尹貽慧，張 凱，陳 倩，焦鳴杰，陳冬玲，張 佳，李 飛*

聯(lián)合體內(nèi)外多維化學(xué)物質(zhì)組和分子對接策略的炮附子抗炎藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究

尹貽慧1，張 凱2*，陳 倩1，焦鳴杰1，陳冬玲1，張 佳1，李 飛1*

1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488

挖掘炮附子潛在的抗炎藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLC-MS）鑒別炮附子的體內(nèi)外多維化學(xué)物質(zhì)組；通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)、拓?fù)鋵W(xué)分析以及相關(guān)文獻(xiàn)篩選疾病靶點并結(jié)合分子對接技術(shù)篩選與目標(biāo)蛋白結(jié)合良好的化合物。鑒定了炮附子中53個化學(xué)成分、37個入血成分；確定Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloprotein 9，MMP9）受體、纖溶酶原（plasminogen，PLG）受體為關(guān)鍵靶蛋白，發(fā)現(xiàn)卡拉可林、宋果靈、海替生、易混翠雀花堿、黃草烏堿丁、繡線菊堿C、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、三小葉翠雀堿E、裸翠雀亭等21個化合物為炮附子潛在的抗炎藥效物質(zhì)。所建立的方法充分考慮中藥飲片化學(xué)成分的復(fù)雜性，從多個層次逐步推進(jìn)，方便快捷地篩選出炮附子潛在的抗炎藥效物質(zhì)，可為中藥藥效物質(zhì)篩選提供借鑒。

炮附子；化學(xué)物質(zhì)組；分子對接；抗炎；藥效物質(zhì)基礎(chǔ)；卡拉可林；黃草烏堿??；三小葉翠雀堿E

炮附子是東漢時期醫(yī)圣張仲景通過干熱法加工附子制備的炮制品，在《傷寒雜病論》的12個經(jīng)方中均有應(yīng)用[1]，具有治療“風(fēng)濕相搏，骨節(jié)煩疼”的抗炎藥效。根據(jù)本課題組前期研究[2]，這種與《中國藥典》制法相異的特色炮制方法，能有效避免附子水處理法造成的成分流失。且藥理實驗研究表明，干熱法制備的附子具有更顯著的抗炎藥效[3]。目前經(jīng)典理論認(rèn)為，附子的抗炎藥效物質(zhì)為飲片中的雙酯型生物堿烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿，及苯甲酰烏頭堿、苯甲酰中烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿等單酯型生物堿[4]。然而隨著中藥藥物化學(xué)學(xué)科的不斷發(fā)展及提取分離、分析鑒定手段的進(jìn)步，截至目前共發(fā)現(xiàn)了100多個附子的化學(xué)成分。近年有研究報道一些附子生物堿如附子靈、宋果靈同樣具有抗炎作用[5-6]，提示可能還有抗炎藥效物質(zhì)尚未得到發(fā)掘，僅以經(jīng)典成分進(jìn)行藥效研究存在一定的局限性。中藥成分復(fù)雜，治療疾病具有多成分相互協(xié)調(diào)的作用特點，并形成作用機(jī)制復(fù)雜的系統(tǒng)。因此挖掘更多藥效物質(zhì)，建立多活性成分研究體系更符合中藥的治療特征。

體內(nèi)外多維化學(xué)物質(zhì)組關(guān)聯(lián)分析充分考慮到中藥分離單體成分的困難，以及中藥進(jìn)入體內(nèi)的原型成分和代謝產(chǎn)物濃度低導(dǎo)致的識別困難，建立了基于超高效液相色譜-質(zhì)譜靶向數(shù)據(jù)分析方法，用于中藥體外到體內(nèi)化學(xué)物質(zhì)組的快速定性分析。以體外研究結(jié)果為參考，體內(nèi)研究結(jié)果為指導(dǎo)，逐層遞進(jìn)分析，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出作用于疾病靶點的成分，預(yù)測關(guān)鍵靶蛋白[7]。分子對接是利用計算機(jī)模擬并預(yù)測藥物成分與靶蛋白的結(jié)合模式，從而篩選出活性較高的化合物。其操作簡單、方便快捷，被廣泛應(yīng)用于篩選中藥的活性成分和藥效物質(zhì)的研究[8]。

本研究聯(lián)合體內(nèi)、外多維化學(xué)組與分子對接策略探討炮附子抗炎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。采用超高效液相色譜-離子阱-靜電場軌道阱質(zhì)譜（UPLC-LTQ- Orbitrap/MS）鑒別炮附子的體內(nèi)、外化學(xué)物質(zhì)組，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合文獻(xiàn)驗證篩選關(guān)鍵靶蛋白，通過分子對接初步篩選炮附子潛在的抗炎藥效物質(zhì)。研究立足于中藥化學(xué)成分的整體性及對機(jī)體的整體調(diào)控作用，有層次性和導(dǎo)向性的篩選炮附子抗炎的藥效物質(zhì)，快速地發(fā)掘藥效成分，提高篩選效率。

1 材料

1.1 儀器、數(shù)據(jù)庫與軟件

Thermo Ultimate 3000超高效液相色譜、Thermo LTQ-Orbitrap質(zhì)譜儀（美國Thermo Scientific公司）；HC-3518離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；BT 125D Sartorius電子天平（德國Sartorius公司）；SB25-12 DTD超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；Chemspider（http://www.chemspider.com）；Swiss Target Prediction（http://swisstargetprediction.ch/）；Genecards（http://www.genecards.org/）；GeneMANIA（https:// genemania.org/）；STRING（https://String db.org/）；Protein Data Bank（https://www.rcsb.org/）；Xcalibur 4.2化學(xué)工作站；Cytoscape 3.7.2；ChemDraw Professional 15.0；AutoDock Tools-1.5.6；ChemBio3D Ultra 14.0；AutoDock Vina；AutoDock Tools-1.5.6。

1.2 試藥與試劑

生附片（批號190601）購自四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)石晉麗教授鑒定為毛茛科植物烏頭Debx.子根的加工品；炮附片為北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥炮制系實驗室在前期對炮附片炮制工藝及質(zhì)量控制研究[9-11]的基礎(chǔ)上制備，其質(zhì)量符合《中國藥典》2020年版標(biāo)準(zhǔn)；LC-MS級乙腈（批號194036）、甲酸（批號190284）、甲醇（批號205068）均購自美國Thermo-Fisher公司；水為屈臣蒸餾水；其余試劑為色譜純。

1.3 動物

健康雄性SPF級小鼠20只，體質(zhì)量（20±2）g，由斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供，許可證號SCXK（京）2019-0010。動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)良鄉(xiāng)校區(qū)動物實驗中心，溫度（23±2）℃，濕度（35±5）%。所有實驗程序均按照國家法律和地方指南進(jìn)行。該動物實驗獲得了北京中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會的批準(zhǔn)（BUCM-4-2020092903-3117）。

2 方法

2.1 基于UPLC-LTQ-Orbitrap/MS的炮附子體外-體內(nèi)化學(xué)物質(zhì)組的分析

2.1.1 炮附子體外化學(xué)物質(zhì)組分析樣品的制備

（1）炮附子供試品的制備：將河砂置熱鍋內(nèi)，用武火加熱，至滑利容易翻動時，投入凈制并大小分檔的生附片，不斷翻炒，至鼓起，內(nèi)外皆黃時，取出，篩去河砂，放涼。

（2）炮附子供試品溶液的制備：取炮附子飲片5 g，加10倍量水，浸泡30 min，大火煮沸后保持微沸30 min，傾出第1次煎煮液，4層紗布濾過；藥渣再加8倍量水，大火煮沸后保持微沸30 min，傾出第2次煎煮液，4層紗布濾過，合并2次煎液，減壓濃縮至0.1 g/mL，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 炮附子體內(nèi)化學(xué)物質(zhì)組分析樣品的制備

（1）動物分組及給藥：實驗之前進(jìn)行3 d適應(yīng)性喂養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食。小鼠隨機(jī)分為2組，每組各10只，給藥組ig給予劑量為5 g/(kg·d)炮附子水煎液，空白組ig給予劑量為33 mL/(kg·d)蒸餾水，分別給藥7 d。

（2）血清樣本的采集和處理：末次ig給藥前，小鼠禁食不禁水12 h，于ig后1 h，兩組小鼠分別從眼眶靜脈叢取血，置于離心管中，靜置30 min，在15 000 r/min離心15 min后分離血清，再以15 000 r/min離心10 min，吸取上清液，將同一組別的血清等量混合，以消除個體差異。分別取2組血清400 μL，各加入1200 μL乙腈。冰水浴超聲處理10 min，渦旋混勻1 min，將其在12 000 r/min、4 ℃離心15 min，移取上清液，氮氣吹干，加入100 μL 70%甲醇水復(fù)溶，并在12 000 r/min、4 ℃離心15 min。移取上清液用于UPLC-LTQ-Orbitrap/MS進(jìn)樣分析。

2.1.3 分析條件 色譜條件：Waters Acquity UPLC BEH-C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～7 min，4%～15% B；7～24 min，15%～30% B；24～30 min，30%～33% B；30～40 min，33%～60% B；40～50 min，60%～100% B；50～52 min，100% B；52～53 min，100%～4% B；53～57 min，4% B；體積流量為0.2 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL；柱溫為30 ℃。

質(zhì)譜條件：HESI離子源，正離子模式掃描，質(zhì)量掃描范圍為/50～2000；離子源溫度為350 ℃，電離源電壓、毛細(xì)管電壓、管透鏡電壓分別為4 kV、35 V和110 V；輔助氣體積流量為20 arb，鞘氣體積流量為40 arb，二者均為氮氣；一級質(zhì)譜采用傅里葉變換高分辨全掃方式，數(shù)據(jù)掃描分辨率為30 000；二、三級質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴性掃描方式獲?。贿\(yùn)用CID碎解方式。

2.1.4 數(shù)據(jù)分析 根據(jù)質(zhì)譜在正離子模式下掃描提供化合物的精確相對分子質(zhì)量、準(zhǔn)分子離子、多級離子碎片信息、保留時間并結(jié)合文獻(xiàn)報道鑒定炮附子體外原型化學(xué)物質(zhì)組；以體外化學(xué)物質(zhì)組為指導(dǎo)，通過對比空白血清，排除內(nèi)源性基質(zhì)的干擾，闡明體內(nèi)化學(xué)物質(zhì)組。

2.2 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的炮附子抗炎靶蛋白的篩選

2.2.1 獲取成分靶點與疾病靶點 獲取入血成分的“Canonical SMILES”或化學(xué)結(jié)構(gòu)式，在Swiss Target Prediction網(wǎng)站上，選擇物種為“Homo sapiens”，進(jìn)行靶點的預(yù)測，構(gòu)建成分靶點數(shù)據(jù)庫；登陸Genecards，搜索“inflammation”的靶點。選取score＞8的疾病靶點，去重后構(gòu)建疾病靶點數(shù)據(jù)庫。

2.2.2 直接靶點、間接靶點的獲取與蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 取成分靶點與疾病靶點的交集，得到直接靶點，將直接靶點導(dǎo)入GeneMANIA數(shù)據(jù)庫中，獲取間接作用靶點；將直接靶點和間接靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中，獲得作用關(guān)系結(jié)果文件，將文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化分析，利用“Network Analyer”功能對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析。以“Degree”值作為參考，結(jié)合文獻(xiàn)報道，選取靶點作為下一步進(jìn)行分子對接的靶蛋白。

2.3 基于分子對接策略的炮附子抗炎藥效物質(zhì)的篩選

2.3.1 配體小分子的準(zhǔn)備 在Pubchem網(wǎng)站中查找入血成分即配體小分子的2D結(jié)構(gòu)并用ChemDraw Professional 15.0繪制，保存為cdx格式；在ChemBio3D Ultra 14.0軟件里打開后，依次選擇“Calculations”-“MM2”-“Minimize Energy”將配體能量最小化，結(jié)果保存為mol2格式；在AutoDock Tools-1.5.6軟件里打開mol2文件，進(jìn)行自動加氫及電荷，將小分子文件轉(zhuǎn)換成pdbqt格式。

2.3.2 受體靶蛋白的準(zhǔn)備 Protein Data Bank網(wǎng)站中，根據(jù)PDB ID下載受體靶蛋白的pdb格式文件；在AutoDock Tools-1.5.6軟件里進(jìn)行極性氫原子添加以及非極性氫的合并，以pdbqt格式保存。

2.3.3 對接過程及結(jié)果評價 在AutoDock Tools-1.5.6軟件設(shè)置GridBox的大小，使其完全包裹受體靶蛋白的空腔，以便在對接過程中較全面地搜尋結(jié)合位點，將設(shè)置的參數(shù)文件保存為gpf格式。采用AutoDock Vina對配體和受體進(jìn)行半柔性分子對接。通過查閱文獻(xiàn)報道[12-14]，選取具有顯著抗炎療效的吲哚美辛、醋酸地塞米松及阿司匹林作為本實驗的陽性藥，將陽性藥物分別與抗炎靶蛋白進(jìn)行分子對接，以陽性藥物對接結(jié)果的結(jié)合自由能（binding energy，?）、估計抑制常數(shù)（inhibit constant，i）[15]的平均值為參考衡量藥物小分子與受體蛋白的結(jié)合能力，炮附子化學(xué)成分與靶蛋白對接結(jié)果的?和i越小，表明結(jié)合越穩(wěn)定。

3 結(jié)果

3.1 炮附子體內(nèi)外化學(xué)物質(zhì)組表征

基于“2.1.3”項的條件，在正離子模式下得到炮附子水煎液及入血成分的總離子流圖見圖1。鑒別出炮附子水煎液中53個化學(xué)成分及37個入血成分，其中包含6個去甲基化代謝物。通過查閱文獻(xiàn)報道[16]，這些代謝物的原型成分可能是異塔拉烏頭定、尼奧靈、烏頭堿、塔拉地薩敏、14-乙酰塔拉胺等，具體數(shù)據(jù)見表1。

3.2 炮附子抗炎靶蛋白的確定

3.2.1 成分作用靶點與疾病靶點的獲取 根據(jù)獲取入血成分“Canonical SMILES”格式的分子結(jié)構(gòu)及化學(xué)結(jié)構(gòu)式，在Swiss Target Prediction網(wǎng)站上，預(yù)測294個可能的成分靶點；共獲得去重后的疾病靶點142個。

3.2.2 直接靶點、間接靶點的獲取與抗炎靶蛋白的選擇 共得到12個直接靶點與20個間接靶點；基于PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與拓?fù)鋵W(xué)分析，并結(jié)合文獻(xiàn)報道[17-19]，初步選取Degree值排名前3的Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloprotein 9，MMP9）、纖溶酶原（plasminogen，PLG）為抗炎的靶蛋白，PPI網(wǎng)絡(luò)的可視化效果圖見圖2。

3.3 分子對接結(jié)果

3.3.1 炮附子體內(nèi)化學(xué)物質(zhì)組與3個靶蛋白的對接結(jié)果 在炮附子體內(nèi)化學(xué)物質(zhì)組與3個靶蛋白的對接結(jié)果（表2）中，共篩選出21個潛在的抗炎藥效物質(zhì)。其中可以同時與3個靶點穩(wěn)定結(jié)合的有11個，為卡拉可林、宋果靈、海替生、易混翠雀花堿、黃草烏堿丁、繡線菊堿C、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、三小葉翠雀堿E、裸翠雀亭；能同時與2個靶點穩(wěn)定結(jié)合的有5個，為森布星A、次烏頭原堿、附子靈、14-乙酰尼奧靈、森布星B；能與1個靶點穩(wěn)定結(jié)合的有5個，為新烏頭原堿、異塔拉烏頭定、烏頭原堿、尼奧靈、塔拉地薩敏。與TLR4、MMP9、PLG結(jié)合力最強(qiáng)的分別為異塔拉烏頭定、繡線菊堿C、三小葉翠雀堿E。

圖1 炮附子水煎液(A)、空白組小鼠血清樣品 (B)及給藥組小鼠血清樣品 (C) 總離子流圖

表1 基于UPLC-LTQ-Orbitrap/MS的炮附子體內(nèi)、外化學(xué)物質(zhì)組成分分析

P為炮附片水煎液，S為含藥血清中的原型成分，S*為含藥血清中的代謝產(chǎn)物

P is decoction of, S is the prototype component in medicated serum, S* is the metabolite in medicated serum,

表2 炮附子體內(nèi)化學(xué)物質(zhì)組與靶蛋白對接結(jié)果

“＋”為陽性結(jié)果，“?”為陰性結(jié)果

“＋”is positive result, “?” is negative result

3.3.2 潛在藥效物質(zhì)與3個靶蛋白氨基酸殘基的作用情況 炮附子中篩選出的21種潛在的抗炎藥效物質(zhì)與3個靶蛋白氨基酸殘基的作用情況見表3。為直觀地展示化合物與靶蛋白的結(jié)合模式以及化合物與周圍氨基酸殘基的相互作用，以異塔拉烏頭定與TLR4、繡線菊堿C與MMP9、三小葉翠雀堿E 與PLG的結(jié)合為例，做出化合物與靶蛋白對接的3D模型與二維平面圖，如圖3所示。異塔拉烏頭定穩(wěn)定地結(jié)合在由Leu212、Phe104、Glu111、Ala107、Arg106、Glu266、His159、Asn185、Lys186、Ser184、Asn114組成的疏水口袋中，其5號氧原子與Thr115、Ser103、Asn265形成3個氫鍵；MMP9的活性空腔主要由Val216、Gly215、Gly217、Tyr248、Gly186、Asp185組成，繡線菊堿C很好地占據(jù)空腔，其1號氧原子與Tyr218形成1個氫鍵；三小葉翠雀堿E的2號氧原子與Thr66形成氫鍵，其環(huán)狀結(jié)構(gòu)與Gly19、Lys20、Lys21、Cys22、Ser24存在疏水作用。

表3 潛在的藥效物質(zhì)與靶蛋白氨基酸殘基的相互作用

續(xù)表3

“/”表述為無相互作用

“/” indicates non-interaction

4 討論

4.1 體內(nèi)、外化學(xué)物質(zhì)組的建立

中藥經(jīng)歷炮制加工過程的化學(xué)成分變化，最終以飲片的形式通過體內(nèi)傳輸發(fā)揮臨床療效，其功效是藥效物質(zhì)基礎(chǔ)經(jīng)過體外變化和體內(nèi)吸收、代謝后生物效應(yīng)的綜合體現(xiàn)。因此，明確飲片化學(xué)物質(zhì)組“體外-體內(nèi)”的傳遞-轉(zhuǎn)化過程，能為藥效物質(zhì)的篩選提供清晰的路徑。本研究基于體內(nèi)、外多維化學(xué)物質(zhì)組首先對炮附子水煎液中的化學(xué)成分進(jìn)行表征，鑒定得到53個化合物，繼而對入血成分進(jìn)行分析，鑒定出37個化合物，其中6個代謝物主要是由C19-二萜生物堿成分去甲基化轉(zhuǎn)化，這些原型成分可能是潛在的活性成分。文獻(xiàn)研究表明，C19-二萜生物堿具有消炎、止痛等多種藥理活性[20]，其中雙酯型C19-二萜生物堿可能是通過白細(xì)胞趨化作用，影響前列腺素的代謝，最終表現(xiàn)出抗炎作用[4]。本研究系統(tǒng)地闡釋了炮附子“體外化學(xué)物質(zhì)組-體內(nèi)化學(xué)物質(zhì)組”的傳遞，明確了炮附子化學(xué)成分經(jīng)口服由體外傳遞到體內(nèi)可能發(fā)揮藥效的成分，便于炮附子抗炎藥效物質(zhì)的進(jìn)一步篩選。

4.2 炎癥靶蛋白的選擇與確定

中藥治療疾病，可能是一種成分作用于多個靶蛋白，也可能是多種成分作用于同一個靶蛋白[21]，因此科學(xué)合理地選擇具有代表性的靶蛋白，對篩選中藥潛在的活性成分具有重要意義。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過建立并分析成分-靶點-疾病之間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，可以預(yù)測疾病發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵靶蛋白。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并對其進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析最終根據(jù)“Degree”值選擇并確定了抗炎的靶蛋白TLR4、MMP9、PLG。研究表明，TLR作為介導(dǎo)天然免疫的重要模式識別受體，在炎癥的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[22]；TLR4作為關(guān)鍵上游受體，廣泛存在于多種細(xì)胞表面，在脂多糖介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中極其重要，能選擇性的識別細(xì)菌脂多糖，激活TLR4信號通路，通過釋放促炎因子、趨化因子誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[23]，控制著炎癥信號的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)和核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的活化入核，導(dǎo)致眾多促炎因子白細(xì)胞介素-17（interleukin 17，IL-17）、IL-1β和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）的釋放增加，形成炎癥反應(yīng)[17]。MMP9是明膠酶家族主要成員，在免疫炎癥、細(xì)胞凋亡等過程中發(fā)揮作用。正常情況下MMP9表達(dá)水平極低；在炎癥狀態(tài)下，炎癥因子、血管細(xì)胞粘附分子會誘導(dǎo)MMP9的表達(dá)，促進(jìn)免疫炎癥細(xì)胞的遷移并上調(diào)MMP9活性，與機(jī)體的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[18]。PLG是一種糖蛋白，纖溶酶原促進(jìn)纖維蛋白溶解并增強(qiáng)炎癥反應(yīng)[24]，纖溶酶原激活劑和纖溶酶原激活劑抑制劑影響PLG的水平變化，抑制纖溶酶原激活物因子表達(dá)可降低炎性因子水平，減輕炎癥反應(yīng)[19]。以上文獻(xiàn)研究進(jìn)一步佐證了本研究選取靶蛋白的合理性。

4.3 基于分子對接策略進(jìn)一步篩選炮附子潛在的抗炎藥效物質(zhì)

中藥化學(xué)成分復(fù)雜，使中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究面臨艱難與挑戰(zhàn)，是長期以來制約中藥現(xiàn)代化發(fā)展的頸瓶[25]。目前對于中藥藥效物質(zhì)的研究主要是利用中藥指紋圖譜、血清藥理學(xué)、藥動學(xué)等技術(shù)，雖然能夠在一定程度上闡明中藥的部分藥效物質(zhì)，但實驗周期長、成本高且難以全面揭示整體的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[26]?；谝陨涎芯楷F(xiàn)狀，本研究采用分子對接技術(shù)，通過計算機(jī)模擬實現(xiàn)了對中藥藥效物質(zhì)大規(guī)模地虛擬篩選，縮短了實驗周期、節(jié)省了實驗成本。共篩選出21個潛在的抗炎藥效物質(zhì)，其中卡拉可林、宋果靈、海替生、易混翠雀花堿、黃草烏堿丁、繡線菊堿C、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、三小葉翠雀堿E、裸翠雀亭能與3個抗炎靶蛋白穩(wěn)定結(jié)合。已有文獻(xiàn)報道，宋果靈在體外實驗中表現(xiàn)出抗風(fēng)濕活性，其抗炎機(jī)制可能與抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生和下調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1，HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和TLR4的表達(dá)水平有關(guān)[27]；苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿對角叉萊膠引起的大、小鼠后踝關(guān)節(jié)腫，組織胺引起的皮膚滲透性增加，受精雞胚漿膜囊上肉芽組織形成均有明顯的抑制作用[28]；除此以外，朱瑞麗等[29]發(fā)現(xiàn)苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿還對脂多糖刺激的巨噬細(xì)胞均有抗炎作用，下調(diào)巨噬細(xì)胞兩種炎癥因子TNF-α和IL-6的分泌量，這與本研究虛擬篩選的結(jié)果一致?？ɡ闪帧⒑Ｌ嫔?、易混翠雀花堿、黃草烏堿丁、繡線菊堿C、三小葉翠雀堿E、裸翠雀亭鮮有文獻(xiàn)報道其抗炎藥效，這為后續(xù)炮附子抗炎藥效物質(zhì)的開發(fā)提供了理論指導(dǎo)。本研究還篩選出新烏頭原堿、附子靈、尼奧靈、塔拉地薩敏、次烏頭原堿、烏頭原堿等化合物，Li等[5]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析和高通量篩選表明新烏頭原堿、附子靈、尼奧靈是抑制炎癥反應(yīng)的藥效物質(zhì)，其機(jī)制可能與抑制NF-κB信號通路的異?；罨嘘P(guān)。Liu等[30]通過建立細(xì)胞胰腺炎模型發(fā)現(xiàn)塔拉地薩敏、次烏頭原堿是抗急性胰腺炎的有效成分。Zeng等[31]推測烏頭原堿可能是治療慢性關(guān)節(jié)炎的主要活性物質(zhì)，機(jī)制是烏頭原堿通過抑制NF-κB、活化T細(xì)胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）c1的激活及樹突狀細(xì)胞-特異性跨膜蛋白（dendritic cell-specific transmembrane protein，DC-STAMP）的表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞。以上文獻(xiàn)報道進(jìn)一步佐證了本研究虛擬篩選的藥效物質(zhì)的合理性。此外篩選出的單體化合物森布星A、異塔拉烏頭定、海替生、14-乙酰尼奧靈、森布星B的抗炎活性尚不十分明確，有待于進(jìn)一步地實驗驗證。

4.4 基于體內(nèi)外化學(xué)物質(zhì)組聯(lián)合計算機(jī)虛擬篩選的研究模式展望

目前中藥活性物質(zhì)的篩選研究，開始階段納入的單體成分，常來源于一些線上數(shù)據(jù)庫。以常用的中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫分析平臺（TCMSP）為例[32]，研究者根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)設(shè)立較高的篩選閾值，導(dǎo)致大量的經(jīng)典中藥活性成分被剔除。例如，采取口服利用度（oral bioavailability，OB）≥40%，且類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18的標(biāo)準(zhǔn)[33-34]，已被證實具有顯著抗炎藥效的烏頭堿并不會被納入篩選的范圍內(nèi)（OB＝7.87%，DL＝0.23）。本研究采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒別飲片及血清內(nèi)的化學(xué)成分，以此來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的線上數(shù)據(jù)庫篩選，以體外飲片的鑒別作為“標(biāo)桿”對照，含藥血清的鑒別作為最終結(jié)果。這種方法雖不能表征出包含中藥全部成分的化學(xué)物質(zhì)組，但保證了納入對象為吸收入血的中藥成分。另一方面，根據(jù)Orbitrap高分辨、高靈敏、進(jìn)樣量少的檢測特點，使得血容量較少的小鼠也可進(jìn)行研究，檢測限上的響應(yīng)結(jié)果反映了供試體系內(nèi)相對含量較高的離子，也就是說，鑒別結(jié)果為中藥體系內(nèi)含量較高的化學(xué)成分，在不考慮彼此效價強(qiáng)度的基礎(chǔ)上，這種結(jié)果也契合邏輯上的量效關(guān)系，即含量越高，藥效越強(qiáng)。計算機(jī)虛擬篩選模式憑借較好的預(yù)測精度及導(dǎo)向性優(yōu)勢，對藥效物質(zhì)的篩選有一定的參考價值，一定程度上避免了研究的盲目性[35]。

本研究采取的體內(nèi)、外化學(xué)物質(zhì)組聯(lián)合計算機(jī)虛擬篩選的研究模式，基于體外-體內(nèi)成分挖掘、虛擬多靶標(biāo)篩選、活性成分預(yù)測與文獻(xiàn)驗證相結(jié)合的策略，在理論上評價中藥化學(xué)成分對效應(yīng)靶點的結(jié)合能力，快速篩選中藥的藥效物質(zhì)[36]。對于中藥復(fù)雜體系的研究具有一定的啟示和幫助，然而預(yù)測結(jié)果仍有可能出現(xiàn)假陽性、假陰性，后期尚需要實現(xiàn)進(jìn)一步的實驗驗證。

本研究聯(lián)合體內(nèi)、外多維化學(xué)物質(zhì)組和分子對接策略篩選出森布星A、新烏頭原堿、卡拉可林、異塔拉烏頭定、烏頭原堿、宋果靈、海替生、次烏頭原堿、附子靈、尼奧靈等21個化合物與炎癥靶點的對接結(jié)果優(yōu)于陽性藥，為炮附子潛在的抗炎藥效物質(zhì)。發(fā)現(xiàn)卡拉可林、宋果靈、海替生、易混翠雀花堿、黃草烏堿丁、繡線菊堿C、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、三小葉翠雀堿E、裸翠雀亭11個化合物與3個炎癥靶蛋白均能穩(wěn)定結(jié)合，可能是值得發(fā)掘的具有潛力的藥效物質(zhì)。目前的文獻(xiàn)報道可部分驗證本研究的篩選結(jié)果，但仍有一些藥效物質(zhì)的抗炎效果缺乏文獻(xiàn)佐證，今后的研究可進(jìn)行相關(guān)的藥理實驗進(jìn)一步驗證其抗炎活性并明確量、毒、效的關(guān)系，保證臨床用藥的安全有效。本研究為炮附子抗炎藥效物質(zhì)的篩選及進(jìn)一步的機(jī)制研究提供了理論依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on pharmacodynamic material basis of processedcombined withandmulti-dimensional chemical substance group and molecular docking strategy

YIN Yi-hui1, ZHANG Kai2, CHEN Qian1, JIAO Ming-jie1, CHEN Dong-ling1, ZHANG Jia1, LI Fei1

1. School of Chinese Meteria Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China 2. School of Chinese Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China

To excavate the potential anti-inflammatory pharmacodynamic material basis of processed(Pao Fuzi in Chinese).Ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS) was used to identify the multi-dimensional chemical substance group ofand; Protein interaction network, topological analysis and related literatures were used to screen disease targets, and then molecular docking technology was used to screen for compounds that bind well to the target proteins.A total of 53 chemical components ofand 37 components that enter the blood were identified; TLR4 receptor, MMP9 receptor, and PLG receptor were identified as the key target proteins, and 21 compounds such as karakoline, songorine, hetisine, condelphine, sachaconitine, spiradine C, benzoylmesaconine, benzoylaconine, benzoylhypacoitine, trifoliolasine E, and denudatine were found to be the potential anti-inflammatory pharmacodynamic materials.The established method fully considered the complexity of the chemical components of traditional Chinese medicine decoction pieces and advanced from multiple levels gradually. It is convenient and quick to screen out the potential anti-inflammatory pharmacodynamic material of. The idea can provide a reference for the screening of pharmacodynamic material of Chinese medicine.

processed; chemical substance group; molecular docking; anti-inflammation; pharmacodynamic material basis; karakoline; sachaconitine; trifoliolasine E

R284.1

A

0253 - 2670(2023)12 -3785 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.12.005

2022-12-08

國家自然科學(xué)基金面上項目（81973479）

尹貽慧，碩士研究生，研究方向為中藥炮制理論及原理研究。E-mail: 2806462095@qq.com

通信作者：張 凱，博士研究生。E-mail: zk006086@163.com

李 飛，教授，碩士生導(dǎo)師。E-mail: 602110@bucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 王文倩]