李天琪，孟祥博，霍 娜，蔡 川，李帥臣，周孫欣，張 彤

1 解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心口腔科，北京 100853

目前全世界約4.6 億人患糖尿病，其中90%以上是以胰島素抵抗和胰島功能障礙為主要發(fā)病機(jī)制的2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)[1]。研究顯示2 型糖尿病患者頜骨骨質(zhì)更疏松，骨小梁間隙更大[2]。頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(jaw bone marrow mesenchymal stem cells，JBMMSCs)是源于頜骨骨髓的一類具有高度自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，具有成骨、成脂、成軟骨等多向分化能力，是骨組織修復(fù)與再生的基礎(chǔ)[3]。但2 型糖尿病對(duì)JBMMSCs 成骨分化能力的影響及其機(jī)制尚不清楚。本課題擬探討2 型糖尿病狀態(tài)下頜骨組織來源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)變化及成骨分化中Wnt 信號(hào)通路相關(guān)分子的變化規(guī)律，為進(jìn)一步研究通過調(diào)控Wnt 信號(hào)通路恢復(fù)2 型糖尿病環(huán)境下JBMMSCs 成骨能力提供基礎(chǔ)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 10 只12 周齡SPF 級(jí)雄性Wistar 大鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006]；10 只12 周齡SPF 級(jí)雄性GK 大鼠購(gòu)于常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：(SCXK(蘇)2021-0013]。本課題已通過解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查(批準(zhǔn)號(hào)：2022-X18-20)。

2 材料、試劑與儀器 血糖儀(羅氏-活力型)；45%高脂飼料(無錫帆泊生物技術(shù)有限公司，中國(guó))；α-MEM 培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))；胎牛血清(BI，以色列)；1%青霉素-鏈霉素、0.25%胰蛋白酶-EDTA、PBS(中科邁晨，中國(guó))；Ⅱ型膠原酶(Sigma,美國(guó))；成骨誘導(dǎo)試劑盒(賽業(yè)，中國(guó))；成脂誘導(dǎo)試劑盒(Gibco，美國(guó))；CCK-8 試劑盒(東仁，日本)；Annexin V-PE/7-AAD 凋亡檢測(cè)試劑盒(Sino Biological，中國(guó))；RNA 提取試劑盒(天根生化科技，中國(guó))；BCA 蛋白定量試劑盒(Thermo Fisher，美國(guó))；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，日本)；4%多聚甲醛、油紅O 染色試劑盒、0.2%茜素紅染色液(索萊寶，中國(guó))；BCIP/NBT 堿性磷酸酯酶顯色試劑盒、結(jié)晶紫染色液(碧云天，中國(guó))；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó))；流式細(xì)胞儀(BD Celesta，美國(guó))；酶標(biāo)儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國(guó))。

3 2 型糖尿病大鼠模型的構(gòu)建 GK 大鼠是目前常用的非肥胖自發(fā)性2 型糖尿病模型，其高血糖是由胰島素分泌受損和胰島素抵抗引起的，與人類2 型糖尿病進(jìn)展極為相似[4]。GK 大鼠以45%高脂飼料喂養(yǎng)，12 ～ 13 周齡時(shí)每周固定時(shí)間測(cè)量血糖和體質(zhì)量，以GK 大鼠連續(xù)兩次隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L 作為建模成功的標(biāo)準(zhǔn)[5]。相同周齡的Wistar 大鼠作為對(duì)照，以普通飼料喂養(yǎng)，每周相同時(shí)間測(cè)量血糖和體質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)選取10 只造模成功的GK 大鼠作為2 型糖尿病組，10 只Wistar 大鼠為對(duì)照組。

4 JBMMSCs 的分離與培養(yǎng) 選取建模成功的10 只13 周齡GK 大鼠及10 只13 周齡Wistar 大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉(2 mL/kg)，頸椎脫臼處死，75%乙醇浸泡30 min 后轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)。無菌條件下解剖下頜骨，去除下頜骨上附著的皮膚、肌肉、全部牙齒；使用咬骨鉗去除兩端后暴露骨髓腔，用含有10% FBS、1%青霉素-鏈霉素的α-MEM 完全培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，收集頜骨骨髓沖洗液至15 mL 離心管中，800 r/min 離心3 min，去上清，1 mL 完全培養(yǎng)基重懸。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有9 mL 完全培養(yǎng)基的10 cm 皿中，放置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。沖洗后的下頜骨用咬骨鉗分割成1 ～ 3 mm3骨片并將其轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中，加入 0.1% Ⅱ型膠原酶3 mL，置于200 r/min 搖床上；37℃ 、200 r/min 條件下消化 90 min；800 r/min 離心3 min，去上清，3 mL完全培養(yǎng)基重懸，將骨片轉(zhuǎn)移至含有頜骨骨髓沖洗液的培養(yǎng)皿中，放置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。接種72 h 后半換液，以后每2 d 換液1 次。倒置相差顯微鏡下觀察頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)特點(diǎn)，細(xì)胞匯合度達(dá)到80% ～ 90%時(shí)按1∶2 的比例傳代，第2 次傳代時(shí)去除骨片，取第3 ～ 5 代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

5 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的各組第3 代JBMMSCs，以2000/孔接種到96 孔板中，連續(xù)培養(yǎng)8 d，每3 d 換液1 次；于接種后1 ～8 d 每天檢測(cè)細(xì)胞的增殖活力，吸棄原有培養(yǎng)基，每孔加入90 μL 的完全培養(yǎng)基和10 μL 的CCK-8試劑，37℃培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處的OD 值并繪制細(xì)胞增殖曲線。

6 JBMMSCs 克隆形成率檢測(cè) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的各組第3 代JBMMSCs，以1 000/皿接種到直徑為10 cm 的培養(yǎng)皿中，在37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d 換液1 次，連續(xù)培養(yǎng)15 d 后進(jìn)行結(jié)晶紫染色。PBS 清洗3 遍，甲醇固定5 min，結(jié)晶紫染色5 min，PBS 清洗多次至無多余染液，室溫下晾干并拍照觀察。

7 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 收集各組第3 代JBMMSCs，用4℃預(yù)冷的PBS 洗細(xì)胞2 次，離心后去上清用Binding Buffer 重懸細(xì)胞至5 × 106/mL，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，每管100 μL。Wistar 組和GK 組每組4 管：一管為陰性對(duì)照組，一管加入5 μL Annexin V-PE，一管加入5 μL 7-AAD，一管加入5 μL Annexin V-PE 和5 μL 7-AAD；輕輕混勻，室溫避光孵育15 min 后加入400 μL Binding Buffer 終止反應(yīng)，上機(jī)檢測(cè)。在細(xì)胞凋亡早期，磷脂酰絲氨酸暴露于細(xì)胞表面，但細(xì)胞膜不具有通透性，因此Annexin V 可以與細(xì)胞結(jié)合，但細(xì)胞拒染7-AAD，因此早期凋亡細(xì)胞為Annexin V 陽性、7-AAD 陰性。在凋亡晚期，7-AAD 可以通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞與DNA 結(jié)合，同時(shí)Annexin V 進(jìn)入細(xì)胞與磷脂酰絲氨酸結(jié)合，因此凋亡晚期的細(xì)胞表現(xiàn)為Annexin V 和7-AAD 雙陽性。

8 成骨誘導(dǎo)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)及茜素紅染色 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的各組第3 代JBMMSCs 以1 × 105/孔接種于六孔板中，細(xì)胞匯合度達(dá)70%時(shí)更換為成骨誘導(dǎo)液，每3 ～ 4 d換液。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d 后按照BCIP/NBT 堿性磷酸酯酶顯色試劑盒的說明書進(jìn)行ALP 染色實(shí)驗(yàn)。成骨誘導(dǎo)分化21 d 時(shí)進(jìn)行茜素紅染色實(shí)驗(yàn)，吸去六孔板中的液體，PBS 清洗3 次，4%多聚甲醛溶液室溫固定30 min 后吸去固定液，PBS 清洗3 次，每孔加入2 mL 茜素紅工作液，室溫染色5 min，吸去多余染色液，PBS 清洗多次至無多余染液，顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)數(shù)量。

9 成脂誘導(dǎo)及油紅O 染色 將各組第3 代JBMMSCs 以1 × 105/孔接種于六孔板中，細(xì)胞匯合度達(dá)70%時(shí)更換為成脂誘導(dǎo)液，每3 ～ 4 d 換液。成脂誘導(dǎo)14 d 時(shí)按照油紅O 染色試劑盒說明書的步驟進(jìn)行油紅O 染色，并在顯微鏡下觀察脂滴數(shù)量。

10 qRT-PCR 檢測(cè)成骨、成脂及Wnt 信號(hào)通路相關(guān)基因的mRNA 表達(dá) 將各組第3 代JBMMSCs以1 × 105/孔接種于六孔板，細(xì)胞匯合至70%時(shí)更換為成骨或成脂誘導(dǎo)液，每3 ～ 4 d 換液1 次，連續(xù)培養(yǎng)7 d 后使用RNA 提取試劑盒提取總RNA，使用酶標(biāo)儀測(cè)定RNA 濃度，以500 ng RNA 為模板，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa)的說明書合成cDNA。采用SYBR Green 熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)成骨相關(guān)基因ALP、骨鈣素(osteocalcin，OCN)、Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor-2，Runx2)、成脂相關(guān)基因脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)、過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptorγ，PPARγ)及Wnt 信號(hào)通路相關(guān)基因的mRNA 表達(dá)水平；相關(guān)引物均由上海生工合成，引物序列見表1。

表1 相關(guān)基因引物序列Tab. 1 Primer sequences of related genes

11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用Graphpad Prism 9.0 軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±表示，各組采用正態(tài)性檢驗(yàn)，兩組間樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 2 型糖尿病大鼠模型構(gòu)建情況 2 型糖尿病組大鼠隨機(jī)血糖為(24.63 ± 5.123) mmol/L，對(duì)照組隨機(jī)血糖為(9.220 ± 0.957) mmol/L (P＜0.001)，2 型糖尿病組體質(zhì)量為(360.5 ± 18.65) g，對(duì)照組體質(zhì)量為(598.4 ± 35.88) g (P＜0.001)。2 型糖尿病組大鼠隨機(jī)血糖＞16.7 mmol/L，體質(zhì)量顯著低于對(duì)照組，毛色發(fā)黃，毛發(fā)臟亂，并存在多飲多食多尿的表現(xiàn)，符合2 型糖尿病的特征(圖1)。

圖1 對(duì)照組和2 型糖尿病組隨機(jī)血糖和體質(zhì)量Fig.1 Randomized blood glucose and weight in control and T2DM groups

2 大鼠JBMMSCs 細(xì)胞形態(tài) 對(duì)照組和2 型糖尿病組JBMMSCs 分離培養(yǎng)3 d 后，鏡下可見少量貼壁生長(zhǎng)的長(zhǎng)梭形或三角形細(xì)胞，以及大量圓形、較亮的血細(xì)胞；隨著換液次數(shù)的增加，血細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，JBMMSCs 不斷分裂增殖，數(shù)量增加，7 d 左右匯合度可達(dá)80%，按1∶2 的比例進(jìn)行傳代，細(xì)胞純化后增殖速度變快，3 d 后匯合度可達(dá)80% ～ 90%。顯微鏡下觀察可見對(duì)照組和2 型糖尿病組第1 代JBMMSCs 均呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞形態(tài)無顯著差異(圖2)。

圖2 對(duì)照組和2 型糖尿病組JBMMSCs 鏡下形態(tài)觀察A：原代培養(yǎng)第3 天；B：原代培養(yǎng)第5 天；C：第1 代(標(biāo)尺=100 μm)Fig.2 Morphological observation of JBMMSCs in control and T2DM groups (bar=100 μm)A: P0 passage on day3; B:P0 passage on day5; C: P1 passage

3 兩組JBMMSCs 活力及克隆能力比較 CCK-8法檢測(cè)對(duì)照組和2 型糖尿病組JBMMSCs 連續(xù)培養(yǎng)1 ～ 8 d 的增殖數(shù)量變化，兩組JBMMSCs 均呈現(xiàn)出穩(wěn)定的體外擴(kuò)增能力，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線均類似“S”形，但2 型糖尿病組細(xì)胞生長(zhǎng)較對(duì)照組平緩。第1、2 天兩組細(xì)胞的增殖能力無顯著差異，2 d后兩組細(xì)胞均進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，但對(duì)照組細(xì)胞增殖速度更快，450 nm 處的OD 值明顯大于2 型糖尿病組；6 d 后兩組細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯放緩，但對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)量仍多于2 型糖尿病組(圖3A)。兩組JBMMSCs 以較低密度接種至直徑10 cm 的培養(yǎng)皿中，常規(guī)培養(yǎng)15 d 后鏡下可見克隆形成，散在分布。0.2%結(jié)晶紫溶液染色后，克隆呈藍(lán)色，對(duì)照組的克隆數(shù)顯著多于2 型糖尿病組(圖3B)，說明2 型糖尿病顯著抑制JBMMSCs 的克隆形成能力。流式檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組凋亡早期細(xì)胞占比1.37%，凋亡晚期6.73%，2 型糖尿病組凋亡早期細(xì)胞占比3.11%，凋亡晚期10.6%(圖3C)；對(duì)照組凋亡細(xì)胞比例明顯低于2 型糖尿病組。

4 兩組大鼠JBMMSCs 成骨及成脂分化能力比較qRT-PCR 顯示，成骨誘導(dǎo)7 d 后對(duì)照組和2 型糖尿病組JBMMSCs 成骨相關(guān)基因ALP、OCN、Runx2 的表達(dá)均升高(P＜0.05)；2 型糖尿病組細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后成骨相關(guān)基因的mRNA 水平低于對(duì)照組(P＜0.05) (圖4A)。成骨誘導(dǎo)7 d 后對(duì)ALP 染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示2 型糖尿病組藍(lán)紫色染色顆粒分布較稀疏，藍(lán)染面積及密度低于對(duì)照組(圖4B)。茜素紅染色結(jié)果顯示對(duì)照組鈣結(jié)節(jié)顆粒數(shù)量及紅染面積明顯多于2 型糖尿病組(圖4C)。成脂誘導(dǎo)7 d 后對(duì)照組和2 型糖尿病組JBMMSCs 成脂相關(guān)基因LPL 及PPARγ 的表達(dá)均升高(P＜0.05)；2 型糖尿病組細(xì)胞成脂誘導(dǎo)后成脂相關(guān)基因的mRNA 水平低于對(duì)照組(P＜0.05) (圖5A)。油紅O 染色結(jié)果顯示對(duì)照組脂滴數(shù)量多于2 型糖尿病組(圖5B)。

圖4 兩組JBMMSCs 成骨分化能力比較A：qRT-PCR 檢測(cè)正常培養(yǎng)和成骨誘導(dǎo)7 d 后對(duì)照組和2 型糖尿病組中成骨相關(guān)基因的mRNA 表達(dá)水平的變化(aP＜0.05，vs 對(duì)照組-未成骨誘導(dǎo)；bP＜0.05，vs 對(duì)照組-成骨誘導(dǎo)；cP＜0.05，vs 2 型糖尿病組-未成骨誘導(dǎo))；B：ALP 染色；C：茜素紅染色Fig.4 Comparison of osteogenic differentiation ability of JBMMSCs between the two groupsA: Changes in mRNA expression levels of osteogenesis-related genes in the control group and the T2DM group after 7 days of normal culture and osteogenesis induction by qRT-PCR (aP＜0.05, vs control-NC group; bP＜0.05, vs control-OS group; cP＜0.05, vs T2DMNC group); B: ALP staining; C: Alizarin red staining

圖5 兩組JBMMSCs 成脂分化能力比較A：qRT-PCR 檢測(cè)正常培養(yǎng)和成脂誘導(dǎo)7 d 后對(duì)照組和2 型糖尿病組中成骨相關(guān)基因的mRNA 表達(dá)水平的變化(aP＜0.05，vs 對(duì)照組-未成脂誘導(dǎo)；bP＜0.05，vs 對(duì)照組-成脂誘導(dǎo)；cP＜0.05，vs 2 型糖尿病組-未成脂誘導(dǎo))；B：油紅O 染色(標(biāo)尺=100 μm)Fig.5 Comparison of adipogenic differentiation ability of JBMMSCs between the two groupsA: Changes in mRNA expression levels of adipogenesis-related genes in the control group and the T2DM group after 7 days of normal culture and adipogenic differentiation induction by qRT-PCR (aP＜0.05, vs control-NC group; bP＜0.05, vs control-AD group;cP＜0.05, vs T2MD-NC group); B: Oil Red O staining (bar=100 μm)

5 2 型糖尿病抑制JBMMSCs 成骨能力的機(jī)制研究 成骨誘導(dǎo)7 d 后對(duì)照組及2 型糖尿病組Wnt信號(hào)通路中的相關(guān)分子β-catenin、Wnt4、Wnt5a、Wnt7b 的mRNA 表達(dá)水平均顯著高于常規(guī)培養(yǎng)。然而成骨誘導(dǎo)7 d 后2 型糖尿病組JBMMSCs 成骨誘導(dǎo)后Wnt4、Wnt5a、Wnt7b 的mRNA 表達(dá)較對(duì)照組增高，β-catenin 的表達(dá)較對(duì)照組低(圖6)。本部分結(jié)果提示W(wǎng)nt 信號(hào)通路促進(jìn)了JBMMSCs 的成骨分化，并且在2 型糖尿病抑制JBMMSCs 成骨分化能力的過程中發(fā)揮了作用。然而成骨誘導(dǎo)7 d 后，β-catenin、Wnt4、Wnt5a、Wnt7b 在2 型糖尿病組與對(duì)照組中的變化趨勢(shì)并不相同，提示W(wǎng)nt 信號(hào)通路中不同分子在2 型糖尿病對(duì)大鼠JBMMSCs 成骨能力的影響過程中發(fā)揮了不同作用。

圖6 Wnt 信號(hào)通路相關(guān)分子mRNA 水平在兩組JBMMSCs 成骨誘導(dǎo)過程中的變化(aP＜0.05，vs 對(duì)照組-未成骨誘導(dǎo)；bP＜0.05，vs 對(duì)照組-成骨誘導(dǎo)；cP＜0.05，vs 2 型糖尿病組-未成骨誘導(dǎo))Fig.6 Changes in mRNA levels of Wnt signaling pathway-related molecules during osteogenesis induction (aP＜0.05, vs control-NC group; bP＜0.05, vs control-OS group; cP＜0.05, vs T2DMNC group)

討 論

糖尿病既可以促進(jìn)牙周病發(fā)展，又可以影響種植牙的骨結(jié)合、引發(fā)種植體周圍炎；糖尿病患者種植體周圍骨吸收量增加，術(shù)后穩(wěn)定性差[6-7]。有學(xué)者通過體外構(gòu)建高糖微環(huán)境來模擬2 型糖尿病，將大鼠JBMMSCs 在高糖培養(yǎng)基中誘導(dǎo)成骨培養(yǎng)7 d 后，細(xì)胞中ALP 和Runx2 蛋白的表達(dá)較低糖培養(yǎng)基低[8]。但體外的高糖環(huán)境無法完全模擬2 型糖尿病患者頜骨中的環(huán)境。因此，本實(shí)驗(yàn)選取與人類2 型糖尿病發(fā)生發(fā)展過程相似的GK大鼠作為2 型糖尿病組，選取相同周齡的Wistar大鼠作為對(duì)照[9]。

頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有較強(qiáng)增殖能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，病理因素、理化因素及生物因素均可影響其生物學(xué)特性[10]。本實(shí)驗(yàn)成功分離培養(yǎng)了來源于大鼠的JBMMSCs，并對(duì)其增殖、分化等生物學(xué)性能進(jìn)行了分析與比較。體外培養(yǎng)條件下對(duì)照組與2 型糖尿病組JBMMSCs 貼壁生長(zhǎng)，并呈長(zhǎng)梭形的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，無顯著差異。CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力，與對(duì)照組相比，2 型糖尿病組JBMMSCs 的細(xì)胞增殖較緩慢，克隆形成能力較低。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，2 型糖尿病促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，處于凋亡期的細(xì)胞比例高于對(duì)照組。同時(shí)，2 型糖尿病可抑制細(xì)胞的成骨與成脂分化能力。JBMMSCs 成骨誘導(dǎo)及成脂誘導(dǎo)7 d 后2 型糖尿病組成骨、成脂相關(guān)基因的mRNA 表達(dá)均低于對(duì)照組，ALP 染色結(jié)節(jié)的數(shù)量也顯著降低，產(chǎn)生的脂滴數(shù)量也顯著少于對(duì)照組。研究表明，與正常來源JBMMSCs 相比，糖尿病來源的JBMMSCs 增殖及成骨分化能力顯著減弱，這與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果一致[11]。

目前關(guān)于2 型糖尿病對(duì)頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化影響機(jī)制的研究較少。2 型糖尿病豬拔牙后牙槽窩的生長(zhǎng)分化因子11(growth differentiation factor 11，GDF11)的mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，降低GDF11 的表達(dá)可提高2 型糖尿病來源的JBMMSCs 成骨能力，促進(jìn)2 型糖尿病條件下拔牙窩的愈合[12]。種植失敗糖尿病患者牙槽骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的黏附、遷移和成骨分化能力顯著低于種植成功糖尿病患者和正?；颊?，整合素亞單位α10(ITGA10)的表達(dá)也低于種植成功糖尿病患者和正?；颊撸籌TGA10 基因敲除可顯著降低JBMMSCs 的黏附和遷移能力，并通過干擾FAK/PI3K/AKT/GSK3β/β-catenin 通路抑制其成骨分化潛能[13]。陸玖青等[11]研究發(fā)現(xiàn)2 型糖尿病大鼠來源的JBMMSCs 中NF-κB p65 核蛋白的mRNA 及蛋白表達(dá)增加，并推測(cè)NF-κB 可能參與2 型糖尿病抑制JBMMSCs 成骨分化能力的過程。抑制miR-203-3p 的表達(dá)可上調(diào)BMP/Smad 信號(hào)通路，促進(jìn)體外高糖環(huán)境下JBMMSCs 的成骨分化[8]。糖尿病組JBMMSCs 的胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2 的mRNA 表達(dá)和蛋白翻譯水平顯著高于非糖尿病組[14]。

Wnt 信號(hào)通路是調(diào)控干細(xì)胞增殖和多向分化的關(guān)鍵途徑，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分化關(guān)系密切[15]。根據(jù)是否依賴β-catenin 可分為經(jīng)典通路與非經(jīng)典通路；非經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路主要分為Wnt/Ca2+和Wnt/平面細(xì)胞極性信號(hào)通路[16]。目前的研究表明糖尿病性骨質(zhì)疏松癥與Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)系密切，2 型糖尿病患者血清中骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物及β-catenin 含量顯著低于對(duì)照組[17]。Gassel等[18]的研究結(jié)果顯示，患有夏科氏關(guān)節(jié)病的2 型糖尿病患者下肢骨組織中Wnt3a、Wnt5a 的mRNA表達(dá)水平低于正常組。經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路激活后，細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin 含量升高并向細(xì)胞核中遷移，激活靶基因進(jìn)而引起下游的一系列反應(yīng)[19]。Wnt4、Wnt5a、Wnt7b 是非經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路的啟動(dòng)子，但也可以通過經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路發(fā)揮作用[20-22]。在本實(shí)驗(yàn)中2 型糖尿病組JBMMSCs 成骨誘導(dǎo)后Wnt 信號(hào)通路相關(guān)分子Wnt4、Wnt5a、Wnt7b 的mRNA 表達(dá)水平較對(duì)照組升高，β-catenin的mRNA 表達(dá)水平較對(duì)照組降低，說明2 型糖尿病影響下經(jīng)典及非經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路可能均參與了對(duì)頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的調(diào)控過程，并且Wnt4、Wnt5a、Wnt7b 可能通過非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路發(fā)揮作用。但Wnt 信號(hào)通路調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其調(diào)控具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，2 型糖尿病會(huì)影響頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、克隆及分化能力。2 型糖尿病影響下JBMMSCs 的增殖、克隆、成骨及成脂分化能力均降低，成骨分化過程中Wnt 信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)也有所改變。但若要明確2 型糖尿病通過Wnt 信號(hào)通路對(duì)JBMMSCs 具體調(diào)控機(jī)制，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

作者貢獻(xiàn)李天琪：細(xì)胞及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，文章撰寫；孟祥博：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；霍娜：課題設(shè)計(jì)與指導(dǎo)；蔡川：文章修改，文章審閱和校正；李帥臣：文獻(xiàn)收集和整理；周孫欣：統(tǒng)計(jì)分析；張彤：寫作指導(dǎo)，修訂，終審論文。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突。

數(shù)據(jù)共享聲明本篇論文相關(guān)數(shù)據(jù)可依據(jù)合理理由從作者處獲取，Email：619028753@qq.com。