朱國飛,余 凱,夏 杰,余素鵬,周 安,馬 超

(貴州理工學(xué)院食品藥品制造工程學(xué)院,貴州 貴陽 550003)

0 引言

煙草蝕紋病毒蛋白酶(TEVp)是一種重組C型半胱氨酸蛋白酶,來源于煙草蝕紋病毒(TEV)Nla,含氨基酸 242 個(gè),分子量 27 kDa。TEVp 較易在工程菌中進(jìn)行有效表達(dá),反應(yīng)條件相對(duì)溫和,能夠特異性識(shí)別EXXYXQ(G/S)七氨基酸序列,因此是去除重組蛋白融合標(biāo)簽的重要蛋白酶之一[1-4]。為進(jìn)一步了解應(yīng)用環(huán)境對(duì)TEVp 結(jié)構(gòu)和功能的影響,在前期 Hg2+、Co2+兩種金屬離子與 TEVp 相互作用研究的基礎(chǔ)上[5-6],本實(shí)驗(yàn)采用紫外光譜、內(nèi)源熒光光譜、圓二色譜等多種光譜技術(shù),探究 Zn2+與 TEVp 相互作用具體情況,通過研究金屬離子對(duì) TEVp 結(jié)構(gòu)與功能的影響,有助于加深對(duì) TEVp 催化機(jī)制的認(rèn)識(shí),為 TEVp 的工程化改造及應(yīng)用提供依據(jù)和幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

TEVp(純度≥95%) 本實(shí)驗(yàn)室純化所得;氯化鋅 分析純;磷酸鹽 分析純。

PHS-4C+ 型pH計(jì)(成都方舟科技有限責(zé)任公司);紫外可見分光光度計(jì)UV-5500(上海元析儀器有限公司);Hitachi-F4600 型熒光分光光度計(jì)(日本日立公司);J-815 型圓二色譜儀(日本JASCO)。

TEVp溶液:2×10-6和15×10-6mol/L(50×10-3mol/L的PBS緩沖液,pH=7.4(最適pH)),待用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫外可見光譜檢測(cè)

向石英比色杯中加入3 mL的TEVp 溶液(2×10-6mol/ L),再依次定量添加Zn2+溶液,在維持總體積幾乎不變前提下使Zn2+的終作用濃度為0～10×10-6mol/L,每次加入混勻平衡10 min。常溫掃描200～700 nm。

1.2.2 熒光光譜檢測(cè)

樣品處理同紫外可見光譜(1.2.1)。檢測(cè)參數(shù):激發(fā)電壓=400 V,激發(fā)狹縫= 5 nm,發(fā)射狹縫=5 nm,分別在293、298和303 K三個(gè)恒溫條件檢測(cè)。內(nèi)源熒光光譜:激發(fā)波長為278 nm和295 nm,掃描范圍設(shè)置為300～450 nm。同步熒光光譜:檢測(cè)波長差Δλ(Δλ= 激發(fā)光波長 - 發(fā)射光波長)分別為15 nm和 60 nm時(shí)的同步熒光光譜,檢測(cè)范圍設(shè)置為250～350 nm。三維熒光光譜:激發(fā)間隔 = 5 nm,激發(fā)波長設(shè)置為200～350 nm,發(fā)射波長設(shè)置為250～460 nm。

1.2.3 圓二色譜檢測(cè)

向 TEVp樣品(15×10-6mol/ L)中分次定量加入 Zn2+溶液(使終作用濃度分別為0,15,45,75 μmol/ L),每次加入混勻平衡10 min。激發(fā)光狹縫 = 1 nm,發(fā)射光狹縫 = 1 nm,檢測(cè)范圍200～260 nm,開啟光譜校正,掃描速度中速。

所有光譜實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,并扣除緩沖液背景。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)設(shè)3組,采用Origin V7.0軟件進(jìn)行繪圖。采用SAS 8.0軟件的一般線性模型進(jìn)行方差分析,Duncan多重檢驗(yàn)確定數(shù)據(jù)間的差異性,P值<0.05,差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外可見光譜

在CTEVp=2.0×10-6mol/L,曲線a～k分別代表CZn2+為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μmol/L時(shí),紫外可見光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果,如圖1所示。由圖1可知:隨著Zn2+濃度增加,TEVp 位于218 nm及280 nm附近的紫外吸收強(qiáng)度均開始降低,暗示Zn2+與 TEVp 發(fā)生了結(jié)合,TEVp 芳香族氨基酸殘基的微環(huán)境發(fā)生了改變[7]。

圖1 TEVp與Zn2+相互作用的紫外可見光譜

2.2 Zn2+與 TEVp 相互作用對(duì)內(nèi)源熒光的影響

當(dāng)pH值為7.4,溫度為303 K時(shí),內(nèi)源熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

(a)λex= 278 nm (b)λex=295 nm圖2 TEVp與 Zn2+相互作用的內(nèi)源熒光光譜

由圖2可知,當(dāng)激發(fā)波長分別是278 nm(圖a)和295 nm(圖b)時(shí),逐漸提高Zn2+濃度, TEVp 的熒光強(qiáng)度均呈現(xiàn)規(guī)律性的降低(Zn2+自身沒有熒光),且最大發(fā)射峰明顯藍(lán)移,暗示Zn2+和 TEVp 間發(fā)生了明顯作用,Trp 和 Tyr 殘基周圍微環(huán)境發(fā)生變化,導(dǎo)致疏水性升高,極性降低[7]。

根據(jù)Stern-Volmer方程,則有

F0/F=Kqτ0[Q] +1=Ksv[Q] +1

(1)

其中,F0為添加Zn2+前TEVp熒光強(qiáng)度;F為添加 Zn2+后TEVp的熒光強(qiáng)度;[Q]為對(duì)應(yīng)Zn2+濃度;Kq為動(dòng)態(tài)熒光淬滅速率常數(shù);τ0為生物大分子熒光平均壽命(約為10-8s);Ksv為Stern-Volmer動(dòng)態(tài)淬滅常數(shù)[8-9]。

當(dāng)溫度為293、298、303 K時(shí),淬滅常數(shù)Kq分別為(2.692 0±0.000 9)×1012、(2.330 0±0.001 3)×1012、(2.126 0±0.001 0)×1012L/(mol·s),遠(yuǎn)大于淬滅劑對(duì)生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞淬滅速率常數(shù)2.0×1010L/(mol·s),且隨著作用溫度的升高Kq逐漸降低,表明 Zn2+與TEVp 的相互作用機(jī)制為靜態(tài)淬滅[10],如圖3和表1所示。

圖3 λex=278 nm時(shí),不同溫度條件下TEVp與Zn2+ 相互作用的Stern-Volmer曲線

表1 Zn2+與 TEVp 相互作用的動(dòng)態(tài)淬滅常數(shù)Ksv與動(dòng)態(tài)熒光淬滅速率常數(shù)Kq

2.3 同步熒光測(cè)定 Zn2+對(duì) TEVp 構(gòu)象的影響

當(dāng)T=299 K,pH = 7.4,CTEVp= 3.0×10-6mol/ L;同步熒光實(shí)驗(yàn)是在熒光掃描過程中激發(fā)波長與發(fā)射波長保持恒定的波長差(Δλ),當(dāng) Δλ=15 nm 時(shí),能夠高選擇性地呈現(xiàn)酪氨酸(Tyr)的光譜學(xué)特征,而當(dāng) Δλ=60 nm時(shí)則呈現(xiàn) 色氨酸(Trp) 的光譜學(xué)特征[11],如圖4所示。

(a)△λ=15 nm (b)△λ=60 nm圖4 Zn2+- TEVp 的同步熒光光譜

由圖4可知,當(dāng) Δλ分別為15 nm和60 nm時(shí),保持 TEVp 濃度不變,逐漸增加 Zn2+濃度,二者熒光強(qiáng)度均呈現(xiàn)規(guī)律性降低,且 Trp 基團(tuán)的熒光波峰明顯藍(lán)移,表明Zn2+的加入影響了 TEVp 酪氨酸和色氨酸殘基的微環(huán)境,尤其是對(duì)色氨酸(Trp)影響更大,導(dǎo)致色氨酸殘基的疏水性逐漸升高,極性逐漸降低[12]。

2.4 三維熒光光譜

三維熒光光譜是用于研究生物大分子與藥物小分子相互作用后結(jié)構(gòu)變化的一種常用方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別如圖5和表2所示,未添加Zn2+前和添加Zn2+后相比,熒光峰1(主要是Tyr 和 Trp 殘基引起的)和峰2(主要表現(xiàn)多肽鏈的熒光特征)的強(qiáng)度都有所減少(峰a為瑞利散射峰,λex=λem),并且發(fā)生了藍(lán)移(峰1藍(lán)移9 nm,峰2藍(lán)移12 nm),表明 Zn2+與 TEVp 結(jié)合導(dǎo)致蛋白多肽鏈?zhǔn)站o,Tyr 和 Trp 殘基微環(huán)境疏水性升高,極性降低[13]。

(a)CZn2+∶CTEVp=0∶1三維光譜圖 (b)CZn2+∶CTEVp=0∶1等高線圖

(c)CZn2+∶CTEVp=1∶1三維光譜圖 (d)CZn2+∶CTEVp=1∶1等高線圖圖5 Zn2+與TEVp 相互作用的三維熒光光譜圖

表2 Zn2+與TEVp 相互作用的三維熒光光譜參數(shù)

2.5 Zn2+對(duì) TEVp 二級(jí)結(jié)構(gòu)及其功能的影響

圓二色譜能夠較為精準(zhǔn)地檢測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變[14]。T=299 K,pH = 7.4,CTEVp=15×10-6mol/ L,CZn2+分別為 0、15×10-6、45×10-6、75×10-6mol/ L時(shí),遠(yuǎn)紫外圓二色譜如圖6所示。由圖6可知,隨著 Zn2+濃度的增加, TEVp 在208～222 nm處的吸收強(qiáng)度逐漸增加,暗示 Zn2+的加入,導(dǎo)致 TEVp 二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。通過 CDNN 軟件對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行估算,結(jié)果如表3所示:未加入 Zn2+時(shí), TEVp 含有約 15.27%α-螺旋,37.10%β-折疊,16.06%β-轉(zhuǎn)角以及31.57% 無規(guī)則卷曲,與先前的研究結(jié)果高度一致[5]。隨著 Zn2+加入,β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)未發(fā)生較大變化,但α-螺旋結(jié)構(gòu)明顯增加,而β-折疊結(jié)構(gòu)明顯減少。

圖6 遠(yuǎn)紫外圓二色譜分析Zn2+與TEVp的結(jié)合作用

表3 Zn2+ 對(duì) TEVp 的二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變

3 結(jié)語

本文利用紫外、熒光等多種光譜方法研究了 Zn2+與 TEVp 的相互作用。內(nèi)源熒光光譜研究結(jié)果顯示, TEVp與Zn2+發(fā)生靜態(tài)淬滅作用,引起內(nèi)源熒光發(fā)生淬滅。同步熒光和三維熒光光譜等研究結(jié)果表明,Zn2+與 TEVp 結(jié)合導(dǎo)致蛋白多肽鏈?zhǔn)站o,酪色氨和酸氨酸殘基的微環(huán)境產(chǎn)生相應(yīng)變化,其中色氨酸殘基微環(huán)境變化較大,親水性降低,非極性增強(qiáng)。圓二色譜試驗(yàn)結(jié)果表明,Zn2+與 TEVp 的結(jié)合,導(dǎo)致 TEVp 的α-螺旋結(jié)構(gòu)增多,β-折疊結(jié)構(gòu)減少。

通過本實(shí)驗(yàn)的研究,初步闡明了Zn2+與 TEVp 的相互作用的基本信息,為 TEVp 的推廣和應(yīng)用提供了重要理論依據(jù)。