張 睿,朱興旺,劉永譜,劉利明,陳艷娟,許選鋒,王光義,汪保江,張傳富,成志強(qiáng),劉冬舟,陳 永,6

(1. 暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院(深圳市人民醫(yī)院),廣東 深圳 518020;2. 南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,廣東 廣州 510330;3. 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,貴州 貴陽(yáng) 550004;4. 南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市婦幼保健院,廣東 深圳 518172;5. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院,上海 200137;6. 遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,貴州 遵義 563000)

老年類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(elderly rheumatoid arthritis,ERA)是指60歲以后發(fā)病者和年輕時(shí)發(fā)病但是超過(guò)60歲者(部分文獻(xiàn)以65歲為臨界值)[1]。相對(duì)于年輕RA患者,ERA患者具有發(fā)病急、常伴系統(tǒng)損害、功能預(yù)后差等特點(diǎn)[2]。由于合并癥增多,尤其是老年相關(guān)疾病使得ERA患者常需要多種藥物治療各種合并癥,并且由于肝、腎、消化系統(tǒng)功能下降而增加藥物不良事件和禁忌證,這些因素導(dǎo)致ERA復(fù)雜的治療方案難以?xún)?yōu)化[3]。中醫(yī)藥治療RA的相關(guān)研究頗為豐富,但是單純以中藥控制RA常難以達(dá)到滿意的效果;另外單純以控制RA病情活動(dòng)度的相關(guān)研究使得中藥復(fù)方多系統(tǒng)、多靶點(diǎn)的整體治療特色和優(yōu)勢(shì)難以顯現(xiàn)。在風(fēng)濕病的臨床實(shí)踐中,本課題組形成藥食同源自擬方甘草養(yǎng)陰湯,并獲得發(fā)明專(zhuān)利(專(zhuān)利號(hào):ZL 2021 1 0515336.1)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)甘草養(yǎng)陰湯含藥血清對(duì)RA的重要效應(yīng)細(xì)胞即滑膜成纖維樣細(xì)胞的增殖和遷移具有抑制作用[4];網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),甘草養(yǎng)陰湯中含有130種口服可吸收的有效成分,可能通過(guò)調(diào)控RA和衰老的多個(gè)共同基因靶點(diǎn)在ERA患者的治療中發(fā)揮優(yōu)勢(shì)[5],但尚缺乏進(jìn)一步研究。本研究擬通過(guò)建立ERA小鼠模型,運(yùn)用數(shù)據(jù)非依賴(lài)采集(data-independent acquisition,DIA)蛋白組學(xué)技術(shù)分析ERA小鼠模型相比于單純類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型的分泌表型特點(diǎn),并探討甘草養(yǎng)陰湯及與RA首選藥物甲氨蝶呤聯(lián)用對(duì)ERA模型的作用效果及整體調(diào)節(jié)機(jī)制,為甘草養(yǎng)陰湯在ERA的臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)8周齡DBA/1雄性小鼠72只,體重22～25 g,購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,許可證號(hào):SCXK(蘇)2021-0013。動(dòng)物房溫度28 ℃,相對(duì)濕度60%,小鼠提供充足食物及滅菌水自由飲食。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用委員會(huì)監(jiān)督檢查(編號(hào):20210306-11)。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 甘草養(yǎng)陰湯由甘草、人參、干姜、玉竹、羅漢果、玉竹、大棗組成,按照5∶2.5∶2.5∶2∶4∶3∶2比例稱(chēng)取各味藥(藥品購(gòu)自深圳市人民醫(yī)院中藥房),煎煮1 h后濃縮備用;甲氨蝶呤(上海信宜,國(guó)藥準(zhǔn)字H31020644,規(guī)格:2.5 mg×16片/盒)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組、造模及干預(yù) 隨機(jī)取12只小鼠作為RA組;另取10只小鼠作為正常組,于RA組注射的時(shí)間節(jié)點(diǎn)在背部皮下多點(diǎn)注射0.1 mL冰醋酸(0.5 mol/L),同時(shí)每日頸部皮下注射0.1 mL蒸餾水;另剩余50只小鼠在膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)模型基礎(chǔ)上加D-半乳糖刺激建立ERA模型,將造模成功小鼠隨機(jī)分為ERA組、甲氨蝶呤組、甘草養(yǎng)陰湯組、甲氨蝶呤+甘草養(yǎng)陰湯組。RA造模方法:將牛Ⅱ型膠原60 mg溶于0.5 mol/L冰醋酸30 mL中,4 ℃過(guò)夜;冰浴下逐滴加入等體積的完全氟氏佐劑,研成乳劑備用;于大鼠背部皮下多點(diǎn)注射0.1 mL乳劑進(jìn)行初次免疫,15 d后再次注射0.1 mL 作為加強(qiáng)免疫,同時(shí)每日頸部皮下注射0.1 mL蒸餾水;觀察30 d,出現(xiàn)四肢關(guān)節(jié)腫脹為建模成功[6]。ERA造模方法:在RA建模方式的基礎(chǔ)上于頸部皮下注射D-半乳糖125 mg/kg,每日1次,連續(xù)注射6周[7];第6周末,若小鼠出現(xiàn)毛色枯黃、行動(dòng)遲緩、精神萎靡等現(xiàn)象判為造模成功。證實(shí)造模成功后,甲氨蝶呤組給予甲氨蝶呤1 mg/kg灌胃(給藥劑量參考文獻(xiàn)[8]),每周2次;甘草養(yǎng)陰湯組給予甘草養(yǎng)陰湯3.0 g/kg(飲片當(dāng)量)灌胃,每日1次;甲氨蝶呤+甘草養(yǎng)陰湯組給予甲氨蝶呤和甘草養(yǎng)陰湯灌胃,藥物用量及方法同甲氨蝶呤組和甘草養(yǎng)陰湯組;正常組、RA組、ERA組均給予等量生理鹽水灌胃,每日1次;各組均灌胃4周。

1.4檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1關(guān)節(jié)炎評(píng)分 灌胃結(jié)束后,按照關(guān)節(jié)炎病變5級(jí)評(píng)分法,采用盲法對(duì)小鼠后肢關(guān)節(jié)腫脹情況進(jìn)行評(píng)分:0分,無(wú)紅腫;1分,腳趾關(guān)節(jié)輕微腫脹;2分,腳趾關(guān)節(jié)和腳踝腫脹;3分,腳踝以下腫脹;4分,包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的所有關(guān)節(jié)腫脹[9]。

1.4.2后肢關(guān)節(jié)HE染色病理學(xué)形態(tài)及病理特征評(píng)分 各組小鼠麻醉后,斷頸安樂(lè)處死,取后肢關(guān)節(jié),分離表面皮膚組織,采用EDTA脫鈣液浸泡14 d充分脫鈣后,沿踝關(guān)節(jié)矢狀面切開(kāi),依次進(jìn)行4%甲醛固定、脫水透明、浸蠟包埋、脫蠟、HE染色、脫水透明及封固等。采用玻片掃描影像分析系統(tǒng)100X(深圳市生強(qiáng)科技有限公司)對(duì)玻片進(jìn)行掃描,由2位經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的病理醫(yī)師采用盲法使用數(shù)字病理閱片軟件進(jìn)行組織學(xué)分析。對(duì)水腫、滑膜增生、軟骨/骨侵蝕、血管翳形成情況,按無(wú)、輕、中、重依次評(píng)為0,1,2,3,4分[10]; 根據(jù)關(guān)節(jié)周?chē)は轮窘M織占比情況計(jì)算脂肪沉積評(píng)分 。

1.4.3DIA蛋白組學(xué)分析 取各組小鼠血清樣本(眼球取血),每組對(duì)應(yīng)的生物學(xué)重復(fù)均為隨機(jī)選取的4只,共計(jì)24份樣本。進(jìn)行去豐度處理后,參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行基于DIA定量蛋白組學(xué)分析(由上海Biotree公司完成)。對(duì)歸一化的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理,保留唯一肽段數(shù)大于或等于1的蛋白,并使用最小值二分之一法對(duì)空值進(jìn)行填值處理。經(jīng)過(guò)預(yù)處理后共計(jì)2 415個(gè)檢測(cè)蛋白被保留。隨后對(duì)蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,主要包括主成分分析、KEGG通路分析、PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析、Mfuzz聚類(lèi)分析等。其中差異表達(dá)蛋白篩選條件采用Student’st-test檢驗(yàn)的p-value< 0.05且Fold change≤0.83 或≥1.2[12]。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用GraphPad Prism 9軟件對(duì)各組小鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分、病理特征評(píng)分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布則多組比較使用方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗(yàn),非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分 最終正常組8只、RA組9只、ERA組8只、甲氨蝶呤組11只、甘草養(yǎng)陰湯組9只、甲氨蝶呤+甘草養(yǎng)陰湯組12只存活。肉眼觀察,ERA組后肢腫脹更明顯,關(guān)節(jié)炎評(píng)分明顯高于RA組(P<0.05);甘草養(yǎng)陰湯組、甲氨蝶呤+甘草養(yǎng)陰湯組關(guān)節(jié)炎評(píng)分均明顯低于ERA組和甲氨蝶呤組(P均<0.05),甲氨蝶呤組與ERA組比較、甘草養(yǎng)陰湯組與甲氨蝶呤+甘草養(yǎng)陰湯組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 正常組、RA組和老年類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎各組小鼠后肢關(guān)節(jié)腫脹情況及關(guān)節(jié)炎評(píng)分

2.2各組小鼠踝關(guān)節(jié)病理表現(xiàn)和病理特征評(píng)分 ERA組小鼠后肢關(guān)節(jié)水腫、滑膜增生、軟骨/骨侵蝕情況較類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組重,此三項(xiàng)評(píng)分均明顯高于類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組(P均<0.05),血管翳形成及脂肪沉積評(píng)分與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05);甲氨蝶呤組關(guān)節(jié)水腫、滑膜增生、軟骨/骨侵蝕、血管翳形成、脂肪沉積評(píng)分與ERA組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),甘草養(yǎng)陰湯組、甲氨蝶呤+甘草養(yǎng)陰湯組關(guān)節(jié)水腫、軟骨/骨侵蝕、脂肪沉積評(píng)分均明顯低于ERA組(P均<0.05)。見(jiàn)圖2及圖3。

圖2 正常組、RA組和老年類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎各組小鼠踝關(guān)節(jié)HE染色病理表現(xiàn)(4×2倍,局部放大為4×10倍)

圖3 正常組、RA組和老年類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎各組小鼠踝關(guān)節(jié)各項(xiàng)病理特征評(píng)分

2.3正常組與RA組、ERA組間小鼠分泌表型特點(diǎn)RA組相對(duì)于正常組上調(diào)88個(gè)蛋白,下調(diào)120個(gè)蛋白,這些差異表達(dá)蛋白通過(guò)KEGG分析主要富集于人乳頭瘤病毒感染(Human papillomavirus infection),PI3K-Akt 信號(hào)通路、冠狀病毒病等通路(另有IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路未顯示在前10通路中);ERA組相對(duì)于正常組上調(diào)77個(gè)蛋白,下調(diào)67個(gè)蛋白,主要富集于肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)(Regulation of actin cytoskeleton)、吞噬體(Phagosome)、中性粒細(xì)胞胞外陷阱形成(Neutrophil extracellular trap formation)、局部鏈接(Focal adhesion)、Rap1信號(hào)通路等(另見(jiàn)人乳頭瘤病毒感染、PI3K-Akt信號(hào)通路等未顯示于前10通路);ERA組與RA組比較,上調(diào)71個(gè)蛋白,下調(diào)70個(gè)蛋白,主要富集于中性粒細(xì)胞胞外陷阱形成、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、鞘脂信號(hào)通路(Sphingolipid signaling pathway)等。見(jiàn)圖4。 在Toll樣受體信號(hào)通路上,RA組Myd88、Nfkb1、Pik3r1、Irf3、Mapk3均高于正常組;ERA組Mapk14、Map2k2均低于RA組,Rac1高于RA組(圖5A);在細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用通路上,RA組Lamc1、Itgb1、Itga2、Reln、Tcn、Itgb3、Itga2b和Hspg2靶點(diǎn)均下調(diào)(圖5B);ERA組相比于RA組,在炎癥介導(dǎo)的瞬時(shí)受體電位 (TRP) 離子通道(Inflammatory mediator regulation of TRP channels)上Plcb3、Pla2g4c和Calm4靶點(diǎn)均下調(diào)(圖5C),另外在促性腺激素釋放激素(GnRH)信號(hào)通路靶點(diǎn)Mapk14、Plcb3、Map2k2、Pla2g4c、Calm4(圖5A、C、D),胰島素信號(hào)通路靶點(diǎn)Prkar2a、Prkaa1、Map2k2、Calm4(圖5A、C、D),糖原信號(hào)通路靶點(diǎn)Plcb3、Prkaa1、Pdhb、Calm4(圖5C、D、E)均下調(diào)?？梢?jiàn),ERA組分泌表型與RA組存在一些相同的炎癥通路改變,也存在明顯的不同,包括部分炎癥靶點(diǎn)的抑制和代謝的下調(diào),相關(guān)差異表達(dá)蛋白的蛋白相互作用見(jiàn)圖6。

圖4 正常組與RA組、ERA組間小鼠分泌表型特點(diǎn)(熱圖及KEGG分析)

A:RA組、ERA組在Toll樣受體信號(hào)通路相關(guān)靶點(diǎn)變化;B:RA組下調(diào)ECM受體相互作用通路多個(gè)靶點(diǎn);C:相比于RA組,ERA組在炎癥介導(dǎo)的瞬時(shí)受體電位 (TRP) 離子通道低表達(dá)相關(guān)靶點(diǎn);D:相比于RA組,ERA組下調(diào)胰島素信號(hào)通路相關(guān)靶點(diǎn);E:相比于RA組,ERA組下調(diào)糖原信號(hào)通路相關(guān)靶點(diǎn)圖5 正常組與RA組、ERA組間小鼠典型差異表達(dá)蛋白

圖6 RA組與ERA組差異表達(dá)蛋白相互作用(PPI)

2.4ERA組和ERA各干預(yù)組間蛋白組學(xué)特點(diǎn) ①甲氨蝶呤作用于ERA小鼠上調(diào)62個(gè)蛋白、下調(diào)131個(gè)蛋白,主要富集于PI3K-Akt信號(hào)通路、溶酶體(Lysosome)、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)等通路,見(jiàn)圖7;顯示出對(duì)炎癥、代謝等層面的調(diào)節(jié)作用,例如在PI3K-Akt信號(hào)通路除了Vegfc、Egfr上調(diào),Ifnar2、Lamc1、Csf1r、Lama2、Tnc、Tnn、Casp9、Comp、Thbs4均顯著下調(diào)(圖8、圖9)。②甘草養(yǎng)陰湯作用于ERA小鼠致上調(diào)65個(gè)蛋白、下調(diào)132個(gè)蛋白,主要富集于溶酶體、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、吞噬體(Phagosome)、冠狀病毒病、脂質(zhì)代謝等通路,見(jiàn)圖7;甘草養(yǎng)陰湯抑制炎癥與對(duì)細(xì)胞的作用與甲氨蝶呤有一定相似之處,例如對(duì)于PI3K-Akt信號(hào)通路的作用與甲氨蝶呤的抑制趨勢(shì)(圖9)。此外,甘草養(yǎng)陰湯干預(yù)靶點(diǎn)更傾向于代謝相關(guān)通路,如核苷酸糖的生物合成、氨基糖和核苷酸糖代謝、維生素消化吸收、半乳糖代謝、淀粉和蔗糖代謝等(未列入前10通路),如在脂質(zhì)代謝通路Apoa4、Apoc3、Apoc1、Pltp、Apoa1、Apoc2、Sort1、Pcsk9等靶點(diǎn)均下調(diào)(圖10);在半乳糖代謝通路下調(diào)的靶點(diǎn)包括Gaa、Pgm1,而在尿苷二磷酸葡萄糖(Uridine diphosphate glucose,UDP)代謝通路中上調(diào)Gne、Nans(圖11A);在細(xì)胞周期調(diào)控靶點(diǎn)Plk3和Hspb6顯著下調(diào),而炎癥抑制因子Tab1呈上調(diào)趨勢(shì)(圖11B);其他炎癥因子如Stat1、Tnfsf14、C1qtnf3、C1qtnf5、Il18bp、Il1rap、Mmp19、Ha1d、Ha1w、Hapln1、Tgfbi等在甘草養(yǎng)陰湯及其他治療均呈下調(diào)趨勢(shì)(圖11C)。甲氨蝶呤+甘草養(yǎng)陰湯作用于ERA小鼠上調(diào)111個(gè)蛋白,下調(diào)65個(gè)蛋白,主要富集于壞死性凋亡(Necroptosis)、冠狀病毒病(Coronavirus disease)以及多種炎癥相關(guān)通路如JAK-STAT信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等,見(jiàn)圖7。其中Dhfr、Cbr1、Shmt1等靶點(diǎn)參與葉酸生物合成、抗葉酸抵抗(Antifolate resistance)通路均顯示上調(diào)(圖12);Stat1、Stat3、Egfr、Prkcq等參與PD-1檢查點(diǎn)通路及多種炎癥通路顯著下調(diào);參與破骨細(xì)胞分化的Tec、Trem2、Ifnar2以及Stat1均顯著下調(diào)(圖11B、圖12)。對(duì)正常組、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組、ERA組、甲氨蝶呤+甘草養(yǎng)陰湯組的蛋白進(jìn)行Mfuzz聚類(lèi)分析,可見(jiàn)相對(duì)獨(dú)立的6組變化趨勢(shì)的蛋白聚類(lèi),其中Cluster 1,2,3,5,6組蛋白的變化均符合對(duì)抗療法的原理,尤其是在Cluster 6中的蛋白,ERA組依次高于類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組及正常組,但甲氨蝶呤+甘草養(yǎng)陰湯治療使它們趨于正常(圖13)。

圖7 ERA組和ERA各干預(yù)組間小鼠分泌表型特點(diǎn)(熱圖及KEGG分析)

圖8 甲氨蝶呤作用于ERA小鼠PI3K-Akt信號(hào)通路的靶點(diǎn)

圖9 甲氨蝶呤、甘草養(yǎng)陰湯及甲氨蝶呤+甘草養(yǎng)陰湯對(duì)ERA小鼠PI3K-Akt信號(hào)通路其他靶點(diǎn)的影響

圖10 甘草養(yǎng)陰湯作用于ERA小鼠脂質(zhì)代謝通路的相關(guān)靶點(diǎn)

A:甘草養(yǎng)陰湯顯示出對(duì)糖代謝通路多個(gè)靶點(diǎn)的調(diào)節(jié)作用;B:甘草養(yǎng)陰湯對(duì)細(xì)胞周期通路相關(guān)靶點(diǎn)的調(diào)控作用;C:甘草養(yǎng)陰湯及甲氨蝶呤以及中西醫(yī)結(jié)合治療對(duì)其他常見(jiàn)炎癥因子的調(diào)節(jié)變化趨勢(shì)圖11 甲氨蝶呤、甘草養(yǎng)陰湯及甲氨蝶呤+甘草養(yǎng)陰湯作用于ERA小鼠乳糖和尿苷二磷酸葡萄糖(UDP)代謝相關(guān)靶點(diǎn)及炎癥代表性靶點(diǎn)

圖12 甲氨蝶呤+甘草養(yǎng)陰湯作用于ERA小鼠的葉酸代謝相關(guān)通路代表性差異表達(dá)蛋白

圖13 正常組及RA組、ERA組、甲氨蝶呤+甘草養(yǎng)陰湯組蛋白Mfuzz聚類(lèi)分析

3 討 論

隨著人類(lèi)預(yù)期壽命的延長(zhǎng),ERA人群也在不斷擴(kuò)大,該類(lèi)患者與年輕RA患者存著不同的臨床特征和生物學(xué)特征[13]。一些學(xué)者認(rèn)為ERA的治療不達(dá)標(biāo)與臨床治療不夠積極有關(guān)[12],國(guó)內(nèi)外的指南強(qiáng)調(diào)生物制劑等并未增加ERA人群的不良事件[14]。但老年病學(xué)的特征在ERA人群同樣存在,這是臨床工作者治療顧忌的客觀原因,所以加強(qiáng)這一領(lǐng)域的研究是亟須解決的科學(xué)問(wèn)題。

目前未見(jiàn)ERA動(dòng)物模型的報(bào)道,本研究采用經(jīng)典的衰老模型建立方法結(jié)合膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠模型成功建立ERA模型是動(dòng)物模型的創(chuàng)新。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ERA小鼠后肢腫脹更明顯,關(guān)節(jié)炎評(píng)分及后肢關(guān)節(jié)水腫、滑膜增生、軟骨/骨侵蝕評(píng)分均明顯高于類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠,血管翳形成及脂肪沉積評(píng)分與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠比較差異不明顯,證實(shí)衰老導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞更為嚴(yán)重。

既往研究認(rèn)為,隨著年齡增加,機(jī)體固有免疫系統(tǒng)增強(qiáng)激活了慢性炎癥反應(yīng),而特異性免疫功能缺失會(huì)導(dǎo)致免疫耐受功能的損害,并加重自身免疫反應(yīng)[15]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)蛋白組學(xué)對(duì)靶點(diǎn)的研究發(fā)現(xiàn),關(guān)節(jié)損傷的加重不一定是由于更高水平的炎癥,例如炎癥介導(dǎo)的瞬時(shí)受體電位(TRP)離子通道、Toll樣受體信號(hào)通路等相關(guān)靶點(diǎn)并未比單純類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠明顯升高;但對(duì)代謝的改變(脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、鞘脂信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路、糖原信號(hào)通路)似乎更具有傾向性,而脂質(zhì)代謝與炎癥反應(yīng)及脂肪組織與軟骨損傷具有明顯相關(guān)性[16],且衰老通過(guò)代謝對(duì)骨-關(guān)節(jié)的影響證據(jù)也較為明確[17-18],這可能是ERA人群面臨更為嚴(yán)重關(guān)節(jié)損傷的機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)中,單用甲氨蝶呤干預(yù)ERA小鼠在關(guān)節(jié)炎評(píng)分及病理學(xué)評(píng)分中并未顯示明顯的療效,這可能與用量偏小有關(guān),但滿足小鼠與RA患者服用劑量的換算關(guān)系(以成人60 kg計(jì),10～20 mg/周,即為人的12.3倍[19]);蛋白組學(xué)分析顯示,單用甲氨蝶呤干預(yù)后PI3K-Akt等炎癥信號(hào)通路相關(guān)靶點(diǎn)顯著下調(diào)。單用甘草養(yǎng)陰湯干預(yù)可以明顯減輕ERA小鼠的關(guān)節(jié)損傷,對(duì)眾多炎癥靶點(diǎn)顯示出一定下調(diào)趨勢(shì),其中Ha1w、Ha1d(均由H2-K1基因編碼,相當(dāng)于I類(lèi)組織相容性抗原)呈不同程度下調(diào)趨勢(shì)。單用甲氨蝶呤或甘草養(yǎng)陰湯對(duì)TNF家族蛋白(Tnfsf14、C1qtnf3、C1qtnf5),白細(xì)胞介素家族(Il18bp、Il1rap),Mmp19、Hapln1、Tgfbi均呈不同程度的下調(diào)趨勢(shì),其中Hapln1是新近證實(shí)的促進(jìn)RA炎癥表型的靶點(diǎn)[20]。甘草養(yǎng)陰湯對(duì)諸多代謝通路具有明顯的調(diào)節(jié)作用,例如脂質(zhì)代謝通路、半乳糖代謝通路等靶點(diǎn)均顯著下調(diào)。脂質(zhì)代謝正向合成不僅是衰老的特征[21-22],而且可促進(jìn)炎癥的發(fā)展[23-24],而甘草養(yǎng)陰湯對(duì)這些靶點(diǎn)下調(diào)體現(xiàn)了其對(duì)炎癥及衰老的抑制作用。

甲氨蝶呤通過(guò)抗葉酸來(lái)抑制細(xì)胞蛋白合成及抑制細(xì)胞分裂從而發(fā)揮抗風(fēng)濕、抗腫瘤作用[25],這是甲氨蝶呤導(dǎo)致不良反應(yīng)如貧血的主要原因。在本研究中甲氨蝶呤與甘草養(yǎng)陰湯聯(lián)用對(duì)多種炎癥因子的抑制作用更顯著,如Stat1、Hspb6、Tgfb等,且聯(lián)合用藥可抑制破骨細(xì)胞分化通路的相關(guān)靶點(diǎn),對(duì)骨代謝有良性調(diào)節(jié)作用。值得注意的是,葉酸生物合成通路相關(guān)靶點(diǎn)Dhfr、Cbr1、Shmt1在聯(lián)合甲氨蝶呤和甘草養(yǎng)陰湯的中西醫(yī)結(jié)合治療中被上調(diào),這一偶然發(fā)現(xiàn)巧妙地解釋了甘草養(yǎng)陰湯對(duì)甲氨蝶呤的減毒增效作用機(jī)制。

DIA蛋白質(zhì)組學(xué)是近年來(lái)開(kāi)發(fā)的質(zhì)譜分析策略,具有蛋白質(zhì)覆蓋范圍廣、重現(xiàn)性高和準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)[26]。本實(shí)驗(yàn)采用DIA蛋白質(zhì)組學(xué)分析ERA小鼠模型的分泌表型,發(fā)現(xiàn)并非衰老促進(jìn)炎癥加重關(guān)節(jié)損傷,更可能是通過(guò)代謝改變導(dǎo)致ERA更為嚴(yán)重的關(guān)節(jié)破壞;且證實(shí)甘草養(yǎng)陰湯對(duì)甲氨蝶呤治療ERA有減毒、增效作用,這有待深入開(kāi)展臨床研究進(jìn)行驗(yàn)證。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。