鄒蓉芳，畢魯南，黃 陽，馮暄淇，馮 璐，江小霞，李 伶，鄧 斌

1 解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心口腔科，北京 100853；3 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所，北京 100850；4 山東工業(yè)陶瓷研究設(shè)計院有限公司，山東淄博255000

氮化硅是一種新型生物陶瓷材料，具有良好的生物相容性和機械性能，近年來作為關(guān)節(jié)植入物在骨科廣泛應(yīng)用[1]，并且逐漸顯現(xiàn)出應(yīng)用于牙科種植體的潛力[2]。大量研究證實，氮化硅具有良好的成骨性[3-4]，能夠促進(jìn)MC3T3-E1、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等一系列成骨細(xì)胞的增殖、礦化和成骨基因上調(diào)的增強[5]，而且對口腔病原體牙齦卟啉單胞菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抑菌性均優(yōu)于純鈦和氧化鋯[6-7]，有助于種植體的長期穩(wěn)定并減少種植體周圍炎的發(fā)生。

傳統(tǒng)干壓燒結(jié)的氮化硅人體植入物需要模具制備及后期切削等環(huán)節(jié)，工藝繁復(fù)冗雜，無法進(jìn)行個性化定制。對于需要高精度、個性化定制的牙科種植體來說，引進(jìn)新的成型工藝，如數(shù)字光處理成型技術(shù)[8-9]，能夠解決個性化陶瓷植入物的成型問題[10-11]。數(shù)字光處理成型氮化硅陶瓷制備過程中添加了光敏樹脂、光引發(fā)劑、分散劑等成分，這些成分在經(jīng)過脫脂燒結(jié)后已基本除凈[12]，但應(yīng)用于人體之前，仍需對其生物安全性重新評價。本研究引入數(shù)字光處理成型技術(shù)制備氮化硅牙科種植體，對其生物安全性進(jìn)行初步評價，并觀察其微觀結(jié)構(gòu)特征，評估機械性能，分析數(shù)字光處理成型氮化硅是否符合牙科陶瓷應(yīng)用的基本要求，進(jìn)一步探討其作為牙科種植體的應(yīng)用潛力。

材料與方法

1 主要材料、試劑與儀器 氮化硅(UBE，日本)；氧化鋁、氧化釔(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，上海)；光敏樹脂單體1，6-己二醇二丙烯酸酷(HDDA)、乙氧化季戊四醇四丙烯酸醋(PPTTA)、環(huán)三羥甲基丙烷甲縮醛丙烯酸醋(CTFA)、光引發(fā)劑苯基雙(2,4,6-三甲基苯甲?；?氧化膦[德國良制化學(xué)(中國)有限公司，上海]；分散劑SOLSPERSE 45000(艾尼韋爾，天津)；數(shù)字光處理成型陶瓷打印機(LITHOZ，奧地利)；超聲震蕩機(潔盟，深圳)；管式爐(納博熱，德國)；馬弗爐(納博熱，德國)；氣氛壓力燒結(jié)爐(島津，日本)；萬能力學(xué)試驗機(島津，日本)；掃描電鏡(蔡司，德國)；X 線衍射儀(布魯克D8，德國)；L-929小鼠成纖維細(xì)胞(軍事科學(xué)院細(xì)胞庫)；DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基(普諾賽，武漢)；胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗、0.25%胰蛋白酶消化液(Biological Industries，以色列)；磷酸鹽緩沖液(PBS，賽默飛，美國)，CCK-8 試劑盒 (碧云天，中國)，活/死細(xì)胞雙染色試劑盒 (亞科因，美國) ；細(xì)胞凋亡熒光Hoechst 33342/PI 雙染試劑盒(索萊寶，北京)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(賽默飛，美國)；超速離心機(Thermo，美國)；ELISA 酶標(biāo)儀 (TECAN，德國)。

2 數(shù)字光處理氮化硅試件的制備 使用三維建模軟件設(shè)計氮化硅試件，3 mm × 4 mm × 40 mm 長方體試條用于力學(xué)性能測試，直徑5 mm，厚度0.5 mm 的圓片用于生物安全性試驗。使用數(shù)字光處理陶瓷打印機，曝光強度900 mJ/cm3，切片層厚20 μm，坯體成型后在600℃下對其進(jìn)行脫脂燒結(jié)。以 2℃/min 的升溫速率升溫至1 670℃，保溫2 h 后，以每小時2℃冷卻至室溫。

3 數(shù)字光處理氮化硅微觀結(jié)構(gòu) 掃描電鏡觀察數(shù)字光處理氮化硅表征，X 線衍射儀分析數(shù)字光處理成型氮化硅的晶相構(gòu)成。掃描步長0.02°，掃描范圍2θ 角為10° ～ 70°。

4 數(shù)字光處理成型氮化硅陶瓷機械性能測試(1)密度：采用阿基米德排水法測定試條的實際密度。(2)抗彎強度：使用萬能力學(xué)試驗機對尺寸為3 mm × 4 mm × 40 mm 的試條進(jìn)行三點彎曲試驗。將試條橫放在2 個直徑5 mm 的支撐圓柱上，直徑5 mm 的圓柱以1 mm/min 的速率垂直方向施壓于兩支撐圓柱的中點直至試條斷裂，記錄斷裂載荷，計算試條三點彎曲強度(σ)，公式為其中P 為斷裂載荷(N)，l 為跨距(mm)，ω 為試條寬度4 mm，b 為試條厚度3 mm。每組測試5 根試條取平均值，收集斷裂后的試條，對斷裂面進(jìn)行電鏡掃描并分析。(3)彈性模量：測量跨距，把試條放在支座正中，使試條與支撐輥軸線垂直。按照所測彎曲強度的70%作為加載的載荷上限，以0.1 mm/min 的位移速率加載，使用應(yīng)變片，采用應(yīng)變測量裝置測量試條應(yīng)變，記錄加載過程中載荷與應(yīng)變的變化值，計算試條彈性模量(E)，公式為其中P1、P2分別為試條在線性范圍內(nèi)加載的初、末載荷(N)，L 為試條支座間的距離(mm)，b 為試條寬度4 mm，h 為試條厚度3 mm， ε1、ε2分別為P1、P2對應(yīng)的試條跨中的應(yīng)變。每組測試5 根試條取平均值。(4)斷裂韌性：首先，在試條的3 mm × 40 mm 面使用切割機預(yù)制0.5 mm 深的初始 V 槽，加入3 μm 金剛石拋光膏，使用萬能力學(xué)試驗機引導(dǎo)剃須刀片對初始V 槽進(jìn)一步切割并拋光，控制V 槽總深度為0.8 ～1.2 mm，測量V 槽深度。其次，使用萬能力學(xué)試驗機對試條進(jìn)行四點彎曲實驗。將寬為3 mm，帶有V 槽面朝下放在2 個直徑5 mm 的支撐圓柱上，用2 個直徑5 mm 的圓柱以0.5 mm/min 的速度施加載荷，直至試條斷裂，記錄斷裂載荷并計算斷裂韌度(KIC)。其中P 為斷裂載荷，α 為V 槽深度與樣本寬度的比值，S1為支撐跨距，S2為加載跨距，ω 為樣本寬度(4 mm)，b 為樣本厚度(3 mm)， Y 為應(yīng)力強度形狀系數(shù)(Y=1.988 7)。每組測試5 根試條取平均值。

5 材料浸提液的制備 拋光后的氮化硅圓片依次用無水乙醇、去離子水、丙酮進(jìn)行超聲清洗，空氣中干燥，在121℃、33 MPa 下滅菌30 min，烘箱內(nèi)烘干。按圓片表面積與浸提液介質(zhì) 3 cm2/mL的標(biāo)準(zhǔn)加入完全培養(yǎng)基，置于37℃恒溫?fù)u床浸提72 h，0.22 μm 濾器過濾除菌。

6 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇凍存L929 小鼠成纖維細(xì)胞，使用含10% FBS 和 1% 青霉素/鏈霉素溶液的高葡萄糖DMEM 完全培養(yǎng)基，在95%濕度、5% CO2和37°C 條件下培養(yǎng)，隔日更換培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%融合后進(jìn)行傳代，傳代2 次。吸取培養(yǎng)液，培養(yǎng)皿內(nèi)加入4 mL 胰蛋白酶/EDTA 進(jìn)行消化，1 000 r/min 離心5 min，棄掉上清液，加入10 mL完全培養(yǎng)基，制備細(xì)胞密度為(1 ～ 5)×105/mL 細(xì)胞懸液，分別用于CCK-8 檢測、流式細(xì)胞術(shù)和活死細(xì)胞染色實驗。

7 細(xì)胞毒性實驗 參考國標(biāo)GB/T 16886.5-2017，傳代后的L929 細(xì)胞用2.5 g/L 胰蛋白酶消化， 制成密度為1 × 104/mL 的細(xì)胞懸液。以每孔100 μL接種于96 孔板中。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)1 d，使細(xì)胞貼壁。將材料浸提液按100%、75%、 50%、25%的濃度與完全培養(yǎng)基配比， 分別與培養(yǎng)板內(nèi)原培養(yǎng)液進(jìn)行等量交換后繼續(xù)培養(yǎng)；陰性對照為完全培養(yǎng)基， 無細(xì)胞孔中加入完全培養(yǎng)基作為空白對照。每組設(shè)置6 個副孔，用倒置顯微鏡觀察。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去原培養(yǎng)基，各孔加入200 μL 完全培養(yǎng)基和20 μL CCK-8試劑，置于細(xì)胞孵箱1.5 h，ELISA 酶標(biāo)儀使用450 nm 的紫外光密度測量各組細(xì)胞相對存活率，相對存活率=(實驗組D 值-空白對照組D 值)÷(陰性組D 值-空白對照組D 值)×100%。

8 細(xì)胞活力實驗 將L929 細(xì)胞接種于24 孔板(2 × 104/孔)，在CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁24 h 后加入25%、50%、75%、100%的氮化硅浸提液，再孵育24 h，同時建立陰性對照組。PBS 洗滌細(xì)胞兩次，0.5 mL 染色液(含0.5 μL活細(xì)胞染料和0.5 μL 死細(xì)胞染料)加入細(xì)胞中，37℃下避光孵育30 min。染色后，再用PBS 洗滌兩次，去除多余工作溶液。使用ZEISS 軟件在熒光顯微鏡分析活死細(xì)胞，進(jìn)而評估細(xì)胞活力。

9 細(xì)胞增殖實驗 浸提液培養(yǎng)L929 細(xì)胞 1 d、4 d 和 7 d 后，收集每個培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞周期分析。首先用PBS 洗滌細(xì)胞，4°C 無水乙醇下固定30 min。以850 g 的速度在離心機中離心，棄去上清液。將固定的細(xì)胞再次PBS 洗滌，并在37°C 下用 50 μL RNase (100 μg/mL)處理。4°C 黑暗中用200 μL 碘化丙啶溶液(50 μg/mL 的存儲液)染色30 min。通過流式細(xì)胞術(shù)分析染色的細(xì)胞核以確定G0/G1、S 和G2/M 期細(xì)胞的比例。增殖指數(shù)(PI)根據(jù)公式1 計算如下：

10 統(tǒng)計學(xué)分析 采用 SPSS 22.0 軟件。數(shù)據(jù)以±表示，應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 數(shù)字光處理成型氮化硅微觀結(jié)構(gòu) 數(shù)字光處理成型氮化硅X 線衍射圖譜如圖1A 所示，衍射峰與β 相氮化硅的標(biāo)準(zhǔn)PDF 卡片(PDF#33-1160)完全對應(yīng)。 氮化硅試條表面掃描電鏡如圖1B 所示，柱狀晶呈交錯生長的形貌，發(fā)育良好，晶粒分布均勻，且晶粒間呈現(xiàn)典型的多孔疏松結(jié)構(gòu)。試條側(cè)面(沿打印方向)的SEM 結(jié)果可以觀察到層與層之間的間隙，分布均勻。圖1B (d)顯示斷裂方式多為穿晶斷裂，有部分晶粒拔出。

圖1 數(shù)字光處理成型氮化硅微觀結(jié)構(gòu)A：數(shù)字光處理成型氮化硅X 線衍射圖譜；B：數(shù)字光處理成型氮化硅掃描電鏡鏡下觀察(a、b：氮化硅表面；c、d：氮化硅側(cè)面)Fig.1 Microstructure of silicon nitride by digital light processingA: XRD spectrum of digital light processing silicon nitride; B: SEM observation of digital light processing silicon nitride (a, b: silicon nitride surface SEM; c, d: silicon nitride side SEM)

2 數(shù)字光處理成型氮化硅力學(xué)性能 數(shù)字光處理成型氮化硅試條表面完整無缺陷、開裂(圖2A)。經(jīng)測試，數(shù)字光處理成型氮化硅密度為2.44 g/cm3；力學(xué)性能：彎曲強度為243 MPa，斷裂韌性為2.6 MPa·m1/2，彈性模量為125 GPa(圖2B) 。

圖2 數(shù)字光處理成型氮化硅試條及力學(xué)性能A：數(shù)字光處理成型氮化硅試條；B：數(shù)字光處理成型氮化硅的抗彎強度、彈性模量、斷裂韌性Fig.2 Digital light processing for forming silicon nitride test strips and mechanical propertiesA: Digital light processing for silicon nitride test strip; B: Bending strength, elastic modulus and fracture toughness of silicon nitride formed by digital light processing

3 細(xì)胞毒性 使用不同濃度浸提液培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，顯微鏡下(圖3A)可見實驗組與陰性組細(xì)胞形態(tài)數(shù)量相似，呈梭形和長條形，幾乎完全貼壁，無細(xì)胞離散，且細(xì)胞增殖無抑制。CCK-8 結(jié)果如圖3B 所示，不同濃度浸提液組的吸光度值與陰性對照組無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，浸提液不同濃度組細(xì)胞存活率均大于95%，細(xì)胞毒性分級為0 級。說明數(shù)字光處理氮化硅陶瓷無潛在細(xì)胞毒性。

圖3 L929 細(xì)胞毒性實驗結(jié)果 A：L929 細(xì)胞在不同濃度浸提液作用24 h 后的光鏡下觀察(100×)；B：CCK-8 檢測L929 細(xì)胞活力Fig.3 Cytotoxicity testing results to L929 cell A: Microscopic observation of L929 cells treated with different concentrations of extracts for 24 h (100×); B: Cell viability of L929

4 細(xì)胞活力 將L929 細(xì)胞在各濃度梯度的數(shù)字光處理成型氮化硅陶瓷浸提液中培養(yǎng)24 h，然后進(jìn)行活死細(xì)胞熒光檢測實驗。如圖4 所示，活細(xì)胞顯示為綠色熒光，死細(xì)胞顯示為紅色熒光。陰性對照組檢測到極少量死細(xì)胞，25% 濃度浸提液組檢測到少量死細(xì)胞，50%、75%、100%濃度浸提液組幾乎沒有檢測到死細(xì)胞。25% 浸提液組的活細(xì)胞數(shù)量與對照組基本一致，而50%、75%濃度浸提液組活細(xì)胞數(shù)量有所增加，100%濃度浸提液組活細(xì)胞數(shù)量顯著增加。

圖4 L929 細(xì)胞活死細(xì)胞熒光染色觀察。不同濃度浸提液組與空白對照組相比，活死細(xì)胞量無顯著差異Fig.4 Microscopic observation of live and dead L929 cells by fluorescence staining. There was no significant difference in the amount of live and dead cells between different concentration groups and blank control group

5 細(xì)胞增殖 流式結(jié)果(圖5)表明，100%濃度浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞與空白對照組的細(xì)胞相比，在細(xì)胞周期上沒有顯著差異。在使用流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測細(xì)胞增殖的1 周中可以看出，L929 細(xì)胞在接觸氮化硅陶瓷圓片第1 天即開始增殖，第7 天達(dá)到頂峰。第1、4、7 天，浸提液組增殖指數(shù)分別為52.04%、64.94%、77.52%，對照組分別為56.60%、62.68%、80.20%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測L929 細(xì)胞周期(第1、4、7 天L929 細(xì)胞周期圖)Fig.5 L929 cell cycle assay by flow cytometry (L929 cell cycle diagram at 1 d, 4 d, 7 d)

討 論

根據(jù)“爭奪表面”的原則，生物材料植入物的演變是細(xì)菌定植和組織生長之間的競爭[6]。當(dāng)組織生長充分且快速時，植入物就不容易被細(xì)菌定植[13]。此外，我們認(rèn)為改善植入物的骨整合可以促進(jìn)局部免疫恢復(fù)，同時也有助于預(yù)防長期的種植體周圍炎[14]。因此，我們主張抗菌生物材料必須具有良好的生物相容性，因為這不僅是生物安全的基礎(chǔ)，也是實現(xiàn)長期抗菌的關(guān)鍵。近年研究發(fā)現(xiàn)，氮化硅不僅同時具有抗細(xì)菌黏附和促進(jìn)成骨細(xì)胞生長的特性[7,15]，而且本身具有高強度，具有成為口腔種植體的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

本研究顯示，經(jīng)X 線衍射圖譜對比顯示，數(shù)字光處理成型氮化硅為純凈的β 相氮化硅，不含雜質(zhì)，沒有發(fā)生相的改變。這是其良好成骨性的結(jié)構(gòu)表現(xiàn)，也是下步生物學(xué)性能實現(xiàn)的必要條件。掃描電鏡顯示出典型的層間結(jié)構(gòu)，較好長徑比的柱狀晶和穿晶斷裂的現(xiàn)象，說明數(shù)字光處理成型氮化硅層間結(jié)合良好。且相鄰層的柱狀晶粒相互延伸生長，相互交錯堆疊，進(jìn)一步提高了層間的結(jié)合強度，避免3D 打印氮化硅陶瓷存在的層間結(jié)合不良導(dǎo)致的整體性能的下降。通過對其物相分析，說明數(shù)字光處理成型氮化硅的可行性，為后續(xù)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的種植體奠定了理論基礎(chǔ)。

本研究使用數(shù)字光處理技術(shù)打印制備的氮化硅陶瓷樣品的彈性模量相比臨床投入應(yīng)用的純鈦、鈦合金種植體，更接近骨皮質(zhì)，這有助于減少“應(yīng)力屏蔽”現(xiàn)象，從而減少種植體使用時的應(yīng)力集中。同時因數(shù)字光處理技術(shù)打印的氮化硅陶瓷在排膠過程中去除了大量有機物成分，留下較多氣孔，形成了多孔結(jié)構(gòu)，提高了與人體骨組織的結(jié)合面積，為成骨細(xì)胞的生長提供了良好的附著。在強度上，雖然該配方體系的氮化硅已一定程度上優(yōu)于早前報道的數(shù)字光處理成型氮化硅的彎曲強度[16]，但目前的機械性能不足以應(yīng)用于臨床[17]，后續(xù)將繼續(xù)考慮通過提高氮化硅打印漿料的固相含量[18]，進(jìn)一步提高其抗彎強度。

傳統(tǒng)干壓燒結(jié)的氮化硅陶瓷生物相容性已被證實[19-20]，但對于數(shù)字光處理成型氮化硅陶瓷的生物安全性尚未得到驗證。本研究應(yīng)用小鼠成纖維細(xì)胞L929 對數(shù)字光處理成型氮化硅陶瓷浸提液的生物安全性進(jìn)行了初步評價。

體外細(xì)胞毒性實驗廣泛應(yīng)用于各種醫(yī)學(xué)材料的評價[20]，參考GB/T 16886，本研究選用CCK-8法進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗，測定L929 細(xì)胞在數(shù)字光處理氮化硅陶瓷浸提液中的生長、增殖和損傷情況。L929 細(xì)胞經(jīng)過不同濃度浸提液培養(yǎng)24 h 后，細(xì)胞形態(tài)無變化，正常增殖，說明數(shù)字光處理氮化硅陶瓷對L929 細(xì)胞無毒性；活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)量與陰性對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異，說明數(shù)字光處理氮化硅對細(xì)胞活力未造成消極影響。本實驗將L929 細(xì)胞培養(yǎng)第1、4、7 天測定細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)浸提液組增殖指數(shù)均持續(xù)增長，與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，說明數(shù)字光處理氮化硅對細(xì)胞增殖無消極影響，進(jìn)一步證實了數(shù)字光處理成型氮化硅的生物安全性。

綜上所述，以上三個細(xì)胞實驗互相印證，證明數(shù)字光處理氮化硅陶瓷具有一定的生物安全性，但本研究局限于細(xì)胞水平，后期需體內(nèi)動物實驗進(jìn)一步驗證數(shù)字光處理成型氮化硅的生物相容性。其成骨性和抗菌性也需進(jìn)一步實驗證實。

作者貢獻(xiàn)鄒蓉芳：起草研究方案，進(jìn)行實驗并采集分析數(shù)據(jù)，撰寫論文；畢魯南：負(fù)責(zé)部分材料實驗并采集分析數(shù)據(jù)；黃陽、馮暄淇、馮璐：負(fù)責(zé)部分生物實驗；江小霞、李伶、鄧斌：提出研究思路，最終版本修訂。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突。

數(shù)據(jù)共享聲明本篇論文相關(guān)數(shù)據(jù)可依據(jù)合理理由從作者處獲取，Email：842949795@qq.com。