莫怡，卜若晨，唐福波，秦百君，卜保獻(xiàn)，麥威，鐘遠(yuǎn)鳴，卜獻(xiàn)忠

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脊柱骨傷科，廣西 南寧 530023；

2.海南醫(yī)學(xué)院，海南 海口 570102；

3.河南省洛陽正骨醫(yī)院(河南省骨科醫(yī)院)脊柱外科，河南 洛陽 471002；

4.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院中醫(yī)科，廣西 南寧 530021

脊髓損傷(spinal cord injury，SCⅠ)是由于脊髓的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能遭受到創(chuàng)傷、炎癥、缺血缺氧等損傷后，致使損傷脊髓平面以下的運(yùn)動、感覺以及自主神經(jīng)功能出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)性的障礙[1]。僅2001年在全球范圍內(nèi)SCⅠ患病率為15～40例/1 000 000 人[2]，2014年在中國患病率可高達(dá)23.7～60.6 例/1 000 000 人，2018 年僅在美國約28.8 萬病例，同時每年新增加1.7 萬例SCⅠ病例[3]，給患者及家屬造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和心理陰影[4]。

中醫(yī)藥在我國治療脊髓相關(guān)疾病歷史悠久，尤其是SCⅠ的治療已具有豐富的經(jīng)驗(yàn)與較強(qiáng)優(yōu)勢[5]。SCⅠ歸屬于中醫(yī)理論“體惰”、“痿癥”的范疇，其主要病機(jī)應(yīng)歸屬為經(jīng)絡(luò)瘀阻、陽氣不足[6]。補(bǔ)陽還五湯源自清代著名醫(yī)家王清任的《醫(yī)林改錯·下卷·癱痿論》，也是益氣活血通絡(luò)的經(jīng)典方劑。該方是由黃芪、當(dāng)歸尾、赤芍、川芎、紅花、地龍、桃仁等7味中草藥構(gòu)成，臨床中常將其用于治療“半身不遂，遺尿不禁”等疾病。課題組前期研究表明補(bǔ)陽還五湯能夠有效地激活SCⅠ后脊髓細(xì)胞自噬水平，減輕SCⅠ后脊髓神經(jīng)元的損害程度，從而促進(jìn)大鼠運(yùn)動功能的恢復(fù)[7]。脊髓傷方是以補(bǔ)陽還五湯為基礎(chǔ)，加丹參、大黃、牛膝、血竭四味藥材而成，長期臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)該方可增強(qiáng)了原方的活血化瘀通絡(luò)之功，更加符合SCⅠ的病理特點(diǎn)，對頸髓神經(jīng)功能的恢復(fù)具有一定促進(jìn)作用[8]。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)脊髓傷方還可促進(jìn)胸腰椎骨折并截癱患者的下肢運(yùn)動功能恢復(fù)，改善患者的生存質(zhì)量[9]。然而，脊髓傷方治療SCⅠ的分子作用機(jī)制尚不完全清楚。研究表明，脊髓局部缺血缺氧、神經(jīng)遞質(zhì)興奮性中毒、脂質(zhì)過氧化、自由基形成以及炎癥反應(yīng)等因素參與SCⅠ疾病的發(fā)生與發(fā)展過程，在上述因素的作用下誘發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞死亡與軸突脫髓鞘，促進(jìn)膠質(zhì)瘢痕的形成，最終阻礙神經(jīng)細(xì)胞的再生與神經(jīng)功能的修復(fù)[10]。目前，關(guān)于SCⅠ傳統(tǒng)研究方式主要盲目地采用手術(shù)、藥物干預(yù)SCⅠ，以探討其臨床療效或某種作用機(jī)制。顯然，上述研究方式缺乏目的性及全局性。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是現(xiàn)代中藥學(xué)的前沿，也是一種通過構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)的方法來分析中藥復(fù)方與疾病相關(guān)性的一門科學(xué)，其通過將中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與疾病病理機(jī)制有機(jī)結(jié)合起來，充分發(fā)揮中醫(yī)藥治療疾病的多成分、多靶點(diǎn)、多通路等特性，使相關(guān)研究更具有目的性、整體性，這與中醫(yī)藥治療疾病的整體觀念不謀而合[11]，也彌補(bǔ)了傳統(tǒng)研究方式的不足。因此，本研究旨在運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討脊髓傷方治療SCⅠ的有效活性成分、核心作用靶點(diǎn)以及相關(guān)生物信號通路與潛在作用機(jī)制，以期為今后開展相關(guān)臨床和實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 脊髓傷方活性成分及其作用靶點(diǎn)篩選 通過檢索中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(China National Knowledge Ⅰnfrastructure, CNKⅠ)(http://www.cnki.net)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Tradition Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Plaform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)和有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(Biological Activity Database of Small Organic Molecules，PubChem) (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫獲取脊髓傷方的中藥成分，并通過TCMSP、PubChem 等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行化合物確證。TCMSP標(biāo)準(zhǔn)：同時滿足口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(Drug-likeness，DL)≥0.18分析。

1.2 脊髓損傷疾病靶點(diǎn)獲取 以“Spinal cord injury”為檢索詞，運(yùn)用人類基因數(shù)數(shù)據(jù)庫(The Human Gene Database，GeneCard)(https://www.genecards.org/)且滿足Relevance score ≥10、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù) 庫(Online Mendelian Ⅰnheritance in Man，OMⅠM)(https://www.omim.org/)、治療靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(Therapeutic Target Database，TTD)(http://db.idrblab.net/ttd/)數(shù)據(jù)庫檢索獲取與SCⅠ相關(guān)的疾病靶點(diǎn)，并與脊髓傷方的活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，獲取脊髓傷方治療SCⅠ的交集靶點(diǎn)。通過Venny 2.1 平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)平臺進(jìn)行映射取交集，獲取中藥與疾病的交叉作用基因。

1.3 構(gòu)建“活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò) 先將脊髓傷方的有效活性成分及其治療SCⅠ的交集靶點(diǎn)輸入Cytoscape 3.7.2 軟件中，以構(gòu)建“活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。再運(yùn)用Cytoscape 軟件中插件Network Analyzer 進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，分析參數(shù)如分析節(jié)點(diǎn)(Nodes)、連接度值(Degree)等，其中，以Degree 值直接篩選整個網(wǎng)絡(luò)中的最核心活性成分。

1.4 構(gòu)建蛋白互作(Protein Protein Ⅰnteraction network，PPⅠnetwork)網(wǎng)絡(luò) 先將脊髓傷方治療SCⅠ的交集靶點(diǎn)輸入至STRⅠNG 在線數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，以物種選擇為“Homo sapiens”，置信度評分為“High confidence≥0.9”為條件進(jìn)行PPⅠ網(wǎng)絡(luò)分析。再將網(wǎng)絡(luò)相關(guān)作用參數(shù)保存為“tsv”格式文件以及導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，進(jìn)而重新構(gòu)建PPⅠ圖。最后運(yùn)用Cytoscape 軟件中的CytoHubba插件功能對Degree值進(jìn)行排序篩選，以獲得互作能力最強(qiáng)的前10個靶蛋白。

1.5 基因本體(Gene Ontology，GO)功能及京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes，KEGG)通路富集分析 將脊髓傷方治療SCⅠ交集靶點(diǎn)上傳于DAVⅠD 在線平臺(https：//david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行富集分析。以統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性閾值設(shè)置在P＜0.01時，篩選前20個條目，運(yùn)用R語言軟件運(yùn)行相關(guān)程序包和Metascape(https://metascape.org/)對分別核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO與KEGG 富集分析，以闡釋脊髓傷方中活性成分治療SCⅠ的生物功能和相關(guān)信號通路。

1.6 分子對接驗(yàn)證 先將在“活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)核心活性成分(Degree 值排名前5)與在PPⅠ網(wǎng)絡(luò)中潛在核心作用靶點(diǎn)(Degree 值排名前5)進(jìn)行分子對接；再通過結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫研究協(xié)作室數(shù)據(jù)庫(http：//www.rcsb.org/)獲取關(guān)鍵靶點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)，運(yùn)用PyMOL 2.4.0 軟件去除溶劑分子與配體。然后采用Pubchem 數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取活性化合物的三維結(jié)構(gòu)，并運(yùn)用AutoDockTools1.5.6 軟件進(jìn)行加氫、加電子等相關(guān)操作。最后運(yùn)用Autodock-Vina1.1.2 軟件進(jìn)行分子對接。當(dāng)分子結(jié)合能值＜-5 kJ/mol 時采用PyMOL 軟件進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 脊髓傷方治療脊髓損傷的潛在作用靶點(diǎn) 先以O(shè)B、DL 作為條件篩選對TCMSP、PubChem、CNKⅠ數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索及剔重后，最終檢索到138 個活性成分，見表1 (僅列出前10 項(xiàng))。通過TCMSP、PubChem數(shù)據(jù)庫檢索活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)，剔重后收集到490個作用靶點(diǎn)，其中TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索到296 個，Pub-Chem 數(shù)據(jù)庫檢索到517 個。通過OMⅠM、TTD、GeneCards 數(shù)據(jù)庫檢索、剔重后共獲得SCⅠ相關(guān)疾病靶點(diǎn)830 個，其中OMⅠM 數(shù)據(jù)庫101 個、TTD 數(shù)據(jù)庫7 個、GeneCards 數(shù)據(jù)庫745 個。將SCⅠ相關(guān)疾病靶點(diǎn)與脊髓傷方的活性成分作用靶點(diǎn)映射后取交集，上述交集靶點(diǎn)可能是脊髓傷方治療SCⅠ的潛在作用靶點(diǎn)，見圖1。

表1 脊髓傷方主要活性成分的基本信息(前10項(xiàng))Table 1 Basic information of main active ingredients for Jisuishang Formula(Top 10)

圖1 脊髓傷方活性成分作用靶與疾病相關(guān)靶點(diǎn)的韋恩圖Figure 1 Potential therapeutic targets and disease-related targets of Jisuishang Formula in the treatment of spinal cord injury

2.2 脊髓傷方治療脊髓損傷的“活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò) 先將最終檢索到138個活性成分和111個潛在作用靶點(diǎn)上傳至Cytoscape 3.7.2 軟件，初步構(gòu)建脊髓傷方治療SCⅠ的“活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，并Degree值越大，得分越高，則代表圖形面積越大，相互連接的線條越粗，見圖2。上述網(wǎng)絡(luò)中共存在249節(jié)點(diǎn)和776條邊，776個節(jié)點(diǎn)中包括137個活性成分、111 個潛在作用靶點(diǎn)，每個靶點(diǎn)平均與7.0個化合物存在聯(lián)系，每個化合物平均對應(yīng)5.7個靶點(diǎn)存在聯(lián)系，其中槲皮素、木犀草素、山柰酚、漢黃芩素、β-胡蘿卜素與相關(guān)靶點(diǎn)聯(lián)系最緊密，分別與64、30、21、20、16個靶點(diǎn)相互作用，可能是脊髓傷方治療SCⅠ的核心活性成分。

圖2 脊髓傷方治療脊髓損傷的“活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)Figure 2 The network of“active compounds-potential targets”of Jisuishang Formula in the treatment of spinal cord injury

2.3 脊髓傷方治療脊髓損傷的PPⅠ(protein-protein interaction network analysis)網(wǎng)絡(luò) 先將脊髓傷方-SCⅠ共有蛋白基因?qū)隨TRⅠNG在線平臺以初步獲得PPⅠ網(wǎng)絡(luò)，其中上述網(wǎng)絡(luò)共存在111個節(jié)點(diǎn)，2 415條邊，平均degree：43.5，平均聚類系數(shù)：0.705 (圖3A)；再將PPⅠ網(wǎng)絡(luò)原始數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件，重新進(jìn)行PPⅠ網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，Degree 值越大，得分越高，則代表蛋白的圓越大，相互連接的線條越粗，顏色越暖(圖3B)；最后運(yùn)行Cytoscape3.7.2 軟件中Cytohubba 插件，篩選degree 高于平均數(shù)的前10位靶點(diǎn)作為脊髓傷方-SCⅠ的核心靶點(diǎn)，最終獲取白蛋白(albumin，ALB)、白介素6 (interleukin-6，ⅠL-6)、絲氨酸/蘇氨酸激酶1(serine/threonine kinase 1，AKT1)、管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3，CASP3)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、轉(zhuǎn)錄3的信號換能器和激活子(transcription 3，STAT3)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1 (transcription factor AP-1，JUN)、白介素1B (interleukin-1B，ⅠL1B)等核心靶點(diǎn)(圖3)。

圖3 脊髓傷方治療脊髓損傷的PPI網(wǎng)絡(luò)Figure 3 The protein-protein interaction network analysis of Jisuishang Formula in the treatment of spinal cord injury

2.4 GO 功能富集分析 GO 功能富集分析共獲取GO條目2 602個(P＜0.01)，其中生物過程(biological process，BP) 2 330 個、細(xì)胞組分(cellular composition，CC)146 個、分子功能(molecular function，MF)126 個，圖4。BP 主要涉及氧化應(yīng)激反應(yīng)(response to oxidative stress)、凋亡信號通路的調(diào)節(jié)(regulation of apoptotic signaling pathway)、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調(diào)節(jié)(regulation of protein serine/threonine kinase activity)、脂多糖反應(yīng)(regulation of protein serine/threonine kinase activity)、磷酸化(phosphorylation)、活性氧代謝過程(reactive oxygen species metabolic process)等生物過程。CC 富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，關(guān)鍵活性成分主要集中于薄膜筏(membrane raft)、膜微區(qū)(membrane microdomain)、神經(jīng)元細(xì)胞體(neuronal cell body)、線粒體外膜(mitochondrial outer membrane)、血小板α顆粒(platelet alpha granule)、樹突細(xì)胞質(zhì)(dendrite cytoplasm)等部位。MF富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，關(guān)鍵活性成分的生物學(xué)分子功能主要包含脫氧核糖核酸-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(DNA-binding transcription factor binding)、信號受體激活活性(signaling receptor activator activity)、信號受體激活活性(receptor ligand activity)、生長因子結(jié)合(growth factor binding)、蛋白激酶調(diào)節(jié)活性(protein kinase regulator activity)、整合素結(jié)合(integrin binding)等方面。

圖4 脊髓傷方治療脊髓損傷的GO通路富集分析Figure 4 GO enrichment analysis of Jisuishang Formula in the treatment of spinal cord injury

2.5 KEGG生物信號通路 將脊髓傷方治療SCⅠ的核心靶點(diǎn)上傳至Metascape(http://metascape.org/)平臺，以進(jìn)行KEGG 通路富集分析，共獲得條179 生物信號通路路(P＜0.01)，最具有顯著性的前20條，其主要涉及糖尿病并發(fā)癥中晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體信號通路[advanced glycation end product(AGE)-receptor for AGE (RAGE) signaling pathway in diabetic complications]、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B 信號通路[phosphoinositide 3- kinase (PⅠ3K)- protein kinase B(AKT) signaling pathway]、缺氧誘導(dǎo)因子-1 信號通路[hypoxia-inducible factor-1 (HⅠF-1) signaling pathway]、叉頭盒O 信號通路[forkhead box O (FoxO) signaling pathway]、阿佩林信號通路[apelin (AP) signaling pathway]、松弛素信號通路[relaxin(RLX)signaling pathway]、甲狀腺激素信號通路[thyroid hormone(TH)signaling pathway]等，見圖5。

圖5 脊髓傷方治療脊髓損傷的KEGG 通路富集分析Figure 5 KEGG pathway enrichment analysis of Jisuishang Formula in the treatment of spinal cord injury

2.6 分子對接驗(yàn)證 先將PPⅠ網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)ALB、ⅠL6、AKT1、VEGFA、CASP3 與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖中核心活性成分槲皮素、木犀草素、山柰酚、漢黃芩素、β-胡蘿卜素進(jìn)行分子對接。通常認(rèn)為結(jié)合能＜-5.0 kJ/mol，則說明分子配體分子與受體蛋白對接良好，分子構(gòu)像越穩(wěn)定。結(jié)果顯示所有分子對接的結(jié)合能范圍為-17.54 ～-41.01 kJ/mol，表明均具備良好調(diào)節(jié)蛋白活性的功能，見表2。再將上述最小結(jié)合能值導(dǎo)入GraphPad Prism 8 軟件，以構(gòu)建熱圖，見圖6。其中木犀草素與AKT1 結(jié)合能最低為-41.01 kJ/mol，且槲皮素與AKT1 的結(jié)合能也均低于其他配體結(jié)合能，同時將木犀草素、槲皮素與AKT1對接結(jié)果進(jìn)行可視化，見圖7。表明上述活性成分與潛在靶點(diǎn)的分子構(gòu)像存在良好的穩(wěn)定性，它們可能是在脊髓傷方治療SCⅠ中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

表2 脊髓傷方的關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)對接的結(jié)合能Table 2 Binding energy of key active components and key target docking of Jisuishang Formula

圖6 脊髓傷方治療脊髓損傷的核心靶點(diǎn)、活性成分的最低結(jié)合能熱圖Figure 6 Minimum binding energy heat diagram of the key target and active ingredients of Jisuishang Formula in the treatment of spinal cord injury

圖7 槲皮素、異鼠李素與AKT1蛋白分子對接結(jié)果Figure 7 Molecular docking results of quercetin,isorhamnetin,and AKT1 protein

3 討論

研究表明，補(bǔ)陽還五湯因具有抗炎、抗血小板聚集、抗氧化、促進(jìn)血管生新等藥理作用，現(xiàn)臨床中多用于治療神經(jīng)系統(tǒng)性疾病[12]。諸多研究還表明，補(bǔ)陽還五湯能夠通過改善損傷脊髓缺血狀態(tài)、抑制炎癥反應(yīng)、降低氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)脊髓細(xì)胞自噬、減少瘢痕形成等作用，以促進(jìn)脊髓神經(jīng)的恢復(fù)[7，13]。本研究采用的脊髓傷方是由補(bǔ)陽還五湯加入丹參、大黃、牛膝、血竭四味藥材而構(gòu)成，其治療SCⅠ的藥理作用更佳。丹參具有改善脊髓缺血狀態(tài)與脊髓微循環(huán)，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用[14]；大黃具有減輕氧化應(yīng)激損傷，抑制炎癥反應(yīng)等作用，進(jìn)而保護(hù)SCⅠ后殘存的神經(jīng)細(xì)胞和有髓神經(jīng)纖維[15]；牛膝能夠通過抑制腦組織中神經(jīng)炎癥增強(qiáng)神經(jīng)元活力[16]；血竭可以通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的線粒體功能障礙，從而對促進(jìn)軸突再生和改善SCⅠ的運(yùn)動功能發(fā)揮保護(hù)作用[17]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析了脊髓傷方治療SCⅠ的有效活性成分、核心作用靶點(diǎn)、相關(guān)生物信號通路，以揭示其潛在的分子作用機(jī)制。

本研究運(yùn)用數(shù)據(jù)庫挖掘的方法，最終從脊髓傷方中篩選獲得138 個活性成分、111 個靶點(diǎn)，并通過構(gòu)建“活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，分析獲得核心活性成分主要包括槲皮素、木犀草素、山柰酚、漢黃芩素、β-胡蘿卜素。由此推測，上述活性成分可能是脊髓傷方治療SCⅠ的核心藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。槲皮素是一種常見的黃酮類化合物，其能夠通過抑制Toll 樣受體4/核因子-κB 信號通路減少腫瘤壞死因子-α和ⅠL-1β的產(chǎn)生，上調(diào)B細(xì)胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)的表達(dá)，下調(diào)裂解的CASP3的表達(dá)，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、脊髓空洞的形成以及膠質(zhì)瘢痕增生[18]，還能夠通過抑制絲裂原活化蛋白激酶信號通路的活化，抑制受損脊髓膠質(zhì)瘢痕的形成，促進(jìn)受損脊髓組織中軸突再生[19]。木犀草素作為一種天然的多酚類類黃酮化合物，其通過有效增強(qiáng)抗氧化活性，緩解了線粒體腫脹，抑制SCⅠ后促炎細(xì)胞因子的釋放與脊髓神經(jīng)細(xì)胞的凋亡等作用，進(jìn)而減輕脊髓病理損傷的程度[20-21]。山奈酚是一種重要的黃酮類化合物，其能夠通過下調(diào)活性氧依賴性MAPKs-NF-κB和慢視信號通路以抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)SCⅠ后下肢運(yùn)動功能的修復(fù)[22]。漢黃芩素素具有顯著的抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡、保護(hù)神經(jīng)等多種特性，其通過抑制STAT3信號通路能夠抑制炎癥和細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)SCⅠ的作用[23]。β-胡蘿卜素(Beta-carotene)素是類胡蘿卜素之一，其通過抑制/核因子-κB信號通路途徑激活，能夠減輕腫瘤壞死因子-α、ⅠL-1β、環(huán)加氧酶-2的表達(dá)量，進(jìn)而抑制脊髓中星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，同時下調(diào)丙二醛、一氧化氮和超氧化物歧化酶的表達(dá)，緩解SCⅠ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，最終有效地減少了SCⅠ后繼發(fā)性損傷事件的惡性進(jìn)展[24]。

本研究通過對脊髓傷方治療SCⅠ的潛在作用靶點(diǎn)PPⅠ網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治黾昂Y選，獲取到ALB、ⅠL-6、AKT1、VEGFA、CASP3、EGFR、EGF、JUN、ⅠL1B 以及STAT3等潛在核心靶點(diǎn)。膠質(zhì)細(xì)胞活化、脊髓膠質(zhì)瘢痕的形成、軸突再生障礙、神經(jīng)元凋亡等在SCⅠ的發(fā)生與發(fā)展過程中起著重要作用。白蛋白(ALB)是星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生油酸(oleic acid，OA)所必需的，經(jīng)ALB-OA治療后能夠抑制NR1 NMDA 受體磷酸化和小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性，促進(jìn)樹突與軸突生長，增加背角和腹角內(nèi)的血清素纖維神經(jīng)支配區(qū)[25-26]。小膠質(zhì)細(xì)胞極化伴M1/M2 表型偏移是SCⅠ誘導(dǎo)的繼發(fā)性損傷的重要促成因素，通過STAT1介導(dǎo)的核因子-κB 信號途徑乙?；{(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞極化能夠下調(diào)ⅠL-1β、ⅠL-6等促炎因子的表達(dá)水平，從而減弱炎癥反應(yīng)，起到神經(jīng)保護(hù)的作用[27]。信號通路中的AKT1在神經(jīng)元凋亡中起著重要作用，上調(diào)AKT1的表達(dá)能夠有效減輕神經(jīng)損傷，抑制軸突變性[28]。VEGFA被認(rèn)為與血管生成，神經(jīng)發(fā)生和運(yùn)動能力的改善有關(guān)，通過增加VEGFA、血小板衍生生長因子B、血管生成素-1的表達(dá)量，可以增加內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞的增殖和存活率，進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)SCⅠ后軸突再生的作用[29]。CASP-3 是Caspases 家族中最重要的細(xì)胞凋亡執(zhí)行者之一，其在SCⅠ發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，通過降低CASP-3表達(dá)量，可以降低脊髓細(xì)胞的凋亡水平，從而發(fā)揮促進(jìn)自發(fā)排尿和運(yùn)動功能恢復(fù)的作用[30]。

KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)，脊髓傷方治療SCⅠ的主要通路GE-RAGE 信號通路、PⅠ3K-AKT 信號通路、HⅠF-1信號通路等信號通路。AGE修飾的周圍神經(jīng)髓鞘能夠促進(jìn)神經(jīng)節(jié)段性脫髓鞘，當(dāng)晚期糖基化終產(chǎn)物對主要軸突細(xì)胞骨架蛋白的修飾時能夠引起軸突變性和軸突轉(zhuǎn)運(yùn)受阻，AGEs 和AGE/RAGE 相互作用下可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、誘導(dǎo)促炎反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致節(jié)段性脫髓鞘以及軸突功能障礙，故有效地調(diào)節(jié)AGEs-RAGE軸在緩解糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用[31-32]。PⅠ3K-AKT 軸是調(diào)控脊髓細(xì)胞自噬、凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要信號通路之一，有效地調(diào)控PⅠ3K-AKT軸能夠上調(diào)脊髓組織中自噬相關(guān)基因6、Bcl-2的表達(dá)水平，下調(diào)CASP-3、ⅠL-6、ⅠL-1β、磷酸肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PⅠ3K)、AKT的表達(dá)水平，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)SCⅠ的作用[33-34]。缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HⅠF-1)參與了SCⅠ后新生血管形成、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬、軸突再生等生理病理過程，激活HⅠF-1 信號通路可誘導(dǎo)脊髓細(xì)胞自噬，抑制細(xì)胞凋亡，改善神經(jīng)生存的微環(huán)境，最終發(fā)揮促進(jìn)神經(jīng)軸突再生的作用[35]，當(dāng)激活HⅠF-1/VEGF 信號通路時能夠促進(jìn)SCⅠ后新生血管形成、改善缺氧缺血狀態(tài)，進(jìn)而促進(jìn)大鼠SCⅠ后神經(jīng)功能的修復(fù)[36]。骨骼肌萎縮是嚴(yán)重SCⅠ的標(biāo)志，由神經(jīng)損傷和麻痹誘發(fā)。叉頭轉(zhuǎn)錄因子(forkhead box O，F(xiàn)oXO)的哺乳動物叉頭成員參與各種信號通路，F(xiàn)oxO信號通路與肌細(xì)胞凋亡、骨骼肌自噬和萎縮有關(guān)，說明FoxO信號通路可能參與了SCⅠ后骨骼肌萎縮的進(jìn)展過程[37]。阿佩林(apelin，AP)一種結(jié)合G蛋白偶聯(lián)受體血管緊張素樣受體1 的內(nèi)源性配體，有效地調(diào)控Apelin 信號通路能夠抑制脊髓細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞自噬、炎癥反應(yīng)(小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化)，對SCⅠ具有一定保護(hù)作用[38-39]。松弛素(relaxin，RLX)被認(rèn)為是一種卵巢多肽激素,其通過調(diào)控PⅠ3K-AKT 信號通路能夠增加交感神經(jīng)活動[40]，進(jìn)而誘發(fā)腦室旁核中棘突神經(jīng)元的激活[41]，這也可能是其對脊髓神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)揮了激活作用。少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和存活軸突的脫髓鞘是SCⅠ繼發(fā)損傷的重要因素之一。研究表明，甲狀腺素信號(thyroid hormone，TH)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，當(dāng)良性調(diào)控TH信號通路時能夠增強(qiáng)SCⅠ后的少突突形成和髓鞘形成[42]。

分子對接結(jié)果顯示，PPⅠ網(wǎng)絡(luò)中ALB、ⅠL-6、AKT1、VEGFA、CASP3與脊髓傷方中槲皮素、木犀草素、山柰酚、漢黃芩素、β-胡蘿卜素相互之間的分子對接的結(jié)合能范圍為-17.54 ～-41.01 kJ/mol，均小于-5.0 kJ/mol。其中，槲皮素、異鼠李素均與AKT1之間存在較強(qiáng)的親和力。因此，筆者認(rèn)為上述化合物與上述靶點(diǎn)蛋白的分子構(gòu)象存在較好的穩(wěn)定性及結(jié)合活性，但其余化合物對于SCⅠ的治療活性究竟如何還需要更深入探討，并佐以生物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，脊髓傷方可能是通過槲皮素、木犀草素、山柰酚、漢黃芩素、β-胡蘿卜素等核心活性成分，作用于ALB、ⅠL-6、AKT1、VEGFA、CASP3、EGFR、EGF、JUN、ⅠL1B 以及STAT3 等潛在核心靶點(diǎn)，進(jìn)而參與細(xì)胞對氧化應(yīng)激反應(yīng)、凋亡信號通路的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調(diào)節(jié)、細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)等生物過程，最終通過調(diào)控AGE-RAGE、PⅠ3K-AKT、HⅠF-1、FoxO、AP、RLX、TH等信號通路，發(fā)揮治療SCⅠ的作用。本研究通過利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析了脊髓傷方治療SCⅠ的潛在有效成分、靶點(diǎn)蛋白、信號通路及相關(guān)分子作用機(jī)制，進(jìn)一步證實(shí)了中藥復(fù)方能夠從多靶點(diǎn)、多通路干預(yù)疾病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后，為我們研究中醫(yī)藥干預(yù)SCⅠ提供了新的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。