張 紅，毛偉業(yè)，劉 霞，金 璐，李圣宇，傅惠英, *，壽旗揚(yáng), *

人參內(nèi)生真菌強(qiáng)壯土赤殼菌RSA2004中抗乳腺癌活性化合物的分離鑒定

張 紅1，毛偉業(yè)2，劉 霞1，金 璐1，李圣宇1，傅惠英1, 2*，壽旗揚(yáng)1, 2*

1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江 杭州 310005 2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053

研究人參內(nèi)生真菌強(qiáng)壯土赤殼菌RSA2004次生代謝產(chǎn)物的化學(xué)成分，以期發(fā)現(xiàn)具有抗乳腺癌活性的化合物。該菌大米固體發(fā)酵的95%乙醇水提取物經(jīng)硅膠、Sephadex LH-20凝膠及HPLC等多種柱色譜技術(shù)進(jìn)行分離純化，并根據(jù)核磁共振、質(zhì)譜、圓二色譜（electronic circular dichroism，ECD）、計(jì)算ECD等手段鑒定化合物的結(jié)構(gòu)，采用MTT法評價(jià)化合物對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的細(xì)胞毒性。從人參內(nèi)生真菌強(qiáng)壯土赤殼菌RSA2004發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到4個(gè)化合物，分別鑒定為強(qiáng)壯土赤殼菌內(nèi)酰胺A（1）、根赤殼菌素（2）、單青霉素I（3）和單青霉素IV（4）?；钚詼y試結(jié)果表明化合物1和3對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖有顯著的抑制活性，半數(shù)抑制濃度為（9.37±3.1）（5.13±2.5）μmol/L?；衔?為新的生物堿類化合物，命名為強(qiáng)壯土赤殼菌內(nèi)酰胺A；化合物1和3對MDA-MB-231細(xì)胞增殖有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。

人參；內(nèi)生真菌；次生代謝產(chǎn)物；生物堿；抗乳腺癌活性；強(qiáng)壯土赤殼菌內(nèi)酰胺A；單青霉素I

乳腺癌是當(dāng)前威脅女性生命健康的主要難治疾病之一，2020年世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer）最新數(shù)據(jù)顯示，全球乳腺癌新增人數(shù)達(dá)226萬，在女性癌癥中發(fā)病率躍居第1[1]，死亡率躍居第5[1]。臨床中，手術(shù)和化學(xué)藥物是治療乳腺癌的主要手段，但存在個(gè)體差異、耐藥性、不良反應(yīng)大等問題，尋找并開發(fā)新作用模式且不良反應(yīng)低的抗癌藥物一直是藥物研發(fā)領(lǐng)域的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。在1981—2019年被FDA批準(zhǔn)的抗腫瘤藥物中，64.9%的藥物源于天然藥物[2]，天然藥用成分具有不良反應(yīng)小、適合長期服用等特點(diǎn)。

植物來源的抗乳腺癌天然藥物臨床上應(yīng)用廣泛，但植物資源有限，僅圍繞植物去開發(fā)藥用活性成分，很難滿足人類對醫(yī)藥的需求。植物內(nèi)生真菌與植物互利共生[3]，一些定殖在植物體內(nèi)的真菌發(fā)揮著重要的生態(tài)功能，并對植物次生代謝物的形成起著重要的調(diào)控作用[4]。20世紀(jì)初，從紅豆杉var.(Pilger) Florin中得到能產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌[5]開始，醫(yī)藥研究者們發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生真菌是人類尋找藥用活性成分的重要來源。此外，隨著分子生物學(xué)、生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)等新興交叉學(xué)科的飛速發(fā)展，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌來源的天然產(chǎn)物的研究有著巨大的開發(fā)潛力。

目前，專家學(xué)者們已對近千種藥用植物的內(nèi)生真菌進(jìn)行了研究。植物內(nèi)生真菌被認(rèn)為是潛在的產(chǎn)生新穎活性次生代謝產(chǎn)物的來源，產(chǎn)生了有抗腫瘤、抗病原微生物、抗艾滋病病毒（human immunodeficiency virus，HIV）和殺蟲等活性的多種新穎骨架的化合物[6-9]。人參C. A. Meyer是五加科人參屬多年生草本植物，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載：“主補(bǔ)五臟，安精神，定魂魄，止驚悸，除邪氣，明目，開心益智，久服輕身延年”，藥用價(jià)值極高。人參主要化學(xué)成分有皂苷、多糖、揮發(fā)油、生物堿、黃酮類和甾醇類等[10]化合物，人參皂苷和人參多糖是從植物人參提取的主要藥理活性成分，具有抗腫瘤、抗心肌缺血、提高免疫力、降血糖、抗衰老等作用[11]。國內(nèi)外學(xué)者對人參開展了大量研究，主要聚焦于化學(xué)成分及藥理作用、內(nèi)生菌多樣性及可利用菌株篩選[12]、人參質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[13]等方面。人參種植品被批準(zhǔn)為新資源食品[14]，人參根的價(jià)值取決于它們的大小、形狀和整體外觀[15]，在4～6年的田間耕作中，根系易受多種土傳病害的侵襲，紅皮病、銹腐病、菌核病是人參栽培中最常見和最嚴(yán)重的問題，所以對人參內(nèi)生真菌的深入研究是很有必要的。

本研究對人參根部分離出的一株強(qiáng)壯土赤殼菌RSA2004進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物的研究。強(qiáng)壯土赤殼菌廣泛分布于木本和草本植物的根內(nèi)[16]，屬于腐生真菌或弱寄生真菌。該屬真菌代謝產(chǎn)物類型豐富、代謝途徑多樣，常見的代謝產(chǎn)物有聚酮、大環(huán)內(nèi)酯和萜類等，具有抗腫瘤、抗菌等生物活性。對強(qiáng)壯土赤殼菌RSA2004進(jìn)行大米固體發(fā)酵，95%乙醇水超聲提取得到總浸膏，綜合利用硅膠柱、凝膠Sephadex LH-20等柱色譜和HPLC制備等方法對其進(jìn)行分離純化，通過核磁共振譜和圓二色譜（electronic circular dichroism，ECD）等光譜技術(shù)鑒定，從該菌中得到4個(gè)化合物，分別鑒定為強(qiáng)壯土赤殼菌內(nèi)酰胺A（robusta A，1）、根赤殼菌素（radicicol，2）、單青霉素I（monocillin I，3）和單青霉素IV（monocillin IV，4）。其中化合物1為新的生物堿類化合物，進(jìn)一步采用MTT法測定分離化合物對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制活性，化合物1和3對MDA-MB-231細(xì)胞增殖有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為（9.37±3.10）（5.13±2.50）μmol/L。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LDZX-40B1型蒸汽滅菌鍋（上海申安器械廠），MJ-2502-I型真菌培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），ZHWY211B型搖床（上海智城分析儀器制造有限公司），Agilent 1260型液相色譜儀（美國Agilent公司），YMC C18色譜柱（250 mm×10 mm，5 μm；博納艾杰爾科技有限公司），Bruker AV III-600型核磁共振波譜儀（德國Bruker公司），UV-2401A型紫外分光光度計(jì)（日本島津股份有限公司），Nicolet IS50光譜儀（美國賽默飛世爾科技有限公司），JASCO J-810型圓二色光譜儀（日本分光株式會社），Waters SYNAPT G2-Si質(zhì)譜儀（美國沃特世科技有限公司），CYTATION多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）。

1.2 試劑與材料

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA，杭州百思生物技術(shù)有限公司），馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDB，杭州百思生物技術(shù)有限公司），柱色譜硅膠（100～200、300～400目，青島海洋化工產(chǎn)），Sephadex LH-20葡聚糖凝膠（日本GE醫(yī)療集團(tuán)），色譜級色譜甲醇和乙腈（美國Tedia公司），分析純乙醇、石油醚、醋酸乙酯、甲醇（廣東光華科技有限公司），磷酸鹽緩沖溶液和四甲基偶氮唑鹽（PBS和MTT，上海麥克林生化科技有限公司），順鉑（批號170701，國藥準(zhǔn)字H20040813，上海源葉生物科技有限公司）。

1.3 菌株來源

本研究所用菌株為2020年9月從吉林長白山區(qū)5年生園參C. A. Meyer植物根莖中分離所得，由浙江天科高新技術(shù)發(fā)展有限公司王庭璋副研究員鑒定為人參內(nèi)生真菌強(qiáng)壯土赤殼菌（GenBank序列號CBS 308.35），儲存于浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌株發(fā)酵

將活化后的強(qiáng)壯土赤殼菌挑取少量菌絲，均勻接種到裝有PDB的錐形瓶中，在恒溫培養(yǎng)搖床中培養(yǎng)3天（28 ℃、130 r/min），得到菌株種子液。將等量種子液接種至無菌大米培養(yǎng)基（80 g/瓶）中，共培養(yǎng)50瓶，室溫下發(fā)酵40 d，得到固體發(fā)酵物55 g。

2.2 菌株發(fā)酵物分離

發(fā)酵物用95%乙醇水提取3次，合并提取液并濃縮得到粗提物55 g。粗提物經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚-醋酸乙酯（100∶0～0∶1）梯度洗脫，經(jīng)HPLC分析后合并，共得到5個(gè)組分（Fr. 1～5）。Fr. 3（100∶10部分，15.3 g）經(jīng)凝膠Sephadex LH-20（二氯甲烷-甲醇1∶1）柱分離，得到7個(gè)組分Fr. 3.1～3.7。Fr. 3.6經(jīng)過半制備型 HPLC（YMC C18柱，95%甲醇-水洗脫，體積流量2.5 mL/min）分離純化，得到化合物1（R＝30.5 min，14.1 mg）；Fr. 3.3經(jīng)過半制備型 HPLC（YMC C18柱，26%乙腈-水洗脫，體積流量2.5 mL/min）分離純化，得到化合物2（R＝19.5 min，4.5 mg）、3（R＝24.1 min，7.0 mg）。Fr. 3.4經(jīng)過半制備型HPLC（YMC C18柱，70%甲醇-水洗脫，體積流量2.5 mL/min）分離純化，得到化合物4（R＝25.3 min，12.6 mg）。

2.3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色針狀結(jié)晶（甲醇），HR-ESI-MS/: 552.308 7 [M＋Na]+（計(jì)算值552.309 0），結(jié)合1H-NMR和13C-NMR譜，確定化合物1的分子式為C34H43NO4，不飽和度為14?；衔?的1H-NMR（表1）顯示有4個(gè)部分重疊的芳香氫信號(H6.78, 7.02～7.05)、1個(gè)連氧次甲基信號(H4.52)、6個(gè)甲基氫信號(H0.93, 0.94, 1.07, 1.23, 1.52和1.80) 和9個(gè)次甲基信號(H1.05, 1.56, 1.70, 1.90, 2.05, 2.22, 2.82, 3.16和3.40)。13C-NMR譜顯示有34個(gè)碳信號，其中10個(gè)芳香碳信號、2個(gè)羰基碳信號(C173.1和201.2) 和1個(gè)連氧碳信號(C87.3)，結(jié)合DEPT和HSQC譜，顯示有與上述質(zhì)子信號對應(yīng)的9個(gè)次甲基(C31.3, 32.3, 42.4, 44.0, 48.4, 53.4, 55.4, 55.6和57.7)、4個(gè)亞甲基(C34.7, 40.2, 45.1和46.7)、6個(gè)甲基信號(C14.5, 15.6, 19.0, 20.1, 22.6和27.8)和2個(gè)季碳信號(C53.2和88.8)。根據(jù)其1H-1H COSY相關(guān)信號，存在3個(gè)自旋系統(tǒng)，分別為H-7/H-8/H-9/H-10/H3-24/H-11/H-12/H3-25/H-13/H-14/H-15/H-16，H-1/H3-20和H-3/H3-21；據(jù)其HMBC相關(guān)信號，甲基H3-20與C-1、C-2、C-5和C-6相關(guān)，H3-21與C-1相關(guān)，H3-22與C-3、C-4、C-5和C-16相關(guān)，以及H3-23與C-5、C-6和C-7相關(guān)，可以構(gòu)建1的6/5/6/5四環(huán)骨架；H2-1與C-18 (C55.4)、C-2(C88.8) 和C-19 (C173.1) 相關(guān)，H-18與C-1(C34.7)、C-2和C-19相關(guān)，結(jié)合這幾個(gè)碳的化學(xué)位移和結(jié)構(gòu)中含有1個(gè)原子表明存在-內(nèi)酰胺片段；H2-3與C-1、C-2、C-4和C-5的相關(guān)信號表明，1,4-二取代的芳環(huán)通過亞甲基 (C-3,C46.7) 連接到-內(nèi)酰胺片段；H-14與C-7的相關(guān)信號，以及去屏蔽的C-14 (C87.3) 和C-7(C160.5)，表明C-14和C-7通過氧原子連接；然后，H-16與C-17/C-18和H2-1與C-17/C-18的相關(guān)性進(jìn)一步證實(shí)了1個(gè)不尋常的13元大環(huán)與四環(huán)系統(tǒng)融合。對NMR數(shù)據(jù)的綜合分析表明，除了1中-內(nèi)酰胺上C-18和C-1的雙鍵還原，化合物1類似于ascomylactam B[17]，因此，確定了化合物1的平面結(jié)構(gòu)，見圖1。

表1 化合物1的NMR數(shù)據(jù)(600/150 MHz, CDCl3)

圖1 化合物1的結(jié)構(gòu)及主要HMBC、1H-1H COSY和ROESY相關(guān)

在ROESY譜（圖1）中，H-14/H-6、H-6/H-16、H-16/H-7、H-7/H-13、H-16/H3-22、H3-22/H3-20、H3-25/H-6′、H3-25/H-11a和H-11a/H3-24的相關(guān)表明這些基團(tuán)是共面的，H-15/H-8′、H-8′/H-19和 H-15/H-8相關(guān)表明這些質(zhì)子位于化合物平面的另一側(cè)。此外，H-14/H-6′、H3-25/H-6′、H-1′/H-9′、H-1′/H-8′和H-15/H-8′的相關(guān)性表明，1的限制旋轉(zhuǎn)的苯環(huán)和-內(nèi)酰胺部分幾乎平行取向，該片段與化合物ascomylactam B[17]相同，可確定化合物1中的2′相對構(gòu)型。通過計(jì)算ECD的方法對化合物1的絕對構(gòu)型進(jìn)行確證，采用TDDFT和B3LYP/6-311＋＋G (2d, p) 法對化合物1進(jìn)行ECD計(jì)算，1的實(shí)驗(yàn)ECD光譜在230 nm和315 nm處顯示出負(fù)Cotton效應(yīng)，在275 nm處顯示正Cotton效應(yīng)，這與計(jì)算的結(jié)果非常一致（圖2）。因此，1的絕對構(gòu)型確定為1、4、7、8、10、12、13、14、15、16、18和2′。經(jīng)檢索化合物為1個(gè)新化合物，命名為強(qiáng)壯土赤殼菌內(nèi)酰胺A

化合物2：白色粉末（甲醇），分子式C18H17O6Cl；1H- NMR (600 MHz, DMSO-6): 10.57 (1H, brs, 16-OH), 10.02 (1H, brs, 14-OH), 7.15 (1H, dd,= 15.9, 9.8 Hz, H-8), 6.53 (1H, s, H-15), 6.08 (1H, t,= 9.8 Hz, H-7), 5.95 (1H, d,= 15.9 Hz, H-9), 5.90 (1H, dd,= 9.8, 3.0 Hz, H-6), 5.17 (1H, m, H-2), 4.98 (1H, d,= 16.5 Hz, H-11a), 4.65 (1H, d,= 16.5 Hz, H-11b), 4.44 (1H, m, H-5), 3.46 (1H, m, H-4), 2.00 (1H, m, H-3a), 1.61 (1H, m, H-3b), 1.34 (3H, d,= 6.7 Hz, H3-1)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 196.3 (C-10), 167.1 (C-18), 156.0 (C-16), 155.8 (C-14), 144.6 (C-8), 138.7 (C-12), 133.4 (C-6), 130.3 (C-9), 125.1 (C-7), 114.3 (C-13), 113.1 (C-17), 103.1 (C-15), 71.2 (C-2), 69.9 (C-4), 68.1 (C-5), 42.7 (C-11), 38.8 (C-3), 21.1 (C-1)；以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[18]，故鑒定化合物2為根赤殼菌素。

圖2 化合物1的實(shí)測與計(jì)算ECD譜圖

化合物3：無色油狀物（甲醇），分子式C18H18O6；1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 10.94 (1H, brs, 16-OH), 9.16 (1H, brs, 14-OH), 7.57 (1H, dd,= 16.1, 11.3 Hz, H-8), 6.35 (1H, dd,= 11.3, 10.7 Hz, H-7), 6.20 (1H, d,= 2.7 Hz, H-15), 6.05 (1H, d,= 2.7 Hz, H-13), 5.82 (1H, d,= 16.1 Hz, H-9), 5.83 (1H, dd,= 10.7, 2.7 Hz, H-6), 5.49 (1H, ddq,= 3.7, 3.7, 6.7 Hz, H-2), 4.97 (1H, d,= 14.0 Hz, H-11a), 3.56 (1H, d,= 14.0 Hz, H-11b), 3.52 (1H, q,= 2.7 Hz, H-5), 3.14 (1H, dt,= 8.5, 2.7 Hz, H-4), 2.38 (1H, m, H-3a), 1.66 (1H, m, H-3b), 1.43 (3H, d,= 6.7 Hz, 1-CH3)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 198.4 (C-10), 167.7 (C-18), 160.3 (C-16), 158.8 (C-14), 140.4 (C-8), 112.0 (C-12), 137.5 (C-6), 131.6 (C-9), 130.3 (C-7), 101.9 (C-13), 112.0 (C-17), 106.6 (C-15), 69.7 (C-2), 55.8 (C-4), 54.8 (C-5), 42.4 (C-11), 36.5 (C-3), 19.1 (C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[18]，故鑒定化合物3為單青霉素I。

化合物4：白色結(jié)晶（甲醇），分子式C18H22O5；1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 10.71 (1H, brs, 16-OH), 10.11 (1H, brs, 14-OH), 6.23 (1H, d,= 2.4 Hz, H-15), 6.11 (1H, d,= 2.4 Hz, H-13), 5.41 (2H, m, H-4, 5), 5.13 (1H, m, H-2), 3.87 (1H, d,= 14.0 Hz, H-11a), 3.68 (1H, d,= 14.0 Hz, H-11b), 2.41 (1H, m, H-3a), 2.24 (1H, m, H-3b), 2.38 (2H, m, H2-9), 2.00 (2H, m, H-6), 1.50 (2H, m, H2-8), 1.40 (2H, m, H2-7), 1.29 (3H, d,= 6.3 Hz, 1-CH3)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 207.8 (C-10), 169.7 (C-18), 161.6 (C-16), 161.3 (C-14), 137.7 (C-12), 133.9 (C-5), 126.2 (C-4), 111.0 (C-13), 109.1 (C-17), 102.0 (C-15), 72.2 (C-2), 48.2 (C-11), 40.9 (C-9), 38.0 (C-3), 31.9 (C-6), 25.7 (C-7), 22.7(C-8), 19.8 (C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[19]，故鑒定化合物4為單青霉素IV。

2.4 活性測試

采用MTT法對得到的化合物進(jìn)行抗乳腺癌的活性評價(jià)，以順鉑為陽性藥，具體的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)操作參考文獻(xiàn)方法[20]。數(shù)據(jù)分析顯示化合物1和3對MDA-MB-231細(xì)胞增殖具有顯著的抑制活性，其IC50分別為（9.37±3.10）、（5.13±2.50）μmol/L，活性強(qiáng)于陽性對照藥順鉑[IC50為（11.3±0.6）μmol/L]，其余化合物對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制活性較弱，在初篩50 μmol/L下，抑制率低于50%。

3 討論

植物內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物在抗菌、抗腫瘤和抗氧化等生物活性方面展現(xiàn)出較好的應(yīng)用潛力，是新藥發(fā)現(xiàn)的潛在資源。本實(shí)驗(yàn)對人參內(nèi)生真菌強(qiáng)壯土赤殼菌 RSA2004的次生代謝產(chǎn)物的化學(xué)成分進(jìn)行研究，運(yùn)用多種分離純化和鑒定技術(shù)，從強(qiáng)壯土赤殼菌RSA2004中得到十三元大環(huán)生物堿類新化合物1和芳香聚酮類化合物2～4。經(jīng)抗乳腺癌活性篩選，化合物1和3對MDA-MB-231細(xì)胞株增殖有顯著的抑制活性。本研究豐富了對強(qiáng)壯土赤殼菌次生代謝產(chǎn)物的認(rèn)識，且對十三元大環(huán)和四環(huán)聚合的大環(huán)生物堿類化合物的抗乳腺癌活性值得進(jìn)一步深入研究，可為人參內(nèi)生真菌資源的合理開發(fā)應(yīng)用做出積極貢獻(xiàn)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Sung H, Ferlay J, Siegel R L,. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries [J]., 2021, 71(3): 209-249.

[2] Newman D J, Cragg G M. Natural products as sources of new drugs over the nearly four decades from 01/1981 to 09/2019 [J]., 2020, 83(3): 770-803.

[3] Fadiji A E, Babalola O O. Elucidating mechanisms of endophytes used in plant protection and other bioactivities with multifunctional prospects [J]., 2020, 8: 467.

[4] Kudo R, Masuya H, Endoh R,. Gut bacterial and fungal communities in ground-dwelling beetles are associated with host food habit and habitat [J]., 2019, 13(3): 676-685.

[5] Strobel G, Stierle A, Stierle D,., a proposed new taxon for a bulbilliferous hyphomycete associated with Pacific yew () [J]., 1993, 47(71): 71-80.

[6] Singh A, Singh D K, Kharwar R N,. Fungal endophytes as efficient sources of plant-derived bioactive compounds and their prospective applications in natural product drug discovery: Insights, avenues, and challenges [J]., 2021, 9(1): 197.

[7] Chen G D, Zhao B X, Huang M J,. Tripodalsporormielones A-C, unprecedented cage-like polyketides with complex polyvdent bridged and fused ring systems [J]., 2021, 11(11): 3648-3654.

[8] Wu T Z, Salim A A, Capon R J. Millmerranones A-F: A meroterpene cyclic carbonate and related metabolites from the Australian fungussp. CMB-MRF324[J]., 2021, 23(21): 8424-8428.

[9] Xu K, Li R J, Zhu R X,. Xylarins A-D, two pairs of diastereoisomeric isoindoline alkaloids from the endolichenic fungussp [J]., 2021, 23(20): 7751-7754.

[10] Razgonova M P, Veselov V V, Zakharenko A M,.components and the pathogenesis of Alzheimer’s disease (Review) [J]., 2019, 19(4): 2975-2998.

[11] Mancuso C, Santangelo R.and: From pharmacology to toxicology [J]., 2017, 107(Pt A): 362-372.

[12] 張亞光, 張艷欣, 高崎. 人參內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)及其與有效成分相關(guān)性分析[J]. 人參研究, 2021, 33(3): 2-8.

[13] 陳小玲, 司函瑞,付東興, 等. 人參三醇組皂苷質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的初步研究 [J]. 特產(chǎn)研究, 2022, 44(1): 20-28.

[14] 中國藥典 [S]. 一部. 2020: 8.

[15] Zhou Y, Yang Z M, Gao L L,. Changes in element accumulation, phenolic metabolism, and antioxidative enzyme activities in the red-skin roots of[J]., 2017, 41(3): 307-315.

[16] Chaverri P, Salgado C, Hirooka Y,. Delimitation ofand(Nectriaceae, Hypocreales, Ascomycota) and related Genera with-like anamorphs [J]., 2011, 68: 57-78.

[17] Chen Y, Liu Z M, Huang Y,. Ascomylactams A-C, cytotoxic 12- or 13-membered-ring macrocyclic alkaloids isolated from the mangrove endophytic fungussp. CYSK-4, and structure revisions of phomapyrrolidones A and C [J]., 2019, 82(7): 1752-1758.

[18] Shinonaga H, Noguchi T, Ikeda A,. Synthesis and structure-activity relationships of radicicol derivatives and WNT-5A expression inhibitory activity [J]., 2009, 17(13): 4622-4635.

[19] Gao J T, Radwan M M, León F,.sp.-derived resorcylic acid lactones withbinding affinity for human opioid and cannabinoid receptors [J]., 2013, 76(5): 824-828.

[20] 胡永, 段玉書, 苑春茂, 等. 艾納香中1個(gè)新倍半萜內(nèi)酯及其細(xì)胞毒活性研究 [J]. 中草藥, 2019, 50(14): 3274-3278.

Isolation and identification of compounds with anti-breast cancer activity in endophytic fungusRSA200g

ZHANG Hong1, MAO Wei-ye2, LIU Xia1, JIN Lu1, LI Sheng-yu1, FU Hui-ying1, 2, SHOU Qi-yang1, 2

1.The Second Clinical Medical College & Second Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310005, China 2. Pharmacy Division of Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China

To study the secondary metabolites of the endophytic fungusRSA2004 fromin order to obtain compounds with anti-breast cancer activity.The 95% ethanol extracts from the solid fermentation of rice were separated and purified by silica gel, Sephadex LH-20 gel and HPLC. The structures of the compounds were determined by NMR, mass spectrometry, circular dichroism, computational circular dichroism, etc. MTT experiment was used to evaluate the cytotoxicity of the compounds to breast cancer cell line MDA-MB-231.Four compounds were isolated and identified from the fermentation products of the endophytic fungusRSA2004, which were identified as robusta A (1), radicicol (2), monocillin I (3), and monocillin IⅤ (4). The activity test results showed that compounds 1 and 3 had significant inhibitory activity on breast cancer cell line MDA-MB-231 with the IC50values of (9.37±3.1) μmol/L and (5.13±2.5) μmol/L.Compound 1 is a new alkaloid compound named robusta A. Compounds 1 and 3 have strong cytotoxicity on the proliferation of MDA-MB-231 cells.

C. A. Meyer; endophytic fungi; secondary metabolites; alkaloids; anti-breast cancer activity; robusta A;monocillin I

R284.1

A

0253 - 2670(2023)12 - 3771 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.12.003

2023-03-28

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2023KY880）

張 紅（1988—），女，助理研究員，主要從事中藥及中藥內(nèi)生菌活性成分的研究。Tel: 15305187672 E-mail: zhanghong_16@126.com

通信作者：壽旗揚(yáng)，研究員，博士生導(dǎo)師。Tel: (0571)86613569 E-mail: sqy133@126.com

傅惠英，研究員。Tel: (0571)86633010 E-mail: fhy131@126.com

[責(zé)任編輯 王文倩]