陶通來,高 晶,楊瓊玉,毛潤乾,吳詩寶

(1 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,廣州,510631;2 廣東省科學(xué)院動(dòng)物研究所/廣東省動(dòng)物保護(hù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省野生動(dòng)物保護(hù)和利用公共實(shí)驗(yàn)室/廣東省礦物油農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心,廣州,510260)

柑桔黃龍病(Hanglongbing,HLB)又稱黃枯病、青果病、黃梢病,是柑桔最具毀滅性的病害之一。中國19個(gè)栽培柑桔的省區(qū)已經(jīng)有11個(gè)遭受過柑桔黃龍病為害[1]。2005—2015年,黃龍病摧毀了美國佛羅里達(dá)州近4.05萬hm2(10萬英畝)的柑桔種植園,累計(jì)造成了超過29億美元的損失[2-4]。黃龍病病原菌是一類專門寄生在柑桔韌皮部的革蘭氏陰性細(xì)菌,屬韌皮桿菌屬細(xì)菌,到目前為止共發(fā)現(xiàn)3個(gè)種,即亞洲種(CandidatusLiberibacter asiantus,CLas)、美洲種(CandidatusLiberibacter americanus,CLam)和非洲種(CandidatusLiberibacter africanus,CLaf),其中CLas分布最為廣泛,在我國流行的黃龍病病原也是該種細(xì)菌,柑桔黃龍病菌可通過柑桔木虱(DiaphorinacitriKuwayama)取食、嫁接、菟絲子寄生3種方式進(jìn)行傳播[5-7]。柑桔木虱,屬于半翅目,木虱科,不完全變態(tài)發(fā)育,生長階段分為卵、若蟲、成蟲,若蟲和成蟲可通過刺吸式口器吸食柑桔葉或嫩枝汁液,同時(shí)獲得黃龍病病菌[8-10]。病菌一旦進(jìn)入柑桔木虱體內(nèi),便會(huì)在其體內(nèi)循環(huán)、擴(kuò)散以及增殖,并且終身帶毒,具有持久的傳播能力[11]。因此,防治柑桔木虱,減少其傳播黃龍病對維護(hù)柑桔產(chǎn)業(yè)安全至關(guān)重要。目前,防治柑桔木虱主要依賴化學(xué)防治,但長期大量使用化學(xué)農(nóng)藥會(huì)增加害蟲的抗性,并且造成污染環(huán)境和引發(fā)食品安全問題,因而亟須尋找到一種綠色安全的防治辦法。

礦物油農(nóng)藥是用礦物油基礎(chǔ)油添加乳化劑等助劑生產(chǎn)而成,其通過在害蟲蟲體形成油膜,使害蟲窒息死亡[12-14]。礦物油農(nóng)藥在柑桔害蟲綜合防控中應(yīng)用廣泛,對柑桔全爪螨(Panonychuscitri,俗稱柑桔紅蜘蛛)、柑桔矢尖蚧(Unaspisyanonensis)、柑桔小實(shí)蠅(Bactroceradorsalis)、柑桔粉虱(Dialeurodescitri)、柑桔潛葉蛾(Phyllocnistiscitrella)、柑桔粉蚧(Planococcuscitri)、繡線菊蚜(Aphisspiraecola)等有很好的防控作用[15-19]。此外,礦物油農(nóng)藥還可通過掩蓋引誘型寄主植物的揮發(fā)物或誘導(dǎo)植物產(chǎn)生驅(qū)避性揮發(fā)物來驅(qū)避害蟲[20],如煙粉虱(Bemisiatabaci)、長管蚜(Macrosiphumeuphorbiae)、桔小實(shí)蠅、土豆木虱(Bactericeracockerelli)等[21-23]。礦物油農(nóng)藥對柑桔木虱驅(qū)避作用方面的研究也有報(bào)道。Ouyang等[24]選擇2株甜橙(Citrussinensis)分別噴灑礦物油農(nóng)藥和水,觀察柑桔木虱對甜橙的選擇性,結(jié)果表明多種礦物油農(nóng)藥對柑桔木虱有驅(qū)避作用。岑伊靜等[25]采用四臂嗅覺儀研究發(fā)現(xiàn),機(jī)油乳劑對柑桔木虱無驅(qū)避作用?？赡苁怯捎跍y試方法和礦物油農(nóng)藥不一致,導(dǎo)致兩者的研究結(jié)果截然不同。因此,關(guān)于礦物油農(nóng)藥對柑桔木虱是否有驅(qū)避作用仍然需要進(jìn)一步研究。

礦物油農(nóng)藥不僅影響昆蟲存活和寄主選擇,還可影響昆蟲傳播病害的能力。如:礦物油農(nóng)藥可使病毒失活,從而有效抑制桃蚜(Myzuspersicae)獲得馬鈴薯Y病毒[26],以及可通過抑制馬鈴薯Y病毒黏附在櫻桃燕麥蚜蟲(Rhopalosiphumpadi)的口針上,從而抑制病毒的傳播[27],礦物油農(nóng)藥可通過影響桃蚜的寄主選擇行為從而抑制蚜蟲傳播李痘病毒[28-29]。在柑桔病害方面,礦物油農(nóng)藥對柑桔煤煙病的防治效果顯著[30]。田間發(fā)現(xiàn)礦物油農(nóng)藥可顯著降低黃龍病的感染率[31],但是礦物油農(nóng)藥如何影響黃龍病的發(fā)生,是否是通過影響柑桔木虱而干擾黃龍病的傳播,仍未知。基于以上背景,本文研究了礦物油農(nóng)藥對柑桔木虱的驅(qū)避作用,以及礦物油農(nóng)藥對柑桔木虱獲取柑桔黃龍病病菌的影響,希望能夠?yàn)榈V物油農(nóng)藥應(yīng)用于柑桔黃龍病的治理提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)所用柑桔木虱采自中山大學(xué)南校區(qū)英東體育館前的九里香植株,之后在溫室[溫度為(26±1) ℃,光照強(qiáng)度為6 000 lx,光周期為光照∶黑暗=14∶10,濕度為(70±5)%]飼養(yǎng)。

所用的黃龍病樹為沙糖桔樹,從德慶感染黃龍病的廢棄柑桔園移栽至室內(nèi)培養(yǎng);所用的健康樹,也為沙糖桔,來源于清遠(yuǎn)無病苗圃;九里香樹購自廣州嶺南花卉市場,之后于溫室中培養(yǎng)(條件同上);均使用盆栽培養(yǎng),樹體高度為20～30 cm。

所用礦物油農(nóng)藥為綠穎?99%礦物油乳油制劑,來自韓國SK株式會(huì)社,密度為0.834 2 g/cm3,平均正烷烴碳數(shù)當(dāng)量23(nC23)。試驗(yàn)前將礦物油農(nóng)藥稀釋至濃度為0.5%(體積分?jǐn)?shù))備用。

1.2 礦物油農(nóng)藥對柑桔木虱選擇行為的影響

1.2.1 驅(qū)避作用 選取生長狀態(tài)相似的九里香嫩梢,分別噴灑礦物油農(nóng)藥(處理組)及去離子水(對照組),1 h后測定柑桔木虱趨性的行為反應(yīng),采用Y型嗅覺儀測定柑桔木虱的行為反應(yīng)?！癥”型管主臂通過硅膠管與真空抽氣泵相連,“Y”型管的兩臂通過硅膠管與味源瓶相連。一個(gè)味源瓶內(nèi)加入礦物油農(nóng)藥處理過的九里香嫩梢,另一個(gè)味源瓶內(nèi)加入去離子水處理過的九里香嫩梢或者不加任何樣品(見圖1)。在“Y”型管主臂管口接入20頭經(jīng)饑餓處理2 h的柑桔木虱成蟲,待柑桔木虱蘇醒后,打開真空抽氣泵,觀察記錄柑桔木虱的選擇,當(dāng)其爬過某個(gè)測試臂1/3位置,并停留30 s以上則確定為選擇該測試臂,反之則視為無響應(yīng)。

圖1 Y型嗅覺儀

1.2.2 驅(qū)避作用的持效性 選取生長狀態(tài)相似的九里香嫩梢,分別噴灑礦物油農(nóng)藥和去離子水,待噴灑1 h、1 d、4 d和7 d后,采用Y型嗅覺儀進(jìn)行行為反應(yīng)測定,方法同上,計(jì)算驅(qū)避率。驅(qū)避率(%)=[(對照臂中蟲數(shù)-處理臂中蟲數(shù))/(處理臂中蟲數(shù)+對照臂中蟲數(shù))]×100%。

1.3 礦物油農(nóng)藥對柑桔木虱獲取黃龍病病菌的影響

1.3.1 飼菌時(shí)長對柑桔木虱獲菌率的影響 選取3株黃龍病沙糖桔樹為3個(gè)重復(fù),試驗(yàn)前參照Zheng等[32]和Li等[33]的方法檢測黃龍病,結(jié)果為陽性。試驗(yàn)前將幼葉剪去,留下老葉,每株選取6個(gè)枝條,分別用帶封口的透明網(wǎng)袋套袋后接15頭不帶黃龍病病菌的柑桔木虱,每株共接90頭,讓柑桔木虱分別在枝條上取食1、3、5、7、18和25 d。整個(gè)取食過程均在溫室(條件同上)中進(jìn)行。在每個(gè)取食時(shí)間節(jié)點(diǎn)取10頭柑桔木虱,通過單頭提取DNA檢測是否獲得黃龍病病菌,檢測方法參照李翌菡等[34],計(jì)算其獲菌率,以確定柑桔木虱在取食中獲取黃龍病病菌的時(shí)間規(guī)律。獲菌率(%)=(獲菌柑桔木虱數(shù)量/供試柑桔木虱數(shù)量)×100%。

1.3.2 礦物油農(nóng)藥對柑桔木虱獲取黃龍病病菌效率的影響 選取3株黃龍病沙糖桔樹,每株選12個(gè)枝條供試,經(jīng)檢測每個(gè)枝條均帶黃龍病病菌。對供試每個(gè)枝條標(biāo)號,試驗(yàn)前將幼葉剪去,每個(gè)枝條留20片葉。每株黃龍病沙糖桔樹先選取其中9個(gè)枝條分為3組(記為第1組、第2組和第3組),均噴灑礦物油農(nóng)藥至液滴開始往下滴即可;剩余3個(gè)枝條記為第4組,作為陽性對照,噴灑去離子水至液滴開始往下滴即可。每個(gè)供試枝條用1個(gè)帶封口的透明網(wǎng)袋進(jìn)行套袋。

選取3株健康沙糖桔樹作為陰性對照,每株選3個(gè)枝條供試,經(jīng)檢測每個(gè)枝條均不帶黃龍病病菌。試驗(yàn)前將供試枝條的幼葉剪去,每個(gè)枝條留20片葉后,均噴灑去離子水至液滴開始往下滴即可。每個(gè)枝條上用1個(gè)帶封口的透明網(wǎng)袋套袋。

在每個(gè)透明網(wǎng)袋里接15頭羽化3 d的不帶黃龍病病菌的柑桔木虱成蟲(饑餓處理24 h)。其中,第1組、第2組和第3組枝條接柑桔木虱的時(shí)間分別為礦物油農(nóng)藥處理后1 h、4 d和7 d,陽性對照組和陰性對照組接柑桔木虱時(shí)間為噴灑去離子水后1 h、4 d和7 d,同株一組的接蟲時(shí)間相同。陰性對照是保證試驗(yàn)中的柑桔木虱成蟲是不帶黃龍病病菌,不參與抑制率統(tǒng)計(jì)分析,若陰性對照檢測為陽性則試驗(yàn)無效。

根據(jù)“1.3.1”試驗(yàn)結(jié)果,待柑桔木虱在枝條上取食7 d后(整個(gè)取食過程在培養(yǎng)箱中,條件同上),每個(gè)枝條取柑桔木虱10頭,單頭提取DNA并檢測,確定柑桔木虱對黃龍病病菌的獲菌率,計(jì)算礦物油農(nóng)藥對柑桔木虱獲取黃龍病病菌的抑制率。抑制率(%)=[(陽性對照組獲菌率-處理組獲菌率)/陽性對照組獲菌率]×100。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS V21.0分析軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 礦物油農(nóng)藥對柑桔木虱選擇行為的影響

處理組為嫩梢上噴灑礦物油農(nóng)藥(0.5%,體積分?jǐn)?shù),下同),對照組為嫩梢上噴灑去離子水,1 h后測定柑桔木虱成蟲的趨性行為反應(yīng),選擇噴灑去離子水嫩梢的柑桔木虱占比為15.4±0.62,選擇礦物油農(nóng)藥處理過嫩梢的柑桔木虱占比為4.6±0.59,經(jīng)t檢驗(yàn),兩者差異極顯著(p<0.01)。表明,礦物油農(nóng)藥對柑桔木虱有很強(qiáng)的驅(qū)避性。

驅(qū)避作用持效時(shí)間試驗(yàn)結(jié)果表明,噴灑礦物油農(nóng)藥1 h和1 d后驅(qū)避作用強(qiáng),驅(qū)避率差異(變化)無顯著性;礦物油農(nóng)藥處理后時(shí)間延長至4 d后,驅(qū)避率顯著下降,驅(qū)避作用減弱;礦物油農(nóng)藥處理7 d后驅(qū)避率達(dá)38.54%,仍然有驅(qū)避作用(見圖2)。

注:誤差線所示為標(biāo)準(zhǔn)誤,圖中不同字母表示經(jīng)鄧肯氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)在0.05水平差異顯著。圖3和圖4同。

2.2 飼菌時(shí)長對柑桔木虱獲菌率的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明,在室內(nèi)條件下,柑桔木虱成蟲在取食1 d后即可獲菌,獲菌率為30.0%,取食1～5 d的獲菌率沒有明顯差異,取食7 d的獲菌率陡升至80.0%,此后獲菌率出現(xiàn)波動(dòng),取食25 d的獲菌率最高,達(dá)90.0%(見圖3)。

圖3 不同飼菌時(shí)長對柑桔木虱獲菌率的影響

2.3 礦物油農(nóng)藥對柑桔木虱獲取黃龍病病菌的影響

結(jié)果表明,礦物油農(nóng)藥對柑桔木虱獲取黃龍病病菌具有明顯的抑制作用,并且這種抑制作用隨處理后時(shí)間的推移而顯著減弱(見圖4)。

圖4 礦物油農(nóng)藥對柑桔木虱獲取黃龍病病菌的抑制作用

3 討論

使用Y型嗅覺儀測定了礦物油農(nóng)藥對柑桔木虱的驅(qū)避作用,發(fā)現(xiàn)礦物油農(nóng)藥對柑桔木虱的驅(qū)避作用明顯,與Ouyang等[24]的研究結(jié)果一致,但與岑伊靜等[25]的結(jié)果不同。岑伊靜等[25]采用四臂嗅覺儀,只選擇1個(gè)臂作為礦物油農(nóng)藥氣味源,其余3個(gè)臂均為空白對照,這可能讓柑桔木虱無法選擇,因此表現(xiàn)出礦物油農(nóng)藥對柑桔木虱沒有驅(qū)避作用,另外也有可能是不同類型的礦物油農(nóng)藥對柑桔木虱的驅(qū)避作用不一致。有研究表明,礦物油農(nóng)藥可減少棉花產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì),達(dá)到干擾棉鈴蟲產(chǎn)卵的作用[32]。因此,礦物油農(nóng)藥也可能通過抑制或掩蓋九里香揮發(fā)物,從而對柑桔木虱表現(xiàn)出驅(qū)避作用。有研究報(bào)道礦物油農(nóng)藥對柑桔木虱驅(qū)避作用的持效性大概為10 d[24],本研究結(jié)果與此相近,可見,礦物油農(nóng)藥對柑桔木虱的驅(qū)避作用較短暫。其原因可能是礦物油農(nóng)藥在光照條件下慢慢被降解所致[33]。

本研究表明柑桔木虱取食帶黃龍病病菌的植株1 d后便可獲菌,與黃金萍等[34]和傅致君[35]的研究結(jié)果一致;但是不同研究的獲菌率差異較大,本研究為30.0%,其他研究分別為66.67%[34]和5.82%[35]。不同研究的獲菌率差異,可能與病株帶菌水平不同有關(guān),同時(shí),病菌在病株的空間分布不均勻[36],也有可能與取食部位有關(guān),還可能與試驗(yàn)環(huán)境條件有關(guān)。

不同取食時(shí)間的試驗(yàn)表明,柑桔木虱取食7 d時(shí)獲菌率接近峰值。因此,選擇柑桔木虱取食7 d來研究礦物油農(nóng)藥處理對柑桔木虱獲取黃龍病病菌的影響,結(jié)果表明,礦物油農(nóng)藥對柑桔木虱獲取黃龍病病菌具有明顯的抑制作用,抑制作用隨處理后時(shí)間的推移而顯著減弱,處理后1 h的抑制率高達(dá)86.67%,4 d降為54.83%,7 d降為7.60%。結(jié)合文獻(xiàn)及本研究結(jié)果,推測礦物油農(nóng)藥能有效抑制柑桔木虱獲取黃龍病病菌的主要原因是礦物油農(nóng)藥對柑桔木虱有驅(qū)避作用和拒食作用[37],導(dǎo)致柑桔木虱棲息較少,不取食或較少取食,從而抑制柑桔木虱獲得黃龍病病菌。礦物油農(nóng)藥處理后時(shí)間越長抑制效果越差,礦物油農(nóng)藥驅(qū)避作用隨時(shí)間減弱,試驗(yàn)中礦物油農(nóng)藥處理后4 d和7 d之間驅(qū)避率和抑制率均差異顯著,但抑制率差距明顯大于驅(qū)避率差距。這表明,礦物油農(nóng)藥抑制柑桔木虱獲得黃龍病病菌的作用機(jī)制除與驅(qū)避作用有關(guān),還可能存在其他原因。如:(1)礦物油農(nóng)藥對柑桔木虱獲得黃龍病病菌有物理阻擋作用。柑桔木虱刺探礦物油農(nóng)藥處理過的感染黃龍病的柑桔葉片,口針可能觸碰到礦物油農(nóng)藥,在口針尖端形成油膜使柑桔木虱無法獲得黃龍病病菌[26,28]。(2)礦物油農(nóng)藥對柑桔木虱獲得黃龍病病菌有生理干擾作用。有研究表明,非持久性病毒需要依靠蚜蟲口針內(nèi)的輔助蛋白才能黏附在蚜蟲口針上,礦物油農(nóng)藥可以與輔助蛋白結(jié)合,使輔助蛋白無法與病毒結(jié)合,進(jìn)而抑制蚜蟲獲取病毒[27,38]。柑桔木虱口針內(nèi)可能存在協(xié)助黃龍病病菌進(jìn)入柑桔木虱體內(nèi)的輔助蛋白,而礦物油農(nóng)藥能夠干擾黃龍病病菌與輔助蛋白結(jié)合,導(dǎo)致黃龍病病菌無法進(jìn)入柑桔木虱體內(nèi)。這些推測還需要進(jìn)一步的研究。

本研究表明,礦物油農(nóng)藥對柑桔木虱具有明顯的驅(qū)避作用,并且這種作用影響柑桔木虱獲取黃龍病病菌。與傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥相比,礦物油農(nóng)藥作為一種綠色農(nóng)藥,不會(huì)使害蟲產(chǎn)生抗性,而且對人畜及環(huán)境安全,可為抑制黃龍病傳播提供一種很好的方案。我們前期的研究還發(fā)現(xiàn),礦物油農(nóng)藥可殺滅柑桔木虱,且可作為化學(xué)農(nóng)藥增效劑,如與吡蟲啉一定比例的混合可提升對柑桔木虱的殺滅作用[39]。因此,礦物油農(nóng)藥對果園內(nèi)柑桔木虱和黃龍病均具有很好的控制效果,推薦黃龍病疫區(qū)柑桔園每間隔7 d噴一次礦物油農(nóng)藥。同時(shí),田間使用礦物油農(nóng)藥控制柑桔木虱和黃龍病的實(shí)際效果尚待進(jìn)一步的研究進(jìn)行驗(yàn)證。