曹竣植，童敏思，祝毛玲，王保才，史惠惠，臧意，馬靜，李力

同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院(上海市楊浦區(qū)中心醫(yī)院)消化科，上海 200090

結(jié)腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，流行病學(xué)調(diào)查顯示其病死率、發(fā)病率逐年增高、居高不下，且呈現(xiàn)逐漸年輕化趨勢[1]。近年來有研究證實(shí)，結(jié)腸癌與糖尿病之間存在密切聯(lián)系，糖尿病在發(fā)病率、預(yù)后方面均對結(jié)腸癌具有重要影響[2]。但目前關(guān)于糖尿病，尤其是2型糖尿病導(dǎo)致結(jié)腸癌發(fā)病率升高的作用機(jī)制尚未明確，一般認(rèn)為與機(jī)體高血糖狀態(tài)引發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)[3]。2 型糖尿病患者體內(nèi)晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)在機(jī)體高血糖狀態(tài)引發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)中功不可沒，不僅刺激產(chǎn)生氧自由基，還促進(jìn)多種細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子β1蛋白(TGF-β1)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)大量釋放，因此在腫瘤細(xì)胞中多呈高表達(dá)[4]。為進(jìn)一步探究機(jī)體高血糖狀態(tài)與氧化應(yīng)激反應(yīng)之間的關(guān)系，本文將檢測老年結(jié)腸腫瘤患者的RAGE、VEGF、TGF-β1表達(dá)水平，以探究其與臨床指標(biāo)的關(guān)系以及對生存期的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年5 月至2020 年5 月同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院收治的100例老年結(jié)腸腫瘤患者進(jìn)行研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)結(jié)腸鏡、手術(shù)取標(biāo)本后經(jīng)病理檢查確診為結(jié)腸癌者；(2)符合世界衛(wèi)生組織(WHO)[5]關(guān)于糖尿病的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)者；(3)納入研究前3個月未接受過化療、放療、靶向治療者；(4)納入研究前3個月無腸道術(shù)史者；(5)對本研究知情同意并簽署相關(guān)同意書者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并妊娠期、1型糖尿病或因內(nèi)分泌導(dǎo)致的糖尿病者；(2)合并免疫系統(tǒng)嚴(yán)重疾病者；(3)合并嚴(yán)重肝、心、腎疾病者。所有患者按照疾病類型分為結(jié)腸癌合并2 型糖尿病組(n=32)、結(jié)腸癌組(n=33)及結(jié)腸腺瘤組(n=35)。三組患者的臨床病理分期、腫瘤部位、浸潤深度比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，具有可比性，見表1。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

表1 三組患者的一般資料比較[±s，例(%)]Table 1 Comparison of general data of patients among three groups[±s,n(%)]

表1 三組患者的一般資料比較[±s，例(%)]Table 1 Comparison of general data of patients among three groups[±s,n(%)]

指標(biāo)年齡(歲)男/女臨床病例分期A期B期C期D期浸潤深度全層肌層黏膜腫瘤部位脾曲部降結(jié)腸橫結(jié)腸回盲部升結(jié)腸肝曲部乙狀結(jié)腸結(jié)腸癌組(n=33)71.79±3.02 21(63.64)/12(36.36)2(6.06)26(78.79)3(9.09)2(6.06)23(69.70)8(24.24)2(6.06)1(3.03)3(9.09)3(9.09)4(12.12)7(21.21)7(21.21)8(24.24)結(jié)腸腺瘤組(n=35)72.25±3.30 24(68.57)/11(31.43)2(5.71)25(71.43)5(14.29)3(8.57)26(74.29)6(17.14)3(8.57)2(5.71)3(8.57)4(11.43)5(14.29)5(14.29)7(20.00)9(25.71)結(jié)腸癌合并2型糖尿病組(n=32)72.19±3.18 22(68.75)/10(31.25)1(3.13)25(78.13)4(12.50)2(6.25)24(75.00)6(18.75)2(6.25)1(3.13)3(9.38)2(6.25)5(15.63)6(18.75)7(21.88)8(25.00)F/Z/χ2值0.256 0.252 1.067 0.730 1.564 P值0.880 0.882 0.983 0.948 0.999

1.2 方法

1.2.1 所用試劑 鼠抗人VEGF 單克隆抗體，購自福州邁新公司；兔抗人TGF-β1多克隆抗體、兔抗人RAGE 多克隆抗體及全套免疫組化試劑，購自武漢博士德公司。

1.2.2 檢測方法 所有患者采集腫瘤病灶組織及病灶周圍組織制作標(biāo)本，對病理切片行常規(guī)脫蠟后入水，應(yīng)用0.3%的H2O2對內(nèi)源性過氧化物酶進(jìn)行阻斷，封閉切片應(yīng)用10%小牛血清，滴加1∶200稀釋的一抗，置于4℃環(huán)境24 h；次日1 h復(fù)溫，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)水洗后滴加1∶200的二抗，顯色應(yīng)用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，完成顯色后于顯微鏡下進(jìn)行觀察，梯度酒精行脫水，胞核行蘇木精復(fù)染，二甲苯透明，樹膠封片。陰性對照為PBS替代一抗，武漢博士德公司提供陽性對照。

1.2.3 分析方法 各目的抗原在腫瘤組織中的表達(dá)情況應(yīng)用半定量法定量分析。在高倍顯微鏡(×500)下隨機(jī)選擇5個視野也即500個細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞比例。0 分：陽性細(xì)胞數(shù)在5%以下；1 分：陽性細(xì)胞數(shù)在5%～24%；2 分：陽性細(xì)胞數(shù)在25%～50%；3分：陽性細(xì)胞數(shù)在51%～74%；4 分：陽性細(xì)胞數(shù)在75%以上。觀察切片中陽性細(xì)胞著色情況及強(qiáng)度：0 分，無色；1分，淡黃的；2分，棕黃色；3分，棕褐色。最終表達(dá)情況以比例和著色強(qiáng)度計分相加，0分：陰性(-)；1～2分：弱陽性(+)；3～5分：中等陽性(++)；6～7分：強(qiáng)陽性(+++)。

1.3 隨訪 通過電話、QQ、微信、電子郵件、信件等方式隨訪以掌握患者的病情、預(yù)后情況，隨訪時間間隔為3個月。隨訪截至?xí)r間為2022年5月。

1.4 觀察指標(biāo) 比較結(jié)腸癌病理組織標(biāo)本中RAGE、VEGF、TGF-β1表達(dá)情況；分析RAGE、VEGF、TGF-β1表達(dá)與年齡、腫瘤直徑、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)系；分析RAGE、VEGF、TGF-β1表達(dá)與生存期的相關(guān)性，其中生存期分為無復(fù)發(fā)生存期(RFS)：期間腫瘤無復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移；總生存期(OS)：期間患者無死亡。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，計數(shù)資料以例(%)表示，組間比較采用χ2檢驗，采用單因素回歸分析RAGE、VEGF、TGF-β1與年齡、腫瘤直徑、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)系，采用Spearman 相關(guān)性分析法分析RAGE、VEGF、TGF-β1表達(dá)與生存期間的相關(guān)性。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌病理組織標(biāo)本中RAGE、VEGF、TGF-β1表達(dá)情況 RAGE、VEGF、TGF-β1在結(jié)腸癌、結(jié)腸腺瘤以及結(jié)腸癌合并2 型糖尿病中均有表達(dá)(圖1～圖6)，且主要集中在癌癥細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，主要位于固有腺上皮、癌旁黏膜上皮、癌細(xì)胞胞漿中；其中結(jié)腸癌合并2 型糖尿病組RAGE、VEGF、TGF-β1陽性高表達(dá)率明顯高于結(jié)腸癌組和結(jié)腸腺瘤組，且結(jié)腸癌合并2 型糖尿病組RAGE、VEGF、TGF-β1陽性表達(dá)率也明顯高于結(jié)腸癌組和結(jié)腸腺瘤組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

圖1 RAGE在結(jié)腸癌中表達(dá)(×500)Figure 1 Expression of RAGE in colon cancer(×500)

圖2 RAGE在結(jié)腸腺瘤中表達(dá)(×500)Figure 2 Expression of RAGE in colon adenoma(×500)

圖3 RAGE在糖尿病合并結(jié)腸癌中表達(dá)(×500)Figure 3 Expression of RAGE in diabetes with colon cancer(×500)

圖4 VEGF在結(jié)腸癌中表達(dá)(×500)Figure 4 Expression of VEGF in colon cancer(×500)

圖5 VEGF在結(jié)腸腺瘤中表達(dá)(×500)Figure 5 Expression of VEGF in colon adenoma(×500)

圖6 VEGF在糖尿病合并結(jié)腸癌中表達(dá)(×500)Figure 6 Expression of VEGF in colon cancer combined with type 2 diabetes(×500)

表2 三組結(jié)腸癌病理組織標(biāo)本中RAGE、VEGF、TGF-β1表達(dá)水平比較[例(%)]Table 2 Comparison of RAGE,VEGF,TGF-β1 in pathological tissue samples among the three groups[n(%)]

2.2 RAGE、VEGF、TGF-β1表達(dá)與臨床指標(biāo)的關(guān)系 RAGE、VEGF、TGF-β1表達(dá)與年齡、腫瘤直徑無關(guān)(P＞0.05)；RAGE、VEGF、TGF-β1表達(dá)與結(jié)腸癌癌細(xì)胞組織遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)，見表3。

表3 RAGE、VEGF、TGF-β1表達(dá)與臨床指標(biāo)的關(guān)系[例(%)]Table 3 The relationship between the expression of RAGE,VEGF,TGF-β1 and clinical indicators[n(%)]

2.3 三組患者的RFS、OS 比較 三組患者的RFS、OS比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且結(jié)腸癌合并2型糖尿病組RFS、OS均明顯短于結(jié)腸腺瘤組和結(jié)腸癌組，結(jié)腸腺瘤組明顯短于結(jié)腸癌組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表4。

表4 三組患者的RFS、OS比較(±s，d)Table 4 Comparison of RFS and OS among the three groups(±s,d)

表4 三組患者的RFS、OS比較(±s，d)Table 4 Comparison of RFS and OS among the three groups(±s,d)

注：與結(jié)腸癌組比較，aP＜0.05；與結(jié)腸腺瘤組比較，bP＜0.05。Note: Compared with colon cancer group,aP＜0.05; Compared with the colon adenoma group,bP＜0.05.

組別結(jié)腸癌組結(jié)腸腺瘤組結(jié)腸癌合并2型糖尿病組t值P值OS 335.19±49.29 362.19±55.12a 303.15±35.17ab 6.299 0.043例數(shù)33 35 32 RFS 203.14±101.52 289.46±146.29a 181.04±93.09ab 7.607 0.022

2.4 RAGE、VEGF、TGF-β1表達(dá)與RFS、OS 的相關(guān)性 采用Spearman 相關(guān)性分析顯示，結(jié)腸癌患者RAGE、VEGF、TGF-β1表達(dá)與RFS、OS 呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，見表5。

表5 RAGE、VEGF、TGF-β1表達(dá)與RFS、OS的相關(guān)性Table 5 Correlation between RAGE,VEGF,TGF-β1 expression and RFS,OS

3 討論

糖尿病是一種機(jī)體營養(yǎng)和代謝紊亂性疾病，發(fā)病機(jī)制與胰島素分泌不足有關(guān)，同時該病累及機(jī)體所有系統(tǒng)代謝，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量和生命健康。美國糖尿病學(xué)會和癌癥學(xué)會聯(lián)合發(fā)布的報告中指出，糖尿病在增加結(jié)腸癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌患病方面具有積極作用[6]。根據(jù)相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查也發(fā)現(xiàn)，我國糖尿病發(fā)病率和致死率與結(jié)腸癌的發(fā)病率與致死率具有一致性，加上糖尿病患者機(jī)體高糖特性對癌細(xì)胞具有快速復(fù)制的作用，復(fù)制后還能作為能量場幫助癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且葡萄糖轉(zhuǎn)化過程能引發(fā)正常細(xì)胞凋亡、壞死，進(jìn)一步促進(jìn)癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[7]。

癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)移過程中產(chǎn)生大量的晚期糖基化終產(chǎn)物，且該終產(chǎn)物不可逆，雖然其在正常人體內(nèi)也會隨著年齡不斷增長，但因該終產(chǎn)物受體RAGE在人體器官淋巴細(xì)胞、組織、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)均廣泛存在，因此其水平在糖尿病患者機(jī)體內(nèi)異常旺盛，與癌細(xì)胞結(jié)合可能產(chǎn)生相關(guān)生理、病理學(xué)改變，導(dǎo)致細(xì)胞壞死、損傷[8]。VEGF是一種高度特異性促血管生長因子，主要參與新血管生成和調(diào)控，與結(jié)腸癌形成具有一定相關(guān)性，同時參與腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲[9]。TGF-β1則具有調(diào)解上皮細(xì)胞生長、調(diào)控腫瘤發(fā)生進(jìn)展、調(diào)控細(xì)胞周期等作用，一般情況下惡性腫瘤均存在TGF-β信號通路異常情形[10]。

有研究結(jié)果表明，結(jié)腸癌合并2 型糖尿病患者機(jī)體內(nèi)晚期糖基化終產(chǎn)物結(jié)合RAGE 后能激活細(xì)胞增殖、凋亡，刺激VEGF、TGF-β1過度表達(dá)；也能增強(qiáng)結(jié)腸癌、黑色素瘤、胰腺癌等癌細(xì)胞生成、轉(zhuǎn)移[11-12]。本研究中，通過對結(jié)腸腫瘤患者RAGE、VEGF、TGF-β1表達(dá)水平檢測發(fā)現(xiàn)，RAGE、VEGF、TGF-β1在單純結(jié)腸癌及結(jié)腸腺瘤中的表達(dá)水平明顯低于在結(jié)腸癌合并2 型糖尿病中的表達(dá)水平，這與上述研究結(jié)果基本一致，且分析原因發(fā)現(xiàn)RAGE、VEGF、TGF-β1的高表達(dá)可能與2型糖尿病患者結(jié)腸癌發(fā)病率更高有一定相關(guān)性，且與腫瘤TNM 分期、癌組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等也具有一定相關(guān)性[13]。同時，本研究結(jié)果顯示，RAGE、VEGF、TGF-β1表達(dá)與腫瘤直徑、年齡無關(guān)，與結(jié)腸癌癌細(xì)胞組織遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，高表達(dá)RAGE、VEGF、TGF-β1的患者較低表達(dá)患者更易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這可能是因為高表達(dá)RAGE、VEGF、TGF-β1可有效抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，降低內(nèi)分泌治療及化療的效果，最終發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

此外，通過觀察不同腫瘤患者RFS、OS發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌合并2型糖尿病患者RFS、OS明顯短于結(jié)腸腺瘤組和結(jié)腸癌組，結(jié)腸腺瘤患者明顯短于結(jié)腸癌患者；進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌患者RAGE、VEGF、TGFβ1表達(dá)與RFS、OS 呈負(fù)相關(guān)，表明高表達(dá)RAGE、VEGF、TGF-β1的患者生存期更短。原因可能是高表達(dá)RAGE、VEGF、TGF-β1在腫瘤細(xì)胞生長過程中能抑制細(xì)胞生長因子、周期蛋白活性，從而促進(jìn)腫瘤增殖，同時促進(jìn)血管生成，加速腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步演變，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞快速生成并轉(zhuǎn)移[14-15]。

綜上，RAGE、VEGF、TGF-β1在結(jié)腸癌組織中均有表達(dá)，其與患者生存期呈負(fù)相關(guān)，因此可將其作為診斷結(jié)腸癌、判斷預(yù)后的重要指標(biāo)。