué)分析；基因表達(dá)；生長(zhǎng)發(fā)育

細(xì)胞色素P450（CYP450）廣泛分布于生物體中，是一類(lèi)具有半胱氨酸-亞鐵血紅素結(jié)構(gòu)的多功能超基因家族[1]，主要參與到烷基的羥化、烯基的環(huán)氧化、烴基的氧化、氧化性脫氨、脫鹵和脫氫、氧化性的碳，碳鍵斷裂及一些還原反應(yīng)[2-4]。研究表明，在真菌界大約有2500多種CYPs被發(fā)現(xiàn)，主要參與多環(huán)芳烴、烷烴、甾醇類(lèi)化合物等初級(jí)、次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成過(guò)程以及農(nóng)藥降解等方面[5-8]。在許多真菌來(lái)源的藥物性分子的生物合成中，CYP扮演了重要的角色，如靈芝酸合成途徑中CYP5150L8催化羊毛甾醇轉(zhuǎn)化為3-羥基-羊毛甾-8,24-二烯-26-酸（HLDOA）[9]；梭鏈孢烷抗生素的生物合成過(guò)程中P450氧化酶HelB1、HelB2、HelB4、HelB3分別催化C-4β的甲基羧基化、C-16羥化、C-20甲基羧基化、C-6羥化和C-7羰基化[10]；蕈青霉素合成途徑中PaxP催化paspaline轉(zhuǎn)化為13-desoxypaxilline[11]；赤霉素合成途徑中P450-1催化貝殼杉烯酸轉(zhuǎn)化為GA14[12]；單端孢霉烯的合成過(guò)程中Tri4催化單端孢霉二烯經(jīng)由4步加氧反應(yīng)合成異單端孢霉烯三醇[13]；去甲綠膠霉素的生物合成中VidE、VidG、VidR共同作用使4-methyl-fecosterone發(fā)生demethoxyviridin反應(yīng)等[14]。除此之外，細(xì)胞色素P450在真菌子實(shí)體的形成過(guò)程中也具有調(diào)控作用，如通過(guò)基因敲除方法證實(shí)蘋(píng)果腐爛病菌的缺失可降低產(chǎn)孢量[15]；通過(guò)表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)10種強(qiáng)烈表達(dá)有利于牛樟芝L.子實(shí)體形成[16]；利用差異顯示方法證實(shí)與雙孢蘑菇(Large) Sing.子實(shí)體形成有關(guān)等[17]，但關(guān)于P450調(diào)控子實(shí)體形成機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。

茯苓(Schw.) Wolf為多孔菌科藥用真菌，是一種藥食同源的大宗藥材，其主要藥用活性成分為茯苓多糖和三萜類(lèi)化合物[18]，但關(guān)于其藥用成分合成機(jī)制的研究較少。另一方面，由于對(duì)茯苓子實(shí)體的形成缺乏系統(tǒng)的研究，導(dǎo)致其遺傳基礎(chǔ)研究相對(duì)薄弱。本實(shí)驗(yàn)基于前期構(gòu)建茯苓菌核和菌絲的轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的具有差異表達(dá)的CYP450超家族基因的全長(zhǎng)開(kāi)放讀碼框[19]，克隆獲取了PcCYP1以及選擇性剪切體PcCYP2的開(kāi)放讀碼框全長(zhǎng)序列，并就該基因的結(jié)構(gòu)特征和功能進(jìn)行初步分析，以期為進(jìn)一步深入研究基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 茯苓(Schw.) Wolf菌株GIM5.29購(gòu)買(mǎi)自廣東微生物所；大腸桿菌菌株DH5α購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 酶和生化試劑 PC82-2×A8 FastHiFi PCR MasterMix、Zero Blunt Quick Ligation Kit均購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；RNAiso Plus試劑購(gòu)自大連TaKaRa公司；RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒購(gòu)自Thermo Scientific公司；Gel Extraction Kit購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。PCR引物合成及序列測(cè)定由武漢擎科生物技術(shù)有限公司完成。其他化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

DHP350型恒溫培養(yǎng)箱（武漢瑞華有限公司），HNYC-1102CD型振蕩搖床（天津歐諾有限公司），DL-CJ-2N型超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾有限公司），電泳儀和水平電泳槽（北京六一生物科技有限公司），CFX Connect熒光定量PCR儀、MyCycler普通PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司），NanoDrop（美國(guó)Thermo Fisher公司），水浴鍋（武漢鑫科有限公司），滅菌鍋（上海三申有限公司），電子天平和pH計(jì)（美國(guó)奧豪斯公司），離心機(jī)（美國(guó)Bio-Rad公司），?80 ℃超低溫冰箱（中科美菱有限公司）。

2 方法

2.1 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

LB、PDA和PDB培養(yǎng)基配方參考《基因工程實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)（第2版）》。茯苓斜面菌株4 ℃保存，接種于PDA平板培養(yǎng)基上的茯苓菌株在28 ℃下培養(yǎng)，接種于PDB液體培養(yǎng)基中的在28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)。大腸桿菌DH5α接種于LB培養(yǎng)基在37 ℃培養(yǎng)。

2.2 RNA提取及cDNA合成

收集在PDA平板上培養(yǎng)7 d的茯苓菌絲，在液氮中速凍并充分研磨粉碎后使用TaKaRa公司的RNAiso Plus試劑提取RNA，提取方法參考其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。并用使用RevertAidTM第1鏈cDNA合成試劑盒合成第1鏈cDNA。獲得的cDNA測(cè)定濃度后?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 PcCYP基因的克隆

結(jié)合報(bào)道的茯苓基因組信息（https://www. ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/469660165? report= genbank）和本課題組轉(zhuǎn)錄本測(cè)序結(jié)果篩選出在茯苓菌絲和菌核不同生長(zhǎng)階段差異表達(dá)的基因，選擇其中一條基因，根據(jù)其CDS序列設(shè)計(jì)基因特異性擴(kuò)增引物PcCYP-F1和PcCYP-R1（表1），以cDNA為模板使用高保真酶進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL 2×A8 PCR MasterMix，1 μL PcCYP-F1（10 μmol/L），1 μL PcCYP-R1（10 μmol/L），1 μL cDNA，總體積50μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，對(duì)符合目的大小的條帶進(jìn)行切膠回收。回收產(chǎn)物與pZERO-Blunt平末端載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于含有50 μg/mL氨芐抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，在37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。挑選單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽(yáng)性菌株送于公司測(cè)序驗(yàn)證。

表1 引物序列

2.4 PcCYP基因的序列及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

按照表2中的登錄號(hào)在NCBI里下載不同真菌物種的CYP450s氨基酸序列與本研究克隆得到的PcCYPs氨基酸序列比對(duì)，采用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（neighbor-joining，NJ），bootstrap設(shè)置為1000次[20]。

表2 不同真菌細(xì)胞色素P450的功能信息及NCBI登錄號(hào)

2.5 PcCYP基因的基礎(chǔ)生物信息學(xué)分析

將所得的PcCYP基因序列和氨基酸序列同源性比對(duì)：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast; http:// www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html；PcCYP基因編碼蛋白的基本理化性質(zhì)利用ExPASy數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.htm）進(jìn)行分析；利用在線(xiàn)工具TMHMM Server 2.0（http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、SignalP 5.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、TargetP 2.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/ TargetP/）、NetPhos 3.1 Server（http://www.cbs. dtu.dk/services/NetPhos/）分別進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜區(qū)、信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位、磷酸化位點(diǎn)分析；利用CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/ wrpsb. cgi）進(jìn)行蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域的分析。

2.6 PcCYP基因不同剪切體的表達(dá)量分析

根據(jù)PcCYP基因克隆得到的2個(gè)不同剪切體（）分別設(shè)計(jì)熒光定量引物PcCYP1-F/PcCYP1-R、PcCYP2-F/PcCYP2-R（表1）。以his3-1為內(nèi)參基因[21]，利用qRT-PCR測(cè)定基因不同轉(zhuǎn)錄本在液體發(fā)酵培養(yǎng)6、8、10 d的菌絲體中的相對(duì)表達(dá)量。儀器使用CFX96實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國(guó)伯樂(lè)公司），qRT-PCR實(shí)驗(yàn)方法按照康為世紀(jì)公司RealSYBR Mixture的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，每個(gè)反應(yīng)3次重復(fù)，的相對(duì)表達(dá)量采用2???Ct法處理[22]。

3 結(jié)果與分析

3.1 茯苓PcCYP基因的克隆

以培養(yǎng)7 d的茯苓菌絲體為材料提取RNA，從電泳檢測(cè)結(jié)果（圖1）可知28 S條帶的亮度大約是18 S的2倍，表明RNA沒(méi)有降解，完整性較好，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 RNA凝膠電泳圖

Fig. 1 RNA quality detection by gel electrophoresis

根據(jù)從轉(zhuǎn)錄組和基因組信息中獲取的基因CDS序列設(shè)計(jì)特異性引物，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到1個(gè)1600 bp左右的特異性條帶，結(jié)果見(jiàn)圖2?；厥漳康漠a(chǎn)物，克隆到平末端載體后送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示基因的CDS有2種序列，其中較長(zhǎng)的1條序列長(zhǎng)度為1590 bp，編碼529個(gè)氨基酸，而另1條較短的序列長(zhǎng)度為1542 bp，編碼513個(gè)氨基酸，初步推測(cè)基因可能存在選擇性剪切。將該基因與由NCBI中茯苓基因組（https://mycocosm. jgi.doe. gov/cgi-bin/dispGene Model?db=Wolco1&id= 131022）進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)中共含有9個(gè)內(nèi)含子和11個(gè)外顯子，其中第9個(gè)外顯子中的48 bp可能存在選擇性剪切，當(dāng)該區(qū)域在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中被剪切，就會(huì)形成新的轉(zhuǎn)錄本即（圖3）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證是否存在選擇性剪切，在該區(qū)段的上下游設(shè)計(jì)特異性引物PcCYP-F2、PcCYP-R2（表1）進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物采用2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。在100 bp和150 bp附近有2條條帶，其中150 bp的基因片段亮度較弱，而100 bp的基因片段亮度較明亮，因此驗(yàn)證了選擇性剪切的存在。

圖2 PcCYP基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

圖3 PcCYP基因結(jié)構(gòu)示意圖

圖4 PcCYP基因選擇性剪切片段的2.5%瓊脂糖凝膠檢測(cè)

3.2 PcCYP系統(tǒng)發(fā)育分析

為了推測(cè)PcCYPs的家族分類(lèi)以及功能，本研究從真菌細(xì)胞色素P450數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了來(lái)自不同物種且功能明確的60條CYPs氨基酸序列，并利用Clustal、Mega軟件與PcCYP氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。結(jié)果如圖5所示，來(lái)源于不同物種的CYP51、CYP52、CYP55、CYP53、CYP503等分別聚為一支，PcCYP與灰擬鬼傘菌中編碼的CYP502比較相近，因此推測(cè)CYP可能屬于CYP502家族基因。

圖5 PcCYP蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析

3.3 PcCYP生物信息學(xué)分析

分別根據(jù)和CDS序列，翻譯得到相應(yīng)的2條氨基酸序列。使用ExPASY-ProtParam tool預(yù)測(cè)其蛋白基本理化性質(zhì)，結(jié)果如表3所示，PcCYP1和PcCYP2相對(duì)分子質(zhì)量分別為59 568.35和57 675.34，參考工具定義，當(dāng)不穩(wěn)定系數(shù)低于40時(shí)預(yù)測(cè)為穩(wěn)定蛋白，超過(guò)40為不穩(wěn)定蛋白，平均疏水性值為?2～2，負(fù)值表明該蛋白為親水性蛋白，正值表示為疏水性，因此PcCYP1和PcCYP2均為不穩(wěn)定親水蛋白。同時(shí)，利用在線(xiàn)工具ProtScale預(yù)測(cè)蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)上的親疏性，結(jié)果（圖6）表明大部分區(qū)域打分為負(fù)值，即表現(xiàn)為親水性，與表3的結(jié)果一致。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果表明第1～17氨基酸為信號(hào)肽（圖7）?？缒そY(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果（圖8）表明PcCYP1和PcCYP2均無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明PcCYP1和PcCYP2均存在于線(xiàn)粒體中。由于蛋白質(zhì)磷酸化修飾在調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄及改變蛋白質(zhì)的功能方面具有重要作用，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示PcCYP1和PcCYP2均存在多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中PcCYP1中包含蘇氨酸（T）位點(diǎn)23個(gè)、絲氨酸（S）位點(diǎn)22個(gè)、酪氨酸（Y）位點(diǎn)11個(gè)；而PcCYP2基因由于缺失48 bp，所以預(yù)測(cè)的磷酸化位點(diǎn)包括蘇氨酸（T）位點(diǎn)23個(gè)、絲氨酸（S）位點(diǎn)19個(gè)、酪氨酸（Y）位點(diǎn)10個(gè)（圖9）。保守結(jié)構(gòu)域分析如圖10所示，PcCYP1的第295～473位和PcCYP2的295～457位氨基酸與CYP450超家族蛋白保守相似，屬于CypX多保守域蛋白。此外，PcCYP1、PcCYP2均與pfam00067、PTZ00404具有部分相似位點(diǎn)，而由于選擇性剪切基酸序列還與環(huán)二肽合成的CYP450（TIGR04538）具有相似位點(diǎn)。因此結(jié)合以上結(jié)果推測(cè)PcCYP1和PcCYP2經(jīng)過(guò)不同的剪切方式翻譯成不同的酶可能參與到線(xiàn)粒體中不同的反應(yīng)途徑。

表3 PcCYP理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

Table 3 Predicted physicochemical properties of PcCYP

圖6 PcCYP氨基酸疏水性預(yù)測(cè)

圖7 PcCYP蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)

3.4 PcCYP1和PcCYP2的表達(dá)分析

分別針對(duì)和基因設(shè)計(jì)2對(duì)引物進(jìn)行熒光定量PCR，由于比轉(zhuǎn)錄本多1個(gè)48 bp的內(nèi)含子，因此，在此內(nèi)含子中設(shè)計(jì)PcCYP1R，定量結(jié)果代表轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量。在和轉(zhuǎn)錄本的公共外顯子區(qū)設(shè)計(jì)引物（PcCYP2F和PcCYP2R）的定量PCR結(jié)果代表2個(gè)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量之和，減去前面定量PCR的結(jié)果后，則為轉(zhuǎn)錄本真實(shí)的表達(dá)量。由圖11表明，在3個(gè)時(shí)間段的表達(dá)量無(wú)顯著性差異。在不同發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間下的表達(dá)量具有顯著差異，在培養(yǎng)10 d時(shí)表達(dá)量最高，而在培養(yǎng)8 d時(shí)表達(dá)量最低。與的表達(dá)量相比，在6、8 d時(shí)，與的表達(dá)量無(wú)顯著差異，但10 d時(shí)表達(dá)量顯著高于。

圖8 PcCYP蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

圖9 PcCYP磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

圖10 PcCYP蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

4 討論

細(xì)胞色素P450超家族基因廣泛存在于生物體內(nèi)，參與多種內(nèi)源、外源物質(zhì)的代謝途徑中。隨著真菌基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前有399種CYP基因家族在2500種真菌中發(fā)現(xiàn)[23]。真菌CYP450分為CYP52、53、54、64等4個(gè)集團(tuán)，各個(gè)集團(tuán)又包含許多家族。而CYP51、56、59、61、67等家族是不歸屬于以上任何集團(tuán)，其中CYP51和CYP61的進(jìn)化較為保守，功能研究較透徹，主要參與到麥角甾醇的代謝途徑中[24-25]。

圖11 PcCYP1、PcCYP2基因的表達(dá)量分析

本研究基于課題組前期篩選出的具有差異表達(dá)的基因，選擇其中1條基因進(jìn)行了深入研究。本研究在對(duì)茯苓轉(zhuǎn)錄本的克隆中首次得到了它的2個(gè)轉(zhuǎn)錄本：（第9個(gè)外顯子完整）和（缺失48 bp），編碼的蛋白質(zhì)大小分別為59 560和57 660。通過(guò)與60種功能明確的真菌P450氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析可知，PcCYPs與腐生菌灰蓋鬼傘菌的CYP502氨基酸序列相似度最大，進(jìn)化分析也屬于同一分枝，同屬于傘菌綱。研究表明CYP502蛋白主要參與到的子實(shí)體發(fā)育過(guò)程中，當(dāng)編碼CYP502蛋白的基因發(fā)生突變時(shí)，子實(shí)體的原基菌柄分化受到影響，菌柄細(xì)胞伸長(zhǎng)能力減弱，菌柄變得短小[26]。因此推測(cè)PcCYP可能在茯苓子實(shí)體的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有調(diào)節(jié)作用，但具體的功能需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。進(jìn)一步對(duì)PcCYPs的基本特性分析得出PcCYP1和PcCYP2均屬于P450超基因家族酶，且屬于分泌型的不穩(wěn)定的疏水蛋白。亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)PcCYP可能位于線(xiàn)粒體中，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)修飾位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)PcCYP具有多個(gè)磷酸化修飾位點(diǎn)。研究表明，真菌CYP450蛋白質(zhì)在其氨基酸序列的氨基端（N端）具有一段疏水性螺旋區(qū)域和一段富含脯氨酸的區(qū)域，這種特征能夠使蛋白很準(zhǔn)確地錨定在細(xì)胞器（膜）上[27]，另一方面，分泌型的疏水蛋白可以通過(guò)水溶狀態(tài)進(jìn)行親水/疏水兩性分子界面的自我組裝，從而在子實(shí)體的形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用[28]。蛋白質(zhì)磷酸化是在蛋白激酶催化作用下，供體分子磷酸基團(tuán)與蛋白質(zhì)側(cè)鏈中含有羥基的氨基酸發(fā)生酯化反應(yīng)的可逆過(guò)程，屬于翻譯后修飾加工過(guò)程[29]。蛋白磷酸化修飾可以改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、活性及其與其他分子相互作用的能力，是一種動(dòng)態(tài)的生物調(diào)節(jié)過(guò)程，在信號(hào)傳導(dǎo)、基因表達(dá)、細(xì)胞分裂等許多生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控中起著重要作用[30]。因此，結(jié)合PcCYP蛋白系統(tǒng)進(jìn)化和基本特性分析，本課題組可知PcCYPs有極大可能參與到茯苓子實(shí)體的形成過(guò)程中，且在對(duì)超表達(dá)菌株培養(yǎng)過(guò)程中，也偶然發(fā)現(xiàn)茯苓超表達(dá)菌株子實(shí)體的產(chǎn)生，但關(guān)于基因在茯苓子實(shí)體形成過(guò)程中的具體作用，這需要后期更深入的基因功能研究加以佐證。另一方面，的這些基本特性增加了其進(jìn)行外源表達(dá)的難度，特別是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，因?yàn)樵松锶狈Ψg后修飾系統(tǒng)，所以CYP450在大腸桿菌中不表達(dá)或表達(dá)量低且不具有活性，但可以通過(guò)優(yōu)化序列，變?cè)撁傅耐負(fù)浣Y(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)該蛋白在原核系統(tǒng)中的表達(dá)[31-32]。

前體mRNA的選擇性剪切是真核生物轉(zhuǎn)錄后重要的加工環(huán)節(jié)，通過(guò)對(duì)外顯子和內(nèi)含子的選擇性去除和保留，可以使一個(gè)基因產(chǎn)生多個(gè)成熟的mRNA，進(jìn)而翻譯成具有不同功能的蛋白質(zhì)，參與到不同的生物過(guò)程[33]。通過(guò)qRT-PCR分析基因2種轉(zhuǎn)錄本在不同培養(yǎng)時(shí)間的表達(dá)量可知，的表達(dá)量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)并沒(méi)有顯著變化，的表達(dá)量則是先降低再增加，但整體上的表達(dá)量是明顯高于，因此推測(cè)可能是主要的選擇性剪切體。選擇性剪切是在RNA水平上調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制至之一，一個(gè)基因可通過(guò)選擇性剪切產(chǎn)生多個(gè)轉(zhuǎn)錄本編碼不同結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)，它們分別在細(xì)胞或個(gè)體分化發(fā)育不同階段，在不同的組織, 有各自特異的表達(dá)和功能[34]。因此推測(cè)PcCYP1和PcCYP2可能與茯苓不同培養(yǎng)時(shí)期的組織特異性有關(guān)，至于PcCYP的可變剪接受到的調(diào)控機(jī)制以及它是否參與調(diào)控茯苓子實(shí)體的生長(zhǎng)發(fā)育，后期可以通過(guò)基因超表達(dá)和沉默等方法進(jìn)行深入的研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Cloning, characterization and expression of a novel cytochrome P450 genesin

TANG Jing1, ZHU Wen-jun2, LIU He-ping1, SU Zhen-jia1, LIU Jin-xin1, SHU Shao-hua1

1. College of Plant Science and Technology of Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China 2. School of Biological and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023, China

A cytochrome P450 gene sequence related to the growth and development ofos was screened and reported to further enrich the understanding of the growth and development of.In this study, a cytochorome P450 genewas cloned from, and some bioinformatics tools were used to predict the physical and chemical properties of the protein, as well as the molecular characteristics of the domain; MEGA 5.0 was used to perform multi-sequence alignment and phylogenetic analysis of amino acids. The gene expression levels at 6d, 8d, and 10d of fermentation were quantified by qRT-PCR.The results showed that two transcripts of,andwere founded fromfor the first time. They were 1590 bp and 1542 bp in length and encoded 529 and 513 amino acids, respectively. Sequence analysis revealed that they both had a conserved P450 domain, a signal peptide and multiple phosphorylation sites, which secreted unstable hydrophobins; multiple alignments of amino acid sequences and phylogenetic tree results showed that the PcCYP was similar to CYP502 of the basidiomycete; qPCR results showed that the expression ofis lower than that ofsuggesting thatwas the main transcript ofHydrophobin PcCYP is closely related to the growth and development of the fruit body of, which lays a foundation for further research on the biological functions ofin the growth and development, genetic rule and breeding of.

(Schw.) Wolf; CYP450; gene cloning; bioinformatics analysis; gene expression; growth and development

R286.12

A

0253 - 2670(2023)12 - 3962 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.12.022

2022-12-09

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81872948）；名貴中藥資源可持續(xù)利用能力建設(shè)項(xiàng)目（2060302-1907-05）

唐 靜（1995—），女，碩士研究生，主要從事茯苓生長(zhǎng)發(fā)育及次生代謝與調(diào)控方面的研究。E-mail: hzautj@163.com

通信作者：舒少華（1979—），男，副教授，主要從事藥用植物栽培及次生代謝產(chǎn)物代謝與調(diào)控等方面的研究。E-mail: shushaohua@mail.hzau.edu.cn

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]