衛(wèi)夢(mèng)堯，張小輝，李 飛，吳子鋒，楊永志，丁金龍

（廣東工業(yè)大學(xué) 生物醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

鐵皮石斛(Dendrobium officinale) 是一種傳統(tǒng)名貴中藥材，其活性成分包括多糖、生物堿、多酚、微量元素和氨基酸等[1-3]，其中多糖是其最主要的活性成分，2020 版《中國藥典》中規(guī)定鐵皮石斛中多糖含量不低于25%[4]。目前鐵皮石斛多糖報(bào)道具有降血糖、抗腫瘤、保濕、保護(hù)腸胃、抗氧化和增強(qiáng)免疫力等作用[5-9]，但在美白活性方面的報(bào)道較少[10]。

由于天然產(chǎn)物具有安全、溫和、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，從天然植物中提取有美白和保濕功效成分來改善皮膚狀態(tài)，已成為目前護(hù)膚產(chǎn)品開發(fā)的主要趨勢(shì)[11]。酪氨酸酶是黑色素合成過程中最主要的限速酶，目前具有美白作用的植物化妝品主要通過抑制該酶來減少皮膚中黑色素形成[12]。近年來，文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)多糖有抑制黑色素生成以及酪氨酸酶活性的作用[13-14]。天然產(chǎn)物中的多糖具有一定的吸濕保濕性能，具有開發(fā)為天然保濕劑的潛能[15]，戚輝[16]用鐵皮石斛水溶液進(jìn)行保濕實(shí)驗(yàn)，表現(xiàn)了石斛多糖對(duì)皮膚具有保濕作用，而目前在細(xì)胞層面上反映石斛多糖保濕效果的報(bào)道較少。

已有文獻(xiàn)報(bào)道鐵皮石斛鮮條具有明顯抗氧化和抑制酪氨酸酶活性作用[17]。陳默等[18]報(bào)道石斛提取物能明顯抵御干燥對(duì)表皮細(xì)胞的損傷，使細(xì)胞活力增加，而石斛多糖作為鐵皮石斛中最主要的成分，探究其在美白和保濕方面的活性能為石斛多糖的應(yīng)用提供新思路。本文通過正交試驗(yàn)優(yōu)化石斛多糖的提取工藝，并探究石斛多糖對(duì)B16細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性和細(xì)胞內(nèi)黑色素含量的影響，通過建立HaCaT細(xì)胞干燥損傷模型，測(cè)定多糖對(duì)細(xì)胞干燥損傷的影響，以期為石斛多糖美白和保濕護(hù)膚功效產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

鐵皮石斛鮮莖，浙江；無水乙醇、硫酸、苯酚、磷酸，分析純，廣州化學(xué)試劑廠；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基、青鏈霉素，美國 Gibco 公司；B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞，武漢普諾賽生命科技有限公司；HaCaT細(xì)胞,北京北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司；噻唑藍(lán)(MTT)，上海阿拉丁公司。

RE-5 299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本島津儀器有限公司；L6S型紫外分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；XH-C旋渦混勻器，常州越新儀器制造有限公司；DW-86L338超低溫保存箱，中國海爾集團(tuán)公司；Forma 3 111二氧化碳培養(yǎng)箱，美國賽默飛公司；BDSDM500倒置生物顯微鏡，無錫奧特光學(xué)有限公司；DW-40L508低溫保存冰箱，中國海爾集團(tuán)公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀，美國賽默飛公司；熒光倒置顯微鏡，日本OLYMPUS公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 石斛多糖的基本制備工藝流程

將鐵皮石斛破碎后，水提，過濾，離心得上清液，將上清液減壓濃縮后醇沉，離心棄上清，沉淀冷凍干燥得到石斛多糖[19]。

1.2.2 石斛多糖含量的測(cè)定及提取率的計(jì)算

采用苯酚?硫酸法[20]進(jìn)行石斛多糖的測(cè)定，在波長490 nm處測(cè)定吸光度值，記錄吸光度值，通過葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖提取率。

1.2.3 石斛多糖提取的單因素試驗(yàn)

本文選用料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)和提取溫度4個(gè)影響因素，考察影響因素對(duì)熱水浸提石斛多糖提取率的影響。固定液料比1∶25，提取時(shí)間60 min，提取溫度90 ℃，提取1次的基本條件，研究改變料液比(1∶15，1∶20，1∶25，1∶30)、提取時(shí)間(15，30，60，120 min)、提取次數(shù)(1，2，3，4)、提取溫度(60，70，80，90 ℃)對(duì)石斛多糖提取率的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn)法優(yōu)化

鐵皮石斛多糖提取工藝以多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察熱水浸提法中料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)和提取溫度4個(gè)因素對(duì)石斛多糖提取率的影響。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定各個(gè)因素水平，并進(jìn)行L9(34) 正交試驗(yàn)，正交因素水平見表1。

表1 正交因素水平Table 1 Orthogonal factor and level

1.2.5 石斛多糖對(duì)B16細(xì)胞的影響

1) 細(xì)胞培養(yǎng)。

B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞是一種能高表達(dá)黑色素的惡性黑色素瘤。用B16細(xì)胞建立細(xì)胞水平的評(píng)價(jià)模型，能更真實(shí)反映哺乳動(dòng)物體內(nèi)的酶活力變化規(guī)律[21-23]。取B16細(xì)胞復(fù)蘇，置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%～90%時(shí)，用適量胰酶消化，取 1 /4 細(xì)胞量進(jìn)行傳代培養(yǎng)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2) 石斛多糖對(duì)B16細(xì)胞活力的影響。

采用MTT法[24]測(cè)定細(xì)胞活力，取處于生長對(duì)數(shù)期的B16細(xì)胞以每孔5×104的細(xì)胞密度接種于96孔板，孵育24 h后，分別加入質(zhì)量濃度為0，10，62.5，125，250，500 μg/mL的石斛多糖，繼續(xù)孵育48 h后，加入MTT溶液，在570 nm的波長下，置于酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度(OD)。

3) 石斛多糖對(duì)B16細(xì)胞黑色素的影響。

取處于生長對(duì)數(shù)期的B16細(xì)胞以每孔2×105的細(xì)胞密度接種于24孔板，孵育24 h后，分別加入質(zhì)量濃度為0，10，125，500 μg/mL的石斛多糖和100 μg/mL的熊果苷溶液，孵育48 h后，棄上清，用PBS(磷酸緩沖鹽溶液)清洗2遍，消化收集細(xì)胞，細(xì)胞懸液以10 000 r/min 離心10 min，棄上清并加入含10%DMSO的1mol/L NaOH 500 μL，于80 ℃水浴加熱60 min，離心取上清液于405 nm的波長下，置于酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度[25]。

將處于對(duì)數(shù)生長期的B16細(xì)胞以4×105個(gè)/mL接種于12孔板，24 h后，分別加入質(zhì)量濃度為0，10，125，500 μg/mL石斛多糖和100 μg/mL的熊果苷溶液，孵育48 h后，棄上清，用PBS洗滌2次，采用L-多巴染色[26]，用倒置熒光顯微鏡100倍拍照觀察。

4) 石斛多糖對(duì)B16細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響。

取處于生長對(duì)數(shù)期的B16細(xì)胞以每孔5×104的細(xì)胞密度接種于96孔板，孵育24 h后，分別加入質(zhì)量濃度為0，10，62.5，125，250，500 μg/mL石斛多糖和100 μg/mL的熊果苷溶液，孵育48 h后，棄上清，用PBS沖洗2遍，加入1% TritonX-100 50 μL，放入?80 ℃冰箱冷凍1 h，隨后在室溫下融化，加入0.1%的L-DOPA溶液100 μL，在37 ℃反應(yīng)1 h，在490 nm的波長下，置于酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度[27]。

1.2.6 石斛多糖對(duì)HaCaT細(xì)胞活力的影響

人永生化表皮角質(zhì)細(xì)胞系HaCaT是非腫瘤來源的人正常皮膚永生化角質(zhì)形成細(xì)胞，具有培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單和易于增殖培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，將其用于抗干燥損傷實(shí)驗(yàn)，可從側(cè)面反映樣品在細(xì)胞層面上的保濕效果[28]。取HaCaT細(xì)胞復(fù)蘇，置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%～90%時(shí)，用適量胰酶消化，取1/4細(xì)胞量進(jìn)行傳代培養(yǎng)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

采用MTT法[29]測(cè)定細(xì)胞活力，取處于生長對(duì)數(shù)期的HaCaT細(xì)胞以每孔5×104的細(xì)胞密度接種于96孔板，每孔100 μL，孵育24 h后，分別加入質(zhì)量濃度為0，10，62.5，125，250，500 μg/mL的石斛多糖，繼續(xù)孵育48 h后，加入MTT溶液，在570 nm的波長下，置于酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度。

1.2.7 石斛多糖對(duì)HaCaT細(xì)胞干燥損傷的影響

從細(xì)胞的干燥損傷實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)細(xì)胞抵抗干燥死亡的能力，從而反映多糖的抗干燥作用。將處于對(duì)數(shù)生長期的 HaCaT 細(xì)胞以1 × 105個(gè)/mL的密度接種到96孔板，在0.4 m/s的干燥風(fēng)速下，從孔中取出培養(yǎng)基，并將它們分別放在潔凈工作臺(tái)上5，10，15 和 20 min。然后加入培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h。之后，吸出細(xì)胞培養(yǎng)基，加入MTT溶液，在570 nm的波長下，置于酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度[30]。

實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、透明質(zhì)酸陽性對(duì)照組和多糖處理組，將處于對(duì)數(shù)生長期的 HaCaT 細(xì)胞以1 ×105個(gè)/mL的密度接種到 96 孔板，培養(yǎng)24 h后，除對(duì)照組外，以0.4 m/s的干燥風(fēng)速，從孔中取出培養(yǎng)基，置于超凈工作臺(tái)上10 min，再加入100 μL不同質(zhì)量濃度的多糖和100 μg/mL透明質(zhì)酸，孵育 24 h，加入MTT溶液，在570 nm的波長下，置于酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均以±s表示，p<0.05為組間具有顯著性差異，p<0.01為組間具有極顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 石斛多糖提取的單因素試驗(yàn)

不同因素對(duì)石斛多糖提取率的影響如圖1所示，隨著料液比的增加，多糖提取率先上升后趨向于穩(wěn)定，料液比在1∶25時(shí)鐵皮石斛多糖提取率最大；隨著提取時(shí)間的增加，多糖提取率先上升后趨向于穩(wěn)定，提取時(shí)間在60 min時(shí)鐵皮石斛多糖提取率最大，提取時(shí)間再延長，多糖提取率基本趨于穩(wěn)定；隨著提取次數(shù)的增加，多糖提取率先上升后趨向于穩(wěn)定，考慮到后續(xù)濃縮多糖溶液效率，選擇提取2次較為適宜；隨著提取溫度的上升，多糖提取率先上升后下降，提取溫度在70 ℃時(shí)鐵皮石斛多糖提取率最大，溫度再升高反而使得多糖提取率下降，這可能是由于溫度過高導(dǎo)致糖醛酸分解。

圖1 不同因素對(duì)石斛多糖提取率的影響Fig.1 The influence of different factors on the extraction rate of Dendrobium polysaccharides

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 正交試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)展開L9(34) 正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。從結(jié)果得出，試驗(yàn)指標(biāo)中多糖提取率越大越好，從K值得出鐵皮石斛多糖的最佳提取條件為A1B1C2D1，即提取時(shí)間60 min、料液比1∶20、提取次數(shù)2次、提取溫度60 ℃。由方差分析結(jié)果可知，因素C對(duì)鐵皮石斛多糖提取率有顯著影響(p<0.05) ，因素A、B、D對(duì)石斛多糖提取率無顯著影響(p>0.05) ，對(duì)石斛多糖提取率影響的主要順序?yàn)镃>B>D>A，即提取次數(shù)、料液比、提取溫度、提取時(shí)間，與直觀分析結(jié)果一致。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results

表3 方差分析1)Table 3 Analysis of variance

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

利用正交試驗(yàn)得到的最優(yōu)提取工藝(提取時(shí)間60 min、料液比1∶20、提取次數(shù)2次、提取溫度60℃)，重復(fù)3組石斛多糖提取試驗(yàn)。結(jié)果石斛多糖提取率為(12.45±0.09)%，這個(gè)結(jié)果與正交試驗(yàn)表中最高提取率12.38%接近，說明正交試驗(yàn)優(yōu)選出來的最佳提取工藝條件準(zhǔn)確可靠。

2.3 石斛多糖對(duì)B16細(xì)胞的影響

2.3.1 石斛多糖對(duì)B16細(xì)胞活力的影響

由圖2可見，石斛多糖在試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍10～500 μg/mL 時(shí)，B16細(xì)胞活力均在90%以上，與空白對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。說明石斛多糖在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)B16細(xì)胞活力無明顯影響，表明石斛多糖對(duì)B16細(xì)胞無毒性。

圖2 石斛多糖對(duì)B16細(xì)胞活力的影響Fig.2 The effect of polysaccharides on the cell viability rate of B16 cells

2.3.2 石斛多糖對(duì)B16細(xì)胞黑色素含量的影響

石斛多糖對(duì)B16細(xì)胞內(nèi)黑色素的含量影響如圖3所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高濃度的石斛多糖對(duì)細(xì)胞內(nèi)黑色素的生成有一定的抑制作用(p<0.01)。且對(duì)細(xì)胞內(nèi)的黑色素生成的抑制呈劑量依賴性，當(dāng)石斛多糖質(zhì)量濃度在500 μg/mL時(shí)黑色素的含量為(66.20±3.77)%，陽性對(duì)照熊果苷組的黑色素含量為(67.64±2.19)%，與熊果苷組相比，石斛多糖有抑制黑色素生成能力。

圖3 石斛多糖對(duì)B16細(xì)胞黑色素相對(duì)含量的影響Fig.3 Effect of polysaccharides on the melanin content of B16 cells

細(xì)胞多巴染色結(jié)果如圖4所示。相比于空白對(duì)照組，可以看到500 μg/mL的石斛多糖(DOP)和熊果苷組的黑色素生成量更少，并與上述對(duì)黑色素含量的影響結(jié)果相一致。

圖4 B16 細(xì)胞的左旋多巴染色圖像(100×)Fig.4 L-dopa staining image of B16 cells (100×)

2.3.3 石斛多糖對(duì)B16細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響

酪氨酸酶是黑色素生成的關(guān)鍵酶，其活性越低，產(chǎn)生的黑色素含量越少[31]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，石斛多糖和陽性對(duì)照熊果苷組均對(duì)酪氨酸酶活性有抑制效果(p<0.01)。石斛多糖在500 μg/mL時(shí)酪氨酸酶活性為(69.30±3.84)%；而熊果苷組的酪氨酸酶活性為(69.50±1.79)%，所以石斛多糖可以抑制酪氨酸酶的活性。陳金妹[17]研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛水提物對(duì)酪氨酸酶活性有抑制作用，而多糖作為鐵皮石斛水提物的最主要成分，可能是起抑制作用的重要成分。結(jié)合前人研究，推測(cè)石斛多糖可通過抑制酪氨酸酶的活性，從而抑制黑色素的生成。

圖5 石斛多糖對(duì)B16細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響Fig.5 Effects of polysaccharides on tyrosinase activity of B16 cells

在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，石斛多糖對(duì)B16細(xì)胞活力無影響，無細(xì)胞毒性；在多糖質(zhì)量濃度為500 μg/mL時(shí)，酪氨酸酶活性為(69.30±3.84)%，黑色素含量為(66.20±3.77)%。多糖的濃度越大，其酪氨酸酶活性和黑色素含量就越低，且存在濃度依賴。

綜合石斛多糖對(duì)酪氨酸酶活性與黑色素生成的影響，說明石斛多糖可以通過抑制黑色素合成的酪氨酸酶的活性[32]，從而減少細(xì)胞內(nèi)黑色素的生成量。

2.3.4 石斛多糖對(duì)HaCaT細(xì)胞活力的影響

由圖6可見，石斛多糖在試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍10～500 μg/mL 時(shí)，HaCaT細(xì)胞活力均在90%以上，與空白對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05) 。說明石斛多糖在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)HaCaT細(xì)胞活力無明顯影響，表明石斛多糖對(duì)HaCaT細(xì)胞無毒性。

圖6 石斛多糖對(duì)HaCaT活力的影響Fig.6 The effect of polysaccharides on the cell viability rate of HaCaT cells

2.3.5 石斛多糖對(duì)HaCaT細(xì)胞干燥損傷的影響

建立一個(gè)合適的細(xì)胞干燥損傷模型，檢測(cè)細(xì)胞抵抗干燥的能力，從而反映多糖的保濕性能，細(xì)胞干燥死亡率越低，則多糖的保濕功效越好[15]。不同風(fēng)干時(shí)間對(duì)細(xì)胞活力的影響如圖7(a)所示，當(dāng)干燥時(shí)間為10 min時(shí)，細(xì)胞存活率為(74.83±0.82)%，此時(shí)細(xì)胞的風(fēng)干死亡結(jié)果更穩(wěn)定，所以選擇細(xì)胞干燥模型干燥10 min。

圖7 石斛多糖對(duì)HaCaT細(xì)胞干燥損傷的影響Fig.7 The effect of polysaccharides on HaCaT cells desiccation injury

不同質(zhì)量濃度的多糖對(duì)干燥損傷細(xì)胞的修復(fù)作用如圖7(b)所示。與透明質(zhì)酸陽性對(duì)照組相比，不同濃度的石斛多糖均減少了因干燥損傷導(dǎo)致的細(xì)胞死亡率。100 μg/mL的透明質(zhì)酸陽性對(duì)照組細(xì)胞存活率為(86.14±2.10)%，而石斛多糖在125 μg/mL時(shí)的細(xì)胞存活率，由空白對(duì)照組的(71.07±2.44)%提高至(86.58±3.58)%。

紀(jì)漫[30]提取的龍眼核活性脂質(zhì)對(duì)干燥損傷的HaCaT細(xì)胞有保護(hù)和修復(fù)作用，上調(diào)干燥損傷的HaCaT 細(xì)胞中的HA(透明質(zhì)酸)和AQP3(水通道蛋白3)水平。陳默[18]等提取的鐵皮石斛多糖提取物的保濕效果能顯著抵御干燥對(duì)表皮細(xì)胞的損傷。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，鐵皮石斛中的多糖對(duì)細(xì)胞的干燥損傷修復(fù)起主要作用，可能也通過上調(diào)HA和AQP3水平提高細(xì)胞自身抗干燥損傷能力，在分子水平上促進(jìn)干燥損傷細(xì)胞產(chǎn)生保濕物質(zhì)，從而提高細(xì)胞自身抗干燥損傷能力，增強(qiáng)皮膚的保濕作用。

3 結(jié)論

(1) 采用水提醇沉法提取石斛多糖，優(yōu)選鐵皮石斛多糖提取工藝最佳條件，提取時(shí)間為60 min、料液比為1∶20、提取次數(shù)2次、提取溫度為60 ℃；該工藝條件下石斛多糖的提取率為12.45%。

(2) 采用B16細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)石斛多糖可以通過抑制黑色素合成關(guān)鍵酶的活性，從而減少細(xì)胞內(nèi)黑色素的生成量。

(3) 建立HaCaT細(xì)胞干燥死亡模型，發(fā)現(xiàn)石斛多糖可以提高細(xì)胞在干燥損傷中的存活率，減少細(xì)胞干燥損傷造成的死亡。

(4) 本文研究結(jié)果可為鐵皮石斛多糖的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)和在美白保濕類產(chǎn)品中的應(yīng)用提供參考和依據(jù)。