覃飛，徐旻霄，崔書強，瞿超藝，董亞南，趙杰修*

運動保護PM2.5暴露導致的大鼠肺部損傷：GSK3β介導的eHSP70/iHSP70平衡機制研究

覃飛1, 2, 3，徐旻霄4，崔書強5，瞿超藝2，董亞南5，趙杰修2*

（1. 暨南大學 體育學院，廣東 廣州 510032；2. 國家體育總局體育科學研究所，北京 100061；3. 暨南大學 廣東省速度能力研究重點實驗室，廣東 廣州 510032；4. 首都體育學院 體育教育訓練學院，北京 100191； 5. 北京市體育科學研究所，北京 100075）

探討長期運動對亞急性PM2.5暴露致大鼠肺臟損傷的保護效應及GSK3β介導的eHSP70/iHSP70平衡機制。32只Wistar大鼠（雄性，8周齡）隨機分為4組（8只/組），即安靜對照組（sedentary，S）、運動訓練組（exercise，E）、安靜＋PM2.5暴露組（sedentary＋PM2.5exposures，S＋PM2.5）和運動＋PM2.5暴露組（exercise ＋PM2.5exposures，E＋PM2.5）。E組和E＋PM2.5組大鼠進行8周跑臺運動（60 min/次、5次/周）；運動結束后，S＋PM2.5組和E＋PM2.5組進行3周亞急性PM2.5暴露染毒（7天/周，6 h/d）；暴露結束后，采用全身體描箱測試肺功能。24 h后采集大鼠肺臟、血漿及肺灌洗液，檢測肺灌洗液中炎癥因子（TNF-α、IL-1α、IL-6）及血漿eHSP70含量；觀察肺臟組織形態(tài)結構；采用免疫印跡法檢測肺臟iHSP70、TLR-4、NF-κB p65、IκBα、p-IκBα、IKKβ、p-IKKβ、P38、p-P38、HSF1、p-HSF1ser303、GSK3β和p-GSK3βser9通路蛋白分泌水平。研究發(fā)現，暴露染毒后肺組織出血，大量炎性細胞聚集在肺泡腔，肺泡間隔增厚。與S組相比，S＋PM2.5組肺功指標MV、TV、EF50、PIF、PEF顯著更低，PAU和Te顯著更高；肺灌洗液TNF-α、IL-1α和IL-6、血漿eHSP70顯著更高；肺組織iHSP70顯著更低，相關通路中TLR-4、NF-κB p65、p-IκBα、IKKβ、p-IKKβ、GSK3β、p-P38和p-HSF1ser303蛋白水平顯著更高，IκBα、HSF1、p-GSK3βser9顯著更低。與S＋PM2.5組相比，E＋PM2.5組肺組織局部的出血情況、炎性浸潤程度均明顯改善；肺功指標TV、MV、EF50、PIF、PEF顯著更高，PAU和Te顯著更低；肺灌洗液IL-1α、TNF-α、IL-6和血漿eHSP70分泌水平顯著更低；肺組織iHSP70顯著更高，相關通路中TLR-4、NF-κB p65、p-IκBα、IKKβ、p-IKKβ、GSK3β、p-P38和p-HSF1ser303蛋白水平顯著更低，IκBα、HSF1、p-GSK3βser9顯著更高。研究認為，長期規(guī)律性運動可下調大鼠肺上皮細胞P38MAPK磷酸化水平，可能通過增加GSK-3β磷酸化使GSK3β失活，增加HSF1分泌水平，上調iHSP70，改善大氣顆粒物所致的呼吸系統(tǒng)炎癥機體的eHSP70/iHSP70平衡紊亂，進而阻斷TLR-NFκB炎癥信號通路，抑制炎癥。

運動；PM2.5；顆粒物；肺損傷；炎癥；HSP70

顆粒物是空氣污染的首要污染物，會造成廣泛的健康危害。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）2021年發(fā)布的《全球空氣質量指南》明確指出，空氣污染是影響全球人類健康的主要因素?！丁敖】抵袊?030”規(guī)劃綱要》也突出強調，要加強對影響健康的環(huán)境問題治理與健康風險管理。已有大量證據表明，可吸入顆粒物會引發(fā)呼吸道炎癥、哮喘、肺癌和心血管疾病等，而且細顆粒物（particulate matter 2.5，PM2.5）還能夠以呼吸道為效應靶點，激活局部炎癥因子并引發(fā)炎癥級聯反應，導致機體的系統(tǒng)性炎癥，進而增加阿爾茨海默病等神經系統(tǒng)損傷，以及肥胖和胰島素抵抗等代謝性疾病的發(fā)生風險（Paul et al.， 2018；Roberts et al.， 2014）。因此，探究可吸入顆粒物對健康的影響及其相關防御措施至關重要。

運動作為一種綠色的非藥物干預手段，可以防治多種慢性疾病。已有研究表明，運動中每分通氣量（minute volume，MV）增加，在高濃度顆粒物污染下可導致更多顆粒物進入機體，增加污染物暴露風險（覃飛等， 2020）。也有研究表明，長期規(guī)律性的運動健身產生的有益效應可抵抗顆粒物造成的機體急性損傷。即“運動促進健康”和“空氣污染危害健康”兩者之間可能存在著一個平衡點（Giles et al.， 2014；Roberts et al.， 2014）。相關研究表明，在空氣污染或霧霾周期開始前進行有規(guī)律的4～8周運動健身訓練，可在一定程度上預防空氣污染導致的機體急性損傷、抑制炎癥的發(fā)生發(fā)展（Nesi et al.， 2016；Qin et al.， 2021；Yu et al.， 2012）。但是空氣污染、運動和健康三者間相互作用的現象機制尚待分析與揭示。運動是否可以有效防御可吸入顆粒物對健康的危害？何種運動方案可產生良好的保護效應？運動保護顆粒物污染所致的機體損傷的相關機制是什么？這些問題尚待進一步清晰闡明，以響應以防病為重點目標的公共衛(wèi)生干預理念，保障運動健身的安全合理。

熱休克蛋白（hot shock proteins 70，HSP70）被稱為“應激蛋白”，與環(huán)境應激（Baldissera et al.， 2018）和運動（Kostrycki et al.， 2019）密切相關。近年來的研究發(fā)現HSP70具有多種相互拮抗的功能，其功能差異依賴于其所存在的部位不同，即細胞內或細胞外（Krause et al.， 2015）。細胞內HSP70（intracellular HSP70，iHSP70）可誘導NF-?κB失活，并發(fā)揮重要的抗炎作用（Heck et al.， 2017）；而細胞外HSP70（extracellular HSP70，eHSP70）具有促炎效應，其可與Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）結合，進而激活NF-κB炎癥通路（Asea et al.， 2002）。大量證據亦表明顆粒物暴露后，機體eHSP70含量升高，并且與呼吸道炎癥的發(fā)生密切相關（Sancini et al.， 2014）。因此，eHSP70與iHSP70的比率，又稱“H指數”，可以作為空氣污染引起的炎癥的生物標志物。此外，規(guī)律性體育鍛煉會降低eHSP70分泌水平并提高iHSP70表達（Bittencourt et al.， 2017；Krause et al.， 2015）。由此推斷，運動可調控或維持eHSP70/iHSP70的平衡，進而抵抗顆粒物污染等致病因素，維持機體健康。然而運動對HSP70細胞內外平衡的影響及其相關機制尚不明晰。

運動誘導的iHSP70的增多可增強細胞內的抗炎作用。HSP70的合成調節(jié)主要發(fā)生在基因轉錄水平，由熱休克轉錄因子（heat shock transcription factors，HSFs）家族調控，其中HSF1是HSP的主要調控因子（Akerfelt et al.， 2010）。而糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK3β）作為體內大量代謝酶和轉錄因子的調控因子，被認為是控制轉錄因子激活的“看門人”，可使HSF1在ser303位點發(fā)生磷酸化，維持細胞質中HSF1處于無活性狀態(tài)，進而減少HSP的合成（Hietakangas et al.， 2006）。相關研究已在心?。∕artherus et al.， 2016）、神經（Liu et al.， 2013）、骨骼肌（Léger et al.， 2006）等不同組織內發(fā)現急性運動和慢性運動均可以不同程度地下調GSK3β。因此，推斷GSK3β可能是運動調控HSF1的關鍵靶點之一。而運動是否可以通過降低GSK3β活性進而緩解其對HSF1的抑制作用，促進iHSP70的合成，影響eHSP70/iHSP70平衡，有待進一步研究。

綜上所述，本研究采用濃縮富集全身暴露系統(tǒng)模擬大氣暴露的真實環(huán)境，首先對大鼠進行8周的運動干預，隨后施加亞急性（21天）PM2.5暴露，評估長期規(guī)律性運動對顆粒物暴露大鼠肺臟損傷的保護效應，并進一步檢測GSK3β和eHSP70/iHSP70平衡介導的HSP/TLR/NF-κB炎癥信號通路，以明確長期規(guī)律性運動對亞急性PM2.5暴露導致的肺組織損傷的保護效應及其相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級8周齡Wistar 鼠32只，購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司［許可證號：SCXK（京）2016-0006］。自由飲食，12 h/12 h晝夜循環(huán)，室溫（23±2）℃。實驗程序嚴格遵守國家體育總局體育科學研究所倫理委員會要求（編號：CISSLA-2017003）。大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為安靜對照組（sedentary， S）、運動干預組（exercise， E）、安靜對照＋PM2.5暴露組（sedentary＋PM2.5exposures， S＋PM2.5）和運動干預＋PM2.5暴露組（exercise＋PM2.5exposures，E＋PM2.5），每組8只。

1.2 運動方案

所有運動干預組進行8周間歇性跑臺訓練。間歇性跑臺訓練方案依據Jiang等（2014）的間歇訓練方案，先以50%～55%V?O2max對應的跑臺速度進行5 min熱身，隨后進行4 min的高強度運動（80%～90%V?O2max），再進行3 min低強度運動（65%～70%V?O2max），并循環(huán)重復7次，最后以50%～55%V?O2max的對應速度進行5 min的整理運動后結束訓練。運動干預5天/周，1 h/天。使用大鼠代謝監(jiān)測系統(tǒng)（Columbus，美國）采集大鼠運動中的攝氧量數據，以確定運動強度所對應的跑臺速度（Qin et al.， 2020a）。每2周測定一次最大攝氧量，調整運動強度。

1.3 PM2.5 顆粒物暴露方案

8周運動訓練后，S＋PM2.5和E＋PM2.5組的大鼠采用PM2.5在線濃度富集系統(tǒng)進行全身暴露染毒。暴露時間為2018年10月15日—11月5日，6 h/天，連續(xù)染毒21天。S和E組大鼠飼養(yǎng)在獨立通風籠飼養(yǎng)系統(tǒng)中，PM2.5濃度為0。使用DUSTTARK II-8530（TSI，美國）測試儀器實時檢測暴露艙內PM2.5濃度。在暴露期間，根據美國環(huán)境保護署對于采樣標準流程的規(guī)定采集艙內氣體樣本（采樣氣流0.17 L/min），應用氣相色譜-質譜聯用法（GC-MS）分析PM2.5暴露期間16種多環(huán)芳烴。使用電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS）對鉻（Cr）、銅（Cu）、鎘（Cd）、鎳（Ni）、錳（Mn）、鋅（Zn）和砷（As）等金屬成分進行定量。為了監(jiān)測暴露倉中存在的潛在有害生物因素，在暴露倉中安置哨兵鼠，并對其進行微生物檢查。

1.4 肺功能測試

采用FinePointe WBP全身體積描積系統(tǒng)（BUXCO Research Systems，美國）測試各組大鼠呼吸功能變化。將大鼠放入檢測室適應20 min，測試全程保持環(huán)境安靜。采集呼吸頻率（frequency，F）、MV、潮氣量（tidal volume，TV）、呼氣中期流速（expiratory flow 50，EF50）、暫時停頓（pause，PAU）、吸氣時間（inspiration time，Ti）、呼氣時間（expiration time，Te）、吸氣流峰值（peak inspiratory flow，PIF）、呼氣流峰值（peak expiratory flow，PEF）等指標。

1.5 樣品采集

染毒結束后24 h取材，所有大鼠禁食12 h。稱重后，麻醉大鼠。打開大鼠腹腔，于腹主動脈取血。大鼠處死后開胸結扎左側主支氣管，用2 ml 4 ℃生理鹽水反復灌注右側主支氣管并回抽，回抽率50%～80%，獲取支氣管肺泡灌洗液，將灌洗液在3 000 r/min轉速下離心10 min，上清液分裝并保存在-20 ℃冰箱中待測。

1.6 光鏡測試

肺臟組織用中性甲醛固定48 h后，樣品通過梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋等步驟制成切片（5 μm）。肺組織切片用蘇木精-伊紅（H&E）染色，用光學顯微鏡（200×?和400×?）觀察。采用急性肺損傷評分標準進行量化評價。

1.7 酶聯免疫試驗

采用酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測量肺灌洗液中IL-1a、TNF-α、IL-6及血漿中HSP70含量，并測試肺灌洗液中蛋白含量。檢測步驟按照試劑盒說明書進行。

1.8 蛋白印跡（Western blotting）法

RIPA試劑盒用于提取肺組織樣品的總蛋白，并進行BCA蛋白定量。隨后進行電泳、轉膜、封閉、孵育一抗等步驟，各指標一抗孵育濃度如下：TLR-4（1∶4 000）、iHSP70（1∶2 000）、P38（1∶2 000）、p-P38（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶1 000）、IκBα（1∶500）、p-IκBα（1∶1 000）、IKKβ（1∶1 000）、p-IKKβ（1∶1 000）、HSF1（1∶1 000）、p-HSF1ser303（1∶2 000）、GSK3β（1∶4 000）、p-GSK3βser9（1∶500）、β-actin（1∶10 000）。一抗4 ℃孵育過夜后，用TBST緩沖液洗5 min×3次，孵育山羊抗兔/小鼠二抗（1∶10 000）40 min后，TBST洗滌膜5 min×3次。使用增強化學發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒觀察免疫反應帶。采用ImageJ軟件分析積分光密度（integrated optical density，IOD）值。

1.9 eHSP70和iHSP70的測量和eHSP70/iHSP70的計算

利用ELISA檢測血漿中eHSP70含量。通過蛋白印跡法檢測肺組織中iHSP70的表達。將安靜對照組eHSP70/iHSP70設為基線值（Kostrycki et al.， 2019， Qin et al.， 2021a），實驗組應激狀態(tài)下的eHSP70/ iHSP70比值為各組值相對于基線值的商。

1.10 統(tǒng)計分析

所有實驗數據均采用SPSS 22.0軟件進行分析，數據用平均數±標準差（±）表示。各項數據進行正態(tài)分布和方差齊性檢驗后，采用雙因素方差分析進行主效應和交互效應分析；當交互效應具有統(tǒng)計學意義時，進一步采用單因素方差分析進行簡單效應分析，并采用LSD（方差齊性）或Dennett’s T3（方差不齊性）法進行各組間的兩兩比較。變量變換后仍為非正態(tài)分布資料時，應用Kruskal-Wallis Test進行非參數檢驗，顯著性水平?。?.05。此外，計算Cohen’s效應量（effect size，ES）雙重檢驗顯著性（組間兩兩比較），＞0.2為小效應，ES＞0.5為中效應，ES＞0.8為大效應（Lakens， 2013）。

2 實驗結果

2.1 可吸入顆粒物暴露濃度及顆粒物成分

PM2.5暴露21天，暴露倉內平均濃度變化為（237.01±206.41）μg/m3，最高日平均暴露濃度為651.35 μg/m3，最低日平均暴露濃度為20.95 μg/m3。其中，輕度污染4天，中度污染以上11天，其余為優(yōu)和良好。根據我國PM2.5檢測網的空氣質量標準，倉內平均濃度相當于重度空氣污染濃度。利用GC-MS和ICP-MS檢測艙內重金屬和多環(huán)芳烴含量，結果見表1。此外，通過監(jiān)測室內的潛在有害生物進行衛(wèi)生監(jiān)督，實驗期間暴露倉內、飼養(yǎng)環(huán)境所有微生物結果均為陰性。

2.2 肺功能檢測結果

利用FinePointe WBP檢測各組肺通氣、肺容量、肺阻塞程度及傳導性（呼吸肌力量）相關指標。顆粒物暴露3周后，與S組相比，S＋PM2.5組大鼠MV（＜0.05，=1.79；圖1B）、TV（＜0.05，=2.06；圖1C）、EF50（＜0.05，=1.68；圖1G）、PIF（＜0.05，=1.78；圖1H）、PEF（＜0.05，=1.81；圖1I）顯著更低， PAU（＜0.05，=1.67；圖1D）和Te（＜0.05，=1.31；圖1E）顯著更高。上述結果表明，PM2.5可導致肺通氣功能（TV和MV）下降，氣道阻塞程度（EF50、PAU和Te）加重，呼吸肌力量（PIF和PEF）減弱。

與S＋PM2.5組相比，E＋PM2.5組大鼠的MV（＜0.05，=1.11；圖1B）、TV（＜0.05，=1.33；圖1C）、EF50（＜0.05，=1.10；圖1G）、PIF（＜0.05，=1.46；圖1H）、PEF（＞0.05；=0.91；圖1I）顯著更高；PAU（＞0.05，=0.72；圖1D）和Te（＜0.05，=1.09；圖1E）顯著更低。由此可見，8周運動訓練可減輕PM2.5引起的肺功能障礙，尤其是顆粒物污染導致的肺通氣功能下降、呼吸道梗阻和呼吸肌力下降。

注：*P＜0.05；下同。

Figure 1.Effects of Exercise on Pulmonary Function in Rats with PM2.5Exposure

2.3 肺組織形態(tài)學改變

通過肺組織染色評估各組大鼠肺臟形態(tài)結構的損傷程度，S組（圖2A）和E組（圖2B）大鼠肺泡結構完整，肺動脈管壁層次清晰、平滑，無異常。小支氣管、終末細支氣管黏膜平整，沒有硬化現象。S＋PM2.5組（圖2C）大鼠肺臟出現出血，大量炎性細胞聚集在肺泡腔、肺動脈、支氣管以及終末細支氣管管壁外周，肺泡間隔增厚，局部出血并存在膿液填充，肺動脈血管壁明顯增厚（圖2F）；產生了組織炎癥，部分肺組織出現明顯的纖維化，部分支氣管黏膜結構不完整并出現脫落（圖2E）。與S＋PM2.5組（圖2C）相比，E＋PM2.5（圖2D）組大鼠肺部整體結構完整，肺組織局部的出血情況、炎性浸潤程度和血管壁的病變程度均明顯改善。雖仍可見肺泡內有膿液、淋巴細胞、巨噬細胞填充，但肺泡結構總體較清晰（圖2D）。此外，采用肺損傷評分進行半定量分析，S＋PM2.5組的肺損傷評分顯著高于S組（＜0.05，=3.80）和E＋PM2.5組（＜0.05，=2.46；圖2G）。

2.4 大鼠肺臟相關炎癥因子及eHSP70/iHSP70比值

與S組相比，S＋PM2.5組大鼠肺臟TNF-α（＜0.05，=2.12；圖3A）、IL-1α（＜0.05，=1.37；圖3B）和IL-6（＜0.05，=2.21；圖3C）均顯著更高。與S＋PM2.5組相比，E＋PM2.5組大鼠TNF-α（＜0.05，=1.37；圖3A）、肺臟IL-1α（＜0.05，=1.27；圖3B）、IL-6（＜0.05，=1.12；圖3C）分泌水平顯著更低。上述指標變化表明8周運動可有效抑制可吸入顆粒物導致的肺部炎癥。

Figure 2.Effects of Exercise on Lung Photomicrographs in Rats with PM2.5Exposure

注：A.S組；B.E組；C.S＋PM2.5組；D.E＋PM2.5組；E.氣管黏膜脫落出血、炎性浸潤；F.肺組織纖維化為肺動脈血管壁明顯增厚；G.急性肺損傷病理評分組間比較。

圖3 運動對PM2.5致大鼠炎癥程度的影響

Figure 3.Effects of Exercise on Inflammation in Rats with PM2.5Exposure

此外，進一步分析各組eHSP70和iHSP70的表達及eHSP70/iHSP70發(fā)現，與S組相比，S＋PM2.5組大鼠eHSP70分泌水平（＜0.05，=1.35；圖3C）和eHSP70/iHSP70（＜0.05，=2.68；圖3F）顯著更高，iHSP70（＜0.05，=1.19；圖3D、3G）顯著更低。與S＋PM2.5組相比，E＋PM2.5組大鼠eHSP70分泌水平（＞0.05，=0.84；圖3C）和eHSP70/iHSP70（＜0.05，=1.59；圖3F）顯著更低，iHSP70分泌水平（＜0.05，=0.86；圖3E、3G）顯著更高。提示，長期規(guī)律性運動可激活機體的抗炎狀態(tài)，有效扭轉eHSP70/iHSP70平衡紊亂，且以上調iHSP70為主。

2.5 TLR-4/NF-κB信號通路相關蛋白

各組大鼠肺臟TLR-4/NF-κB信號通路相關調節(jié)蛋白水平如圖4所示。與S組相比，S＋PM2.5組大鼠TLR-4（＜0.05，=1.11；圖4A、4G）、NF-κB p65（＜0.05，=1.01；圖4B、4G）、p-IκBα （＞0.05，=0.85；圖4D、4G）、IKKβ（＜0.05，=0.89；圖4E、4G）和p-IKKβ（＜0.05，=1.64；圖4F、4G）均顯著更高，IκBα（＞0.05，0.05；圖4C、4G）顯著更低。與S＋PM2.5組相比較，E＋PM2.5組大鼠肺臟TLR-4（0.05，=0.77；圖4A、4G）、NF-κB p65（＜0.05，=1.11；圖4B、4G）、p-IκBα（＜0.05，=1.28；圖4D、4G）、IKKβ（＜0.05，=1.37；圖4E、4G）和p-IKKβ（＜0.05，=1.55；圖4F、4G）分泌水平顯著更低，IκBα（＞0.05=1.16；圖4C）分泌水平顯著更高。綜上所述，長期規(guī)律性運動可下調有害應激時細胞外與細胞內HSP70比值，抑制TLR-4/NF-κB信號通路。

圖4 運動和顆粒物暴露對大鼠eHSP70/iHSP70介導的TLR-4/NF-κB信號通路的影響

Figure 4.Effects of Exercise and PM2.5on the Extracellular-to-Intracellular HSP70 Ratio Mediated TLR-4/NF-κB Signaling Pathways in Rats

2.6 P38MAPK-GSK3β-HSF1調控途徑相關蛋白

蛋白印跡法結果顯示，與S組相比，S＋PM2.5組大鼠肺臟P38磷酸化水平（＜0.05，=1.04；圖5B、5G）、GSK3β（＜0.05，=1.18；圖5C、5G）和HSF1ser303磷酸化水平（＜0.05，=1.77；圖5F、5G）均顯著更高，GSK3βser9磷酸化水平（＜0.05，=1.16；圖5D、5G）及HSF1（＜0.05，=0.97；圖5E、5G）顯著更低。與S＋PM2.5組相比，E＋PM2.5組大鼠肺臟p-GSK3βser9水平（＜0.05，=1.15；圖5D、5G）及HSF1（＜0.05，=1.10；圖5E、5G）顯著更高，GSK3β（＜0.05，=1.18；圖5C、5G）、p-P38（＞0.05，=0.91；圖5B、5G）和p-HSF1ser303（＜0.05，=1.71；圖5F、5G）分泌水平顯著更低。綜上所述，長期規(guī)律性運動可通過抑制GSK3β激活HSF1進而促進iHSP70生成，抵抗顆粒物污染時導致的肺部急性炎癥損傷，可能是運動產生良好效應的重要靶點。

3 分析與討論

明確運動對大氣顆粒物所致的肺臟急性損傷的保護效應及其機制，在大氣環(huán)境質量未能得到有效控制的情況下，對于增強群眾健康防病意識，建立良好的健身習慣具有非常重要的意義。前期研究發(fā)現，8周中等強度有氧運動可有效保護14天亞急性PM2.5暴露所致的老年大鼠肺臟損傷（Qin et al.， 2021a），8周有規(guī)律運動可有效保護一次性中度（269.31±30.79）μg/m3、重度（509.84±36.74）μg/m3PM2.5污染所致的成年大鼠肺部急性損傷，抵抗炎癥和氧化應激（Qin et al.， 2020b）。本研究進一步探析了長期運動保護亞急性PM2.5暴露所致的大鼠肺部損傷的作用機制。

3.1 染毒方式及空氣成分

鑒于傳統(tǒng)氣管滴注方式的有創(chuàng)性、染毒濃度較大、暴露方式難以與實際顆粒物暴露環(huán)境相對應，以及暴露期間實驗動物產生較大的應激和感染風險等（庫婷婷， 2017）原因，本研究選取全身暴露濃縮富集染毒方式，該方法無創(chuàng)且能夠更好地模擬現實空氣暴露環(huán)境，有效減少動物應激反應（Allen et al.， 2014；Sioutas et al.， 1995）。研究已證實不同時長的全身暴露染毒系統(tǒng)處理可導致呼吸系統(tǒng)、內分泌系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、神經系統(tǒng)損傷及病變（Chu et al.， 2019；Li et al.， 2019），說明其可作為可吸入顆粒物影響健康的相關研究的實驗處理方法。

圖5 運動和顆粒物暴露對大鼠GSK3β調控iHSP70的影響

Figure 5.Effects of Exercise and PM2.5on GSK3β Regulating iHSP70 in Rats

鑒于霧霾具有周期性和季節(jié)性，本研究選擇暴露周期為21天的亞急性染毒實驗，21天暴露倉內的PM2.5濃度變化模擬了我國北方京津冀地區(qū)初冬的大氣污染狀況。研究結果表明，與安靜對照組相比，亞急性PM2.5暴露3周后，S＋PM2.5大鼠出現明顯氣道阻塞、呼吸肌力量下降、支氣管黏膜脫落、細支氣管周圍中性粒細胞浸潤、肺血管管腔狹窄，肺灌洗液中促炎因子（TNF-α、IL-1α和IL-6）分泌水平顯著升高。Li等（2019）和Yang等（2018）的實驗亦表明亞急性PM2.5暴露可導致肺組織損傷。

PM2.5暴露導致的肺損傷與PM2.5的濃度、持續(xù)時間和成分有關（Ning et al.， 2019）。鑒于此，本研究分析了暴露倉內PM2.5的成分含量，發(fā)現暴露倉內多環(huán)芳烴以菲為主，其次為芴和苊。已有研究表明，低水平多環(huán)芳烴暴露與青年人群肺功能降低有關（Alhamdow et al.， 2021）。菲暴露可誘發(fā)大鼠肺臟和肝臟組織氧化應激和炎癥（Ma et al.， 2020）。使用ICP-MS法測試暴露倉內與機體健康相關的重金屬含量發(fā)現，Zn、Mn和Cu為含量最高的3種重金屬元素。PM2.5中的重金屬、多環(huán)芳烴類物質與肺損傷及病變的發(fā)展密切相關（Ning et al.， 2019；Qin et al.， 2021a）。相關研究發(fā)現，普遍存在的有毒重金屬（如Zn、Cr等）可激活肺組織的氧化應激和炎癥（Ma et al.， 2020；Maret， 2012），PM2.5增加1 μg/m3和Zn增加1 ng/mL與肺癌相關（Bai et al.， 2021）。此外，也有一些研究發(fā)現，重金屬（Zn、Cu和Cr）和多環(huán)芳烴（苊和菲）與柴油和汽油尾氣排放有關（Hu et al.， 2016；Valavanidis et al.， 2006）。本研究的暴露倉位于多條高速公路和城市主干道附近，推測該環(huán)境PM2.5的主要點源為機動車尾氣，提示交通來源的空氣污染可能與肺健康密切相關，應盡量減少在交通高峰時段的暴露活動時間。

3.2 運動對可吸入顆粒物致肺部損傷的保護效應

運動有益健康已被大量實驗研究和流行病學調查所證實（Petridou et al.， 2019；Simpson et al.， 2020）。盡管已有一些研究認為，運動過程中參與者MV增加，導致更多顆粒物進入機體，增加氣道和血管損傷的敏感性（Daigle et al.， 2003）；但也有研究發(fā)現，長期規(guī)律性的運動可保護空氣污染導致的機體損害，即運動促進健康的正面效應可能大于空氣污染導致的負面效應（Qin et al.， 2019）。另一方面，meta分析揭示，空氣污染影響居民的日常體育活動相關行為（An et al.， 2020），久坐不動對機體產生的危害大于在空氣污染中運動產生的危害（Roberts et al.， 2014）。提示，應建立健康科學的生活方式和應對措施，使大眾能夠適應環(huán)境質量的動態(tài)變化，而不是被動盲目地停止體育活動。

間歇性運動可以提供與傳統(tǒng)中等強度持續(xù)性運動相似或更全面的心肺功能鍛煉效果，并具有運動節(jié)奏多變、減脂效率高等諸多優(yōu)點，已成為年輕人群青睞的鍛煉方式。相關研究表明，高強度間歇運動對年輕人心臟代謝健康、體質量管理、認知功能、炎癥發(fā)生發(fā)展具有良好的干預效果（Cooper et al.， 2016）。研究結果表明，8周間歇性運動可有效保護PM2.5亞急性暴露導致的肺通氣功能和呼吸肌力量下降，緩解肺阻塞程度以及細支氣管周圍炎癥浸潤和血管壁病變，肺灌洗液中促炎因子升高幅度明顯降低。已有研究發(fā)現，高強度間歇訓練可提高慢性阻塞性肺病患者心肺健康和運動能力（Sawyer et al.， 2020）。急性間歇運動可激活機體的抗炎效應，運動后血清IL-10水平和IL-10/TNF-α比率均升高（Cabral-Santos et al.， 2015）。提示，有規(guī)律的運動訓練可有效提高呼吸系統(tǒng)防御能力，緩解顆粒物所致肺部炎癥的發(fā)生發(fā)展。

3.3 運動對可吸入顆粒物致肺部損傷的保護機制

HSP70是HSP家族中的重要成員，長期以來HSP70被認為是一種胞漿蛋白，定位于細胞內發(fā)揮作用，即iHSP70。但是越來越多的證據表明，HSP70也可釋放到細胞外空間，成為eHSP70（Hulina-Toma?kovi? et al.， 2019）。細胞內的iHSP70具有抗炎功能，其機制主要是抑制NF-κB的活化（Costa-Beber et al.， 2022）。與iHSP70相反，eHSP70具有促炎作用。既往研究多通過檢測血漿中HSP70含量來評估eHSP70分泌水平（Baldissera et al.， 2018；Mai et al.， 2017）。Goettems-Fiorin等（2016）研究發(fā)現，暴露于細顆粒物（PM2.5）的機體eHSP70/iHSP70比值反映了細胞應激反應的改變，可作為空氣顆粒導致的急性炎癥或慢性低度炎癥狀態(tài)和風險的相關生物標志物。另一方面，Mai等（2017）研究也表明，運動形成的生理刺激足以引起生物體HSP的表達改變，12周的高強度間歇運動可抑制PM2.5暴露導致的心臟炎癥和氧化應激，運動干預后eHSP70/iHSP70比值顯著下降，提示HSP分泌水平與運動這一干預因素及運動機能狀態(tài)密切相關。本研究結果顯示，在PM2.5暴露下，隨著eHSP70水平的增加，eHSP70/iHSP70出現失衡。TLR-4作為動員NF-κB的受體，可能被顆粒物中脂多糖（Lipopolysaccharides， LPS）、重金屬等物質激活，促進炎癥細胞因子的釋放，在炎癥反應中發(fā)揮關鍵作用（Shi et al.， 2019）。本研究提示，PM2.5顆粒物暴露可促進更多的eHSP70與TLR-4結合，激活NF-κB炎癥通路，導致炎癥產生。8周運動可在一定程度上提高iHSP70含量，降低eHSP70含量，抑制NF-κB炎癥通路激活，且iHSP70的升高程度相對于eHSP70降低程度更明顯。

HSP70的合成調節(jié)主要發(fā)生在基因轉錄水平，由HSFs家族調控，其中HSF1是HSP的主要調控因子（Zheng et al.， 2013）。在HSF1合成過程中，一方面GSK3β作為體內大量代謝酶和轉錄因子的調控因子，與HSF1的合成密切相關（Wang et al.， 2020）。GSK3β可以使HSF1在ser303位點發(fā)生磷酸化，維持細胞質中HSF1處于無活性狀態(tài)，進而減少HSP的合成（Hietakangas et al.， 2006）。另一方面，P38MAPK（肌肉因子絲裂原活化蛋白激酶）可調控GSK3β磷酸化位點（ser9），進而抑制GSK3β活性（Thornton et al.， 2008）。鑒于此，本研究對各組P38MAPK-GSK3β-HSF1調控途徑進行評估發(fā)現，長期規(guī)律性運動可下調大鼠肺上皮細胞P38MAPK磷酸化水平，可能通過增加GSK-3β磷酸化使GSK3β失活，上調iHSP70分泌水平，改善大氣顆粒物致呼吸系統(tǒng)炎癥機體的eHSP70/iHSP70平衡紊亂，抑制PM2.5導致的HSP/TLR/NF-κB炎癥信號通路，同時提升肺上皮細胞內的抗炎作用（圖6）。亦有研究表明，運動上調GSK3β磷酸化位點（ser9）激活，從而抑制GSK3β活性（Liu et al.， 2015）。因此推斷GSK3β可能是運動保護可吸入顆粒物致呼吸系統(tǒng)炎癥的關鍵因子之一，也是運動防治可吸入顆粒物健康危害的有效干預靶標。

注：→表示激活，┤表示抑制。

Figure 6.Potential Mechanisms for the Exercise Training Against PM2.5Induced Lung Injury

3.4 研究局限

由于醫(yī)學倫理，本研究僅進行了運動和/或可吸入顆粒物PM2.5暴露對大鼠肺臟健康影響的動物實驗，在真實應用場景中的可推廣性有待商榷；在通路驗證方面，未采取阻斷、拮抗或轉基因動物的實驗進行驗證。后續(xù)研究中，擬開展針對信號通路相關的細胞阻斷實驗，以相關通路基因敲除動物為研究對象進一步驗證相關假說。

4 結論

PM2.5亞急性暴露可導致大鼠出現明顯的肺臟損傷，表現為肺功能障礙、支氣管黏膜脫落和炎癥反應。長期規(guī)律性運動對PM2.5亞急性暴露導致的肺臟損傷具有保護作用。長期規(guī)律性運動可下調大鼠肺上皮細胞P38MAPK磷酸化水平，可能通過增加GSK-3β磷酸化位點（ser9）使GSK3β失活，增加HSF1分泌水平，上調iHSP70，改善大氣顆粒物致呼吸系統(tǒng)炎癥機體的eHSP70/iHSP70平衡，進而阻斷TLR-NFκB炎癥信號通路，抑制炎癥。

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Exercise Protects Lung Injury Induced by PM2.5Exposure in Rats： Mediated by GSK3β on Extracellular to Intracellular HSP70 Ratio

QIN Fei1， 2， 3，XU Minxiao4，CUI Shuqiang5，QU Chaoyi2，DONG Yanan5，ZHAO Jiexiu2*

To explore the protective effects of long-term exercise on lung injury induced by PM2.5and the mechanism of extracellular to intracellular HSP70 ratio mediated by GSK3β. Male Wistar rats (aged 8 weeks) were randomly divided into four groups: Sedentary (S), exercise (E), sedentary＋PM2.5exposure (S＋PM2.5) and exercise＋PM2.5exposure (E＋PM2.5). All rats in exercise-related groups were trained by running on a treadmill for 8 weeks (60 min/time, 5 times/week). Rats in the PM-related groups were exposed to ambient PM2.5(7 times/week, 6 h/time) for 3 weeks after an 8-week exercise intervention or sedentary treatment. Finally, all rats' pulmonary function, lung morphology, degree of inflammation, and relevant protein expression levels were examined. It was found that PM2.5exposure led to neutrophil infiltration, alveolar hemorrhage, and alveolar septal thickening. Compared with S group, the significant decrease of MV, TV, EF50, PIF, PEF, iHSP70, IκBα, HSF1 and p-GSK3βser9were observed, but the obvious increase of PAU, Te, TNF-α, IL-1α, IL-6, eHSP70, TLR-4, NFκB p65, p-IκBα, IKKβ, p-IKKβ, GSK3β, p-P38 and p-HSF1ser303were presented in S＋PM2.5group. The lung injury was significantly improved in the E＋PM2.5group compared with that of S＋PM2.5group. Compared with S＋PM2.5group, the MV, TV, EF50, PIF, PEF, iHSP70, IκBα, HSF1 and p-GSK3βser9were significantly increased , but the PAU, Te, TNF-α, IL-1α, IL-6, eHSP70, TLR-4, NFκB p65, p-IκBα, IKKβ, p-IKKβ, GSK3β, p-P38 and p-HSF1ser303were obviously decreased in E＋PM2.5group. 8-week exercise training expressed protective effects on lung injury and reduced vulnerability to inflammation induced by PM2.5exposure, it was possibly through the P38 MAPK/GSK3β/HSF1 signaling pathways mediated by the extracellular-to-intracellular HSP70 ratio.

1000-677X(2023)01-0050-10

10.16469/j.css.202301006

2022-08-29；

2022-12-18

國家自然科學基金青年項目（31900845）；國家自然科學基金面上項目（11775059）。

覃飛（1987-），女，副教授，博士，主要研究方向為運動免疫與健康，E-mail： qinfei8707@jnu.edu.cn。

趙杰修（1975-），男，研究員，博士，主要研究方向為運動與特殊環(huán)境，E-mail： zhaojiexiu@ciss.cn。

G804.7

A