陽琴娜，元欣欣，杜銳凱，厲建偉，李英賢，千年松

1解放軍醫(yī)學院，北京 100853；2 中國航天員科研訓練中心航天醫(yī)學基礎與應用國家重點實驗室，北京 100094；3 解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學中心呼吸與危重癥醫(yī)學部胸部腫瘤科，北京 100039

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率較高，晚期乳腺癌患者容易發(fā)生溶骨性骨轉移并伴有多種骨骼損傷性并發(fā)癥，嚴重影響患者的身心健康和生存質量，如何抑制乳腺癌骨轉移是目前研究熱點之一[1]。近年來研究發(fā)現外泌體是一種重要的細胞間通訊方式，參與多種生理過程[2]。外泌體是一種直徑為30 ～ 200 nm 的雙層脂質膜結構囊泡，可攜帶包括mRNA、miRNA及線粒體DNA(mtDNA)等核酸和蛋白質在內的多種物質，在多種生理、病理過程中發(fā)揮著獨特作用[3-6]。研究表明，骨微環(huán)境中擴散性腫瘤細胞通常會與成骨細胞結合以維系腫瘤細胞存活并形成微轉移[7]，然而成骨細胞來源的外泌體對乳腺癌的作用尚不明確。本研究擬從成骨前體細胞MC3T3-E1 來源外泌體對乳腺癌細胞的調控角度出發(fā)，探討其對乳腺癌細胞增殖和遷移的影響，以期為開發(fā)新的乳腺癌治療方法以及改善乳腺癌骨轉移提供理論支持。

材料與方法

1 主要材料、試劑與儀器 α-MEM 培養(yǎng)基，DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清(Gibco，美國)；Transwell 細胞小室(NEST，中國)；CCK-8 試劑盒，蛋白裂解液，4%多聚甲醛，結晶紫(碧云天，中國)；BCA蛋白定量試劑盒(Thermo Fisher，美國)；胰酶，Alix 抗體，CD63 抗體， Lamin A/C 抗體(Sigma，美國)；透射電鏡(HITACHI，日本)；超速離心機(Beckman，美國)。

2 細胞培養(yǎng) 4T1 和MDA-MB-231 乳腺癌細胞均置于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，MC3T3-E1 細胞置于含10%胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以上細胞均培養(yǎng)于37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中。

3 MC3T3-E1 細胞來源外泌體的提取和鑒定 使用含10%去外泌體血清的α-MEM 培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)MC3T3-E1 細胞48 h 后，收集細胞培養(yǎng)上清液。上清液400 g 離心5 min 去除死細胞，上清繼續(xù)通過2 000 g 離心15 min 去除細胞碎片，然后將細胞通過10 kU 超濾管濃縮，4℃下10 000 g 離心30 min，去除凋亡小體后進行超速離心，120 000 g離心70 min，離心后的沉淀重懸于PBS，經0.22 μm濾膜過濾后，用BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。Western blot 檢測鑒定外泌體表面標志蛋白Alix、CD63，并用ImageJ 軟件對條帶進行灰度分析確定蛋白的相對表達量。

4 外泌體透射電鏡分析和粒度分析 約20 μg 重懸于PBS 的MC3T3-E1 來源的外泌體以2%多聚甲醛在室溫下固定30 min，將外泌體滴在石蠟膜上，用鑷子將電鏡載網的高聚物碳包被一面扣在液滴上，以吸附液體在載網上；用紫外線預處理電鏡實驗所需的銅網以減少靜電，將8 μL 混合物滴到銅網上，干燥30 min；載網滴加2%醋酸雙氧鈾，孵育15 min，用濾紙吸去多余的液體，晾干；使用HT7700 透射電子顯微鏡在120 kV 下檢查干燥的銅網并拍照。將MC3T3-E1 細胞的培養(yǎng)液用0.22 μm 濾膜過濾，在清華大學使用Malvern LM10 進行Nanosight 分析。

5 CCK-8 檢測外泌體對乳腺癌細胞活性的影響實驗分組設置為對照組(4T1 和MDA-MB-231 培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)基中)和實驗組(4T1 和MDA-MB-231分別培養(yǎng)于添加20 μg/mL、30 μg/mL、50 μg/mL外泌體的DMEM 培養(yǎng)基中)，取生長狀態(tài)良好的乳腺癌細胞，使用胰酶消化，離心棄上清后收集細胞，用培養(yǎng)基重懸細胞并計數，將乳腺癌細胞以 2 × 104/孔接種于96 孔板中，每組設計6 個復孔，培養(yǎng)24 h 后，按照CCK-8 試劑盒說明書加入CCK-8 試劑后置于培養(yǎng)箱中孵育靜置2 h，使用酶標儀于波長450 nm 處檢測每孔的分光光度值。

6 劃痕實驗檢測外泌體對乳腺癌細胞遷移的影響實驗分組設置為對照組(4T1 和MDA-MB-231培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)基中)和實驗組(4T1 和MDAMB-231 培養(yǎng)于添加20 μg/mL 外泌體的DMEM 培養(yǎng)基中)，先用標記筆在6 孔板背后比照直尺均勻畫橫線，每隔1 cm 畫一道橫線，每孔至少有5 條線穿過，細胞以1 × 105/孔接種于6 孔板中，待細胞鋪滿后用無菌的100 μL 槍頭沿直尺垂直于所畫橫線劃出細胞劃痕，槍頭豎直無傾斜，每孔約畫4 條劃痕，用無菌PBS 清洗2 次去除劃下的細胞，更換為無血清的培養(yǎng)基，放入37℃ 5% CO2恒溫箱中，分別于0 h、24 h 在顯微鏡下觀察并拍照，ImageJ 軟件測量劃痕面積并計算細胞遷移率。

7 Transwell 實驗檢測外泌體對乳腺癌細胞遷移的影響 實驗分組設置為對照組(4T1 和MDA-MB-231 培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)基)和實驗組(4T1 和MDAMB-231 培養(yǎng)于添加20 μg/mL 外泌體的DMEM 培養(yǎng)基)，將處于對數生長期的細胞，用胰酶消化后，用無血清細胞培養(yǎng)基重懸細胞。在24 孔板的小室下加入750 μL 完全培養(yǎng)基，小室內分別加入150 μL 細胞懸液，37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取出Transwell 小室，棄去上清液，用PBS 小心浸洗2 次，加4%多聚甲醛固定細胞5 mL，30 min后去固定液，加適量結晶紫染色液染30 min，用流水緩慢洗去染色液，用干凈的棉球將上室內側未遷移的細胞擦干凈，晾干，顯微鏡下觀察拍照，每個小室隨機選取3 個視野，計數遷移的細胞。

8 CCK-8 細胞增殖實驗檢測外泌體對乳腺癌細胞增殖的影響 實驗分組設置為設置為對照組(4T1和MDA-MB-231 培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)基)和實驗組(4T1 和MDA-MB-231 培養(yǎng)于添加20 μg/mL 外泌體的DMEM 培養(yǎng)基)，取生長狀態(tài)良好的細胞，使用胰酶消化，離心棄上清后收集細胞，用培養(yǎng)基重懸細胞并計數，將細胞以 2 × 103/孔接種于96 孔板中，根據分組加入相應培養(yǎng)液，每組設置3 個復孔，分別在第 1、3、5 天時按照CCK-8 試劑盒說明書方法加入CCK-8 液后置于培養(yǎng)箱中孵育靜置2 h，使用酶標儀讀取每孔的450 nm 吸光值。

9 細胞克隆形成實驗檢測外泌體對乳腺癌細胞增殖的影響 實驗分組設置為對照組(4T1 和MDAMB-231 培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)基中)和實驗組(4T1和MDA-MB-231 培養(yǎng)于添加20 μg/mL 外泌體的DMEM 培養(yǎng)基中)，取對數生長期的各組細胞，分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，把細胞懸浮在10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中備用。將細胞以1 500/孔接種于6 孔板中，輕輕轉動，使細胞分散均勻，置37℃ 5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 周，終止培養(yǎng)并棄去上清液，用PBS小心浸洗3 次。加4%多聚甲醛固定細胞6 mL，30 min 后去固定液，加適量結晶紫染色液染30 min，用流水緩慢洗去染色液，待干燥，顯微鏡(200×)計數大于10 個細胞的克隆數。

10 統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料實驗數據以±表示，兩組實驗數據結果比較采用t檢驗，多組之間差異采用方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 MC3T3-E1 細胞來源的外泌體提取及鑒定 通過超速離心法提取MC3T3-E1 細胞培養(yǎng)上清中的外泌體，在透射電子顯微鏡下可見圓形或橢圓形的囊泡狀結構小體(圖1A)。納米顆粒跟蹤分析(nanopartic tracking analysis，NTA)顯示MC3T3-E1 細胞來源的外泌體直徑分布為100 ～ 200 nm(圖1B)。對細胞培養(yǎng)上清中囊泡蛋白進行Western blot 檢測，Western blot 檢測到外泌體標志性蛋白Alix、CD63 表達陽性，核蛋白質Lamin A/C 表達陰性(圖1C)，用ImageJ 軟件對Western blot 條帶進行灰度值分析，外泌體中Alix 的相對表達量為0.6，TSG 101 的相對表達量為0.5，細胞中Lamin A/C 的相對表達量為1.2，Actin 相對表達量為0.5(圖1D)，以上結果表明成功提取MC3T3-E1 細胞來源的外泌體。

圖1 外泌體純度鑒定A： 透射電子顯微鏡下結果；B：納米顆粒跟蹤分析結果；C：外泌體相關蛋白鑒定；D：外泌體相關蛋白灰度分析Fig.1 Identification of exosomesA: TEM image; B:NTA results; C: Identification of exosomes related proteins; D: Gray level analysis of exosomes related proteins

2 MC3T3-E1 細胞來源的外泌體對乳腺癌細胞活性的影響 CCK-8 實驗檢測MC3T3-E1 細胞來源的外泌體對乳腺癌4T1 和MDA-MB-231 細胞活性的影響，用濃度為20 μg/mL、30 μg/mL、50 μg/mL的MC3T3-E1 細胞來源外泌體與乳腺癌細胞共培養(yǎng)24 h 后，CCK-8 結果顯示，4T1 對照組的OD值為3.872 ± 0.008 ，與20 μg/mL 外泌體共培養(yǎng)后的4T1 細胞OD 值為3.842 ± 0.013，與對照組OD值比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，說明20 μg/mL 外泌體不影響4T1 癌細胞活性；與30 μg/mL 外泌體共培養(yǎng)后的4T1 癌細胞OD 值為3.747 ± 0.009，與50 μg/mL 外泌體共培養(yǎng)后的4T1 癌細胞平均OD值為3.667 ± 0.023，與對照組OD 值比較均有統(tǒng)計學差異(P均＜0.01)，說明30 μg/mL 和50 μg/mL外泌體均能降低4T1 癌細胞的活性(圖2A)。MDAMB-231 對照組的平均OD 值為3.722 ± 0.020，與20 μg/mL 外泌體共培養(yǎng)后的MDA-MB-231 細胞平均OD 值為3.720 ± 0.019，與對照組OD 值比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，說明20 μg/mL 外泌體不影響MDA-MB-231 癌細胞的活性；與30 μg/mL 外泌體共培養(yǎng)后的MDA-MB-231 癌細胞OD 值為3.631 ±0.016，與50 μg/mL 外泌體共培養(yǎng)后的MDA-MB-231 癌細胞OD 值為3.517 ± 0.015，與對照組OD 值比較有統(tǒng)計學差異(P均＜0.01)，說明30 μg/mL 和50 μg/mL 外泌體均能降低MDAMB-231 癌細胞的活性(圖2B)，根據以上結果得出結論，30 μg/mL、50 μg/mL 外泌體能降低乳腺癌細胞的活性，20 μg/mL 外泌體不影響乳腺癌細胞的活性，因此選用20 μg/mL 外泌體進行后續(xù)功能實驗。

圖2 MC3T3-E1 細胞來源外泌體對乳腺癌細胞活性的影響A：4T1 細胞CCK-8 活性實驗定量結果；B：MDA-MB-231 細胞CCK-8 活性實驗定量結果Fig.2 MC3T3-E1 derived exosomes on the viability of breast cancer cellsA: Quantitative results of CCK-8 activity assay in 4T1 cells; B: Quantitative results of CCK-8 activity assay in MDA-MB-231 cells

3 MC3T3-E1 細胞來源的外泌體促進乳腺癌細胞遷移 通過劃痕實驗和Transwell 實驗檢測MC3T3-E1 細胞來源外泌體對乳腺癌4T1 和MDA-MB-231細胞增殖的影響，實驗分組設置為對照組(4T1 和MDA-MB-231 培養(yǎng)于DMEM 完全培養(yǎng)基)和實驗組(4T1 和MDA-MB-231 培養(yǎng)于添加濃度為20 μg/mL的MC3T3-E1 細胞來源外泌體的DMEM 完全培養(yǎng)基)，劃痕實驗結果顯示，外泌體可以促進細胞向中間空白領域遷移，4T1 對照組遷移率為65.1% ±4.8%，實驗組的遷移率為73.3% ± 5.1%，實驗組的遷移率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，MDA-MB-231 對照組的遷移率為60.2% ±8.3%，實驗組的遷移率為75.8% ± 7.0%，實驗組的遷移率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，見圖3A；Transwell 實驗結果顯示，4T1 對照組的遷移數目為150 ± 7，實驗組的遷移數目為394 ± 19，實驗組的遷移數目高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，MDA-MB-231 對照組的遷移數目為147 ± 16，實驗組的遷移數目為433 ±43，實驗組的遷移數目高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，見圖3B。

圖3 MC3T3-E1 細胞來源外泌體對乳腺癌細胞遷移能力的影響(200×)A：劃痕實驗鏡下觀察和定量結果；B：Transwell 實驗鏡下觀察和定量結果Fig.3 MC3T3-E1 derived exosomes on the migration of breast cancer cells (200×)A: Observation under the microscope of the scratch test and quantitative results of the scratch test; B: Observation under the microscope of the transwell test and quantitative results of the transwell test

4 MC3T3-E1 細胞來源外泌體促進乳腺癌細胞的增殖 通過CCK-8 實驗和克隆形成實驗檢測MC3T3-E1 細胞外泌體對乳腺癌4T1 和MDA-MB-231 細胞增殖的影響，CCK-8 結果顯示，5 d 時，4T1 對照組的OD 值為2.285 ± 0.350，實驗組的OD 值為2.944 ± 0.384，實驗組與對照組的克隆形成數有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，MDA-MB-231 對照組的OD 值為2.249 ± 0.362，實驗組的OD 值為2.934 ± 0.379，實驗組與對照組的OD 值有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，提示MC3T3-E1 細胞外泌體對乳腺癌4T1 和MDA-MB-231 細胞增殖有顯著促進作用(圖4A)。通過克隆形成實驗檢測MC3T3-E1 細胞外泌體對乳腺癌4T1 和MDA-MB-231 細胞增殖情況的影響，結果顯示4T1 對照組的克隆形成數目為17 ± 2 個，實驗組的克隆形成數目為32 ±2 個，實驗組與對照組的克隆形成數有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，MDA-MB-231 對照組的克隆形成數目為11 ± 1 個，實驗組的克隆形成數目為16 ±1 個，實驗組與對照組的克隆形成數有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，提示MC3T3-E1 細胞外泌體對乳腺癌4T1 和MDA-MB-231 細胞克隆形成也有顯著促進作用(圖4B)。

圖4 MC3T3-E1 細胞來源外泌體對乳腺癌細胞增殖能力的影響A：CCK-8 增殖實驗定量結果；B：克隆形成實驗和定量結果Fig.4 Effecf on MC3T3-E1 derived exosomes on the proliferation of breast cancer cellsA: Quantitative results of CCK-8 proliferation experiment; B: Colony formation assay and quantitative results

討 論

骨是主要由成骨細胞和破骨細胞介導的代謝極其活躍的組織，成骨細胞能促進腫瘤細胞在骨微環(huán)境中的定植和生長[8]?，F已有多項研究表明成骨細胞在促進腫瘤細胞的骨內增殖和骨轉移方面起著關鍵作用[9-10]。成骨細胞能夠分泌一些細胞因子來促進腫瘤細胞的骨轉移[11]。同時也有報道顯示，骨微環(huán)境中的外泌體可介導基質細胞與癌細胞之間的互相作用，從而介導腫瘤細胞在骨中的存活、定植和轉移[12-17]，但成骨細胞來源的外泌體對腫瘤細胞影響的研究還很缺乏，成骨細胞來源的外泌體對腫瘤細胞是否有促增殖遷移作用目前也沒有明確研究。因此，本研究以成骨前體細胞和乳腺癌為切入點，探討成骨前體細胞來源的外泌體對乳腺癌骨轉移的影響，旨在為乳腺癌骨轉移領域的進一步研究提供依據。

研究表明，外泌體是一種直徑30 ～ 200 nm 的雙層脂質膜結構囊泡，外泌體鑒定分析主要是從三方面進行分析：(1)透射電子顯微鏡分析外泌體的形貌；(2)納米粒子示蹤分析統(tǒng)計外泌體的粒徑分布情況；(3)蛋白質印跡分析外泌體所攜帶的蛋白標志物[18]。本研究提取的MC3T3-E1 來源外泌體透射電鏡觀察下為脂質雙分子層形成的囊泡結構，粒徑檢測顯示外泌體直徑分布在100 ～ 200 nm，Western blot 結果顯示外泌體中有Alix 和TSG101外泌體標志蛋白的表達，不表達核蛋白質Lamin A/C，符合外泌體的特征及鑒定標準。

為了確定功能試驗使用的適宜外泌體濃度，本研究將MC3T3-E1 來源的外泌體設置為不同濃度梯度(20 μg/mL、30 μg/mL、50 μg/mL)并分別與乳腺癌細胞4T1 和MDA-MB-231 共培養(yǎng)，檢測外泌體對乳腺癌細胞活性的影響，同時設定不加外泌體的乳腺癌細胞對照組，在培養(yǎng)24 h 后，采用CCK-8 法對乳腺癌細胞的活性進行檢測，發(fā)現相比對照組，20 μg/mL 的MC3T3-E1 來源外泌體對乳腺癌細胞的活性沒有影響，同時30 μg/mL、50 μg/mL 外泌體能降低乳腺癌細胞的活性。短時間的外泌體處理對乳腺癌細胞活性產生抑制作用，可能是由于大量外源物質隨外泌體進入乳腺癌細胞中，對細胞內正常生物學過程有較大影響，同時高濃度外泌體通過質膜融合方式進入細胞可能會影響細胞膜穩(wěn)定性，并非正常生理條件下外泌體對乳腺癌細胞的作用，但以上推測需進一步實驗驗證，后續(xù)功能試驗選擇無活性抑制的20 μg/mL 濃度外泌體進行。

本研究將MC3T3-E1 來源的外泌體與乳腺癌細胞共培養(yǎng)進行劃痕實驗和Transwell 實驗，發(fā)現成骨細胞前體細胞MC3T3-E1 來源外泌體能夠促進乳腺癌細胞的遷移。同時本研究通過CCK-8 增殖實驗和克隆形成實驗，發(fā)現MC3T3-E1 來源外泌體能夠促進乳腺癌細胞的增殖，外泌體的促增殖作用已經在很多研究中得到證實[19-22]，外泌體促腫瘤細胞遷移及在骨組織中早期定植的作用已經在一些研究中得到證實，研究表明來自間充質干細胞釋放的脂肪細胞來源外泌體通過Hippo 信號通路促進了乳腺癌細胞的增殖和遷移[23]。也有研究表明乳腺癌分泌的外泌體通過促進破骨細胞的分化來建立骨組織中預轉移微環(huán)境進而促進乳腺癌的遷移和定植[24]。腫瘤細胞來源的外泌體通過誘導脂肪細胞中的米色/棕色分化和代謝重編促進腫瘤的進展[25]。本研究在此基礎上證明成骨細胞前體細胞的外泌體有促進乳腺癌細胞遷移和增殖的作用，但具體分子機制尚需進一步實驗驗證。

有研究表明，p38-MAPK、NF-κB、RAS/ERK等信號通路對腫瘤的發(fā)生發(fā)展和預后有一定的影響[26-34]，其中p38-MAPK 信號轉導通路存在于大多數真核細胞內，通過參與調控細胞的一系列生理活動發(fā)揮功能，p38-MAPK 信號轉導通路磷酸化后可調節(jié)細胞生長和增殖，抑制p38-MAPK 通路可抑制乳腺癌細胞的增殖和轉移[35]。miRNA 作為外泌體內含物的重要組成部分，能夠調節(jié)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[36-39]。有研究顯示，成骨細胞來源外泌體內高峰度攜帶miR-21[40]，miR-21 可通過上調p38 信號通路促進乳腺癌的增殖和遷移能力[41]。此前也有研究表明，外泌體介導的促增殖遷移作用可通過Hippo 信號通路或通過誘導靶細胞調控自身DNA 合成和細胞周期活動，進而實現促進靶細胞增殖遷移的作用[42-45]。推測成骨細胞前體細胞來源的外泌體可能通過p38-MAPK 信號通路、Hippo 信號通路或誘導靶細胞調控自身DNA 合成和細胞周期活動來促進乳腺癌細胞的增殖，后續(xù)將通過一系列功能試驗驗證是否是成骨細胞前體細胞來源外泌體中的miR-21 通過Hippo 信號通路或p38-MAPK 信號通路促進乳腺癌的遷移和增殖。

綜上所述，本研究在體外驗證了MC3T3-E1來源的外泌體可以促進乳腺癌的遷移和增殖，但相關機制仍需深入探討，探究這些機制可能為開發(fā)新的乳腺癌治療方法以及改善乳腺癌骨轉移提供理論支持。本實驗僅局限于體外水平，后期將進一步通過體內動物實驗驗證MC3T3-E1 來源外泌體在乳腺癌中發(fā)揮的具體作用。

作者貢獻陽琴娜：進行實驗，撰寫論文；千年松、李英賢：指導實驗思路；元欣欣、杜銳凱、厲建偉：指導實驗設計。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突。

數據共享聲明本篇論文相關數據可依據合理理由從作者處獲取，Email：cheernanayang@163.com。