張歡，胡澤斌，趙代國(guó)，鄒劍龍，蘭婉玲，劉曉飛

·技術(shù)與方法·

電子輸尿管硬鏡的過(guò)氧化氫低溫等離子體滅菌效果研究

張歡*，胡澤斌*，趙代國(guó)，鄒劍龍，蘭婉玲，劉曉飛

611731 成都，四川省藥品檢驗(yàn)研究院（張歡、趙代國(guó)、蘭婉玲、劉曉飛）；100050 北京，中國(guó)食品藥品檢定研究院體外診斷試劑所非傳染病診斷試劑室（胡澤斌）；102600 北京瑞沃醫(yī)療器械有限公司（鄒劍龍）

電子輸尿管硬鏡與圖像處理系統(tǒng)配合使用，可用于輸尿管疾病的檢查、診斷和治療。此類醫(yī)療器械具有安全、術(shù)后并發(fā)癥少、縮短手術(shù)及住院時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)[1]。由于電子輸尿管硬鏡預(yù)期使用過(guò)程中會(huì)接觸人體內(nèi)部組織，因此使用前必須進(jìn)行滅菌達(dá)到無(wú)菌狀態(tài)。醫(yī)院消毒供應(yīng)中心（central sterile supply department，CSSD）常用的滅菌方式包括高壓蒸汽滅菌法、過(guò)氧化氫低溫等離子體滅菌法、甲醛滅菌法等[2-3]。電子輸尿管硬鏡通常由航空插頭、光纜接口、鏡管三部分組成，其中部分材料不耐受高溫（溫度不能高于 60 ℃），因此只能選擇低溫滅菌方式。常用低溫滅菌方式包括環(huán)氧乙烷滅菌、過(guò)氧化氫低溫等離子體滅菌和堿性戊二醛浸泡滅菌等[4-5]，其中過(guò)氧化氫低溫等離子體滅菌法由于滅菌周期短、低溫、不留消毒劑殘余、安裝方便等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于內(nèi)窺鏡等可重復(fù)使用醫(yī)療器械的滅菌[6-7]。對(duì)電子輸尿管硬鏡的過(guò)氧化氫低溫等離子體滅菌效果進(jìn)行研究能為臨床使用后CSSD 等消毒應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 采用北京瑞沃醫(yī)療器械有限公司的 DSNG140600120 型電子輸尿管硬鏡。

1.1.2 儀器 LK/MJQ-100 型過(guò)氧化氫低溫等離子體滅菌器購(gòu)自老肯醫(yī)療科技股份有限公司；BD-240 低溫培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó) Binder 公司；SEG-021H 高溫試驗(yàn)箱購(gòu)自上海愛(ài)斯佩克環(huán)境設(shè)備有限公司；生物安全柜購(gòu)自美國(guó) Thermo Fisher 公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)菌與培養(yǎng)基 菌株為第 3 代嗜熱脂肪桿菌芽孢（ATCC7953）；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）及胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）均為北京三藥科技有限公司的產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 模擬染菌量及干燥時(shí)間的確定 以染色液（含 TRITON X-100 0.5%、甲苯胺藍(lán) 0.05% 的水溶液）模擬菌懸液，分別將 200、100、50、20 μl 的染色液盡量均勻滴加在電子輸尿管硬鏡的鏡管通道內(nèi)壁中，置于 55 ℃干燥 48、48、24 和 12 h 后，觀察樣本是否完全干燥。

1.2.2 3 種滅菌模式 單支檢測(cè)模式組（半周期）：將1 支染菌及干燥后的樣本放置于過(guò)氧化氫低溫等離子體滅菌器中央，按檢測(cè)模式進(jìn)行滅菌；滿載檢測(cè)模式組（半周期）：將 8 支染菌及干燥后的樣本放置于過(guò)氧化氫低溫等離子體滅菌器的四層隔架中，每層 2 支（即為滿載），按檢測(cè)模式進(jìn)行滅菌；滿載標(biāo)準(zhǔn)模式組：將 8 支染菌及干燥后的樣本放置于過(guò)氧化氫低溫等離子體滅菌器的四層隔架中，每層2 支（即為滿載），按標(biāo)準(zhǔn)模式進(jìn)行滅菌。滅菌器專用卡匣的過(guò)氧化氫含量為58% ± 2%，滅菌溫度：45 ～ 60 ℃。

1.2.3 滅菌效果測(cè)試 測(cè)試分為 4 組。測(cè)試組：將滅菌后樣本無(wú)菌操作取出，用 500 ml 無(wú)菌 pH 7.0 磷酸鹽緩沖溶液對(duì)每支樣本進(jìn)行少量多次沖洗（50 ml/次），將所有沖洗液進(jìn)行薄膜過(guò)濾，再將濾膜放入 100 ml TSB 培養(yǎng)基中，置56 ℃培養(yǎng) 7 d；陽(yáng)性回收組：將染菌干燥并未滅菌的樣本無(wú)菌操作取出，用 500 ml pH 7.0 磷酸鹽緩沖溶液對(duì)每支樣本進(jìn)行少量多次沖洗（50 ml/次），將沖洗液適當(dāng)稀釋后傾注平板法計(jì)數(shù)，置 56 ℃培養(yǎng) 48 h；陽(yáng)性對(duì)照組：將染菌時(shí)用的工作菌液（濃度約 108CFU/ml）稀釋至適宜濃度后傾注平板法計(jì)數(shù)，置 56 ℃培養(yǎng) 48 h；陰性對(duì)照組：取同批次 500 ml 無(wú)菌 pH 7.0 磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行薄膜過(guò)濾，再將濾膜放入 100 ml TSB 培養(yǎng)基中，置 56 ℃培養(yǎng) 7 d。

1.2.4 重復(fù)實(shí)驗(yàn) 每種滅菌模式及其對(duì)應(yīng)的 4 個(gè)測(cè)試組均重復(fù)進(jìn)行五輪實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 結(jié)果計(jì)算

2 結(jié)果

2.1 模擬染菌量及干燥時(shí)間測(cè)試結(jié)果

當(dāng)染色液體積為 20 μl、置于 55 ℃干燥 16 h 之后，檢查樣本為干燥狀態(tài)。其余組樣本均未完全干燥（表 1）。因此在正式實(shí)驗(yàn)中均按照染菌量為 20 μl，置于 55 ℃干燥 16 h 進(jìn)行染菌和干燥處理。

表1 模擬染菌量及干燥時(shí)間測(cè)試結(jié)果

染菌量（μl）55 ℃干燥時(shí)間（h）樣本測(cè)試結(jié)果 20048未完全干燥 10048未完全干燥 5024未完全干燥 2016完全干燥

2.2 單支檢測(cè)模式組（半周期）實(shí)驗(yàn)結(jié)果

測(cè)試組及陰性對(duì)照組均無(wú)菌生長(zhǎng)，陽(yáng)性回收組的回收菌量在 1.39 × 106～ 1.58 × 106CFU/支，陽(yáng)性回收率范圍為：76.37% ～ 83.61%，平均陽(yáng)性回收率為 81.11%（表2）。

2.3 滿載檢測(cè)模式組（半周期）實(shí)驗(yàn)結(jié)果

測(cè)試組及陰性對(duì)照組均無(wú)菌生長(zhǎng)，陽(yáng)性回收組的回收菌量在 1.37 × 106～ 1.68 × 106CFU/支，陽(yáng)性回收率范圍為：77.84% ～ 85.08%，平均陽(yáng)性回收率為 80.84%（表3）。

2.4 滿載標(biāo)準(zhǔn)模式組實(shí)驗(yàn)結(jié)果

測(cè)試組及陰性對(duì)照組均無(wú)菌生長(zhǎng)，陽(yáng)性回收組的回收菌量在 1.29 × 106～ 1.66 × 106CFU/支，陽(yáng)性回收率范圍為：73.30% ～ 83.42%，平均陽(yáng)性回收率為 80.45%（表4）。

表2 單支檢測(cè)模式組（半周期）實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)次數(shù)實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)結(jié)果（CFU/支）陽(yáng)性回收率（%） 第一輪測(cè)試組- 陽(yáng)性回收組1.58 × 10683.16 陽(yáng)性對(duì)照組1.90 × 106 陰性對(duì)照組- 第二輪測(cè)試組- 陽(yáng)性回收組1.47 × 10679.46 陽(yáng)性對(duì)照組1.85 × 106 陰性對(duì)照組- 第三輪測(cè)試組- 陽(yáng)性回收組1.46 × 10682.95 陽(yáng)性對(duì)照組1.76 × 106 陰性對(duì)照組- 第四輪測(cè)試組- 陽(yáng)性回收組1.39 × 10676.37 陽(yáng)性對(duì)照組1.82 × 106 陰性對(duì)照組- 第五輪測(cè)試組- 陽(yáng)性回收組1.53 × 10683.61 陽(yáng)性對(duì)照組1.83 × 106 陰性對(duì)照組-

注：“-”表示未見(jiàn)渾濁或無(wú)菌落生長(zhǎng)。

表3 滿載檢測(cè)模式組（半周期）滅菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)次數(shù)實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)結(jié)果（CFU/支）陽(yáng)性回收率（%） 第一輪測(cè)試組1#2#3#4#5#6#7#8# -------- 陽(yáng)性回收組1.68 × 10681.95 陽(yáng)性對(duì)照組2.05 × 106 陰性對(duì)照組- 第二輪測(cè)試組1#2#3#4#5#6#7#8# -------- 陽(yáng)性回收組1.54 × 10685.08 陽(yáng)性對(duì)照組1.81 × 106 陰性對(duì)照組- 第三輪測(cè)試組1#2#3#4#5#6#7#8# -------- 陽(yáng)性回收組1.37 × 10677.84 陽(yáng)性對(duì)照組1.76 × 106 陰性對(duì)照組- 第四輪測(cè)試組1#2#3#4#5#6#7#8# -------- 陽(yáng)性回收組1.41 × 10679.21 陽(yáng)性對(duì)照組1.78 × 106 陰性對(duì)照組- 第五輪測(cè)試組1#2#3#4#5#6#7#8# -------- 陽(yáng)性回收組1.49 × 10680.11 陽(yáng)性對(duì)照組1.86 × 106 陰性對(duì)照組-

注：“-”表示未見(jiàn)渾濁或無(wú)菌落生長(zhǎng)；n# 代表第 n 支樣本。

表4 滿載標(biāo)準(zhǔn)模式組實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)次數(shù)實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)結(jié)果（CFU/支）陽(yáng)性回收率（%） 第一輪測(cè)試組1#2#3#4#5#6#7#8# -------- 陽(yáng)性回收組1.29 × 10673.30 陽(yáng)性對(duì)照組1.76 × 106 陰性對(duì)照組- 第二輪測(cè)試組1#2#3#4#5#6#7#8# -------- 陽(yáng)性回收組1.66 × 10683.42 陽(yáng)性對(duì)照組1.99 × 106 陰性對(duì)照組- 第三輪測(cè)試組1#2#3#4#5#6#7#8# -------- 陽(yáng)性回收組1.52 × 10681.28 陽(yáng)性對(duì)照組1.87 × 106 陰性對(duì)照組- 第四輪測(cè)試組1#2#3#4#5#6#7#8# -------- 陽(yáng)性回收組1.61 × 10682.14 陽(yáng)性對(duì)照組1.96 × 106 陰性對(duì)照組- 第五輪測(cè)試組1#2#3#4#5#6#7#8# -------- 陽(yáng)性回收組1.47 × 10682.12 陽(yáng)性對(duì)照組1.79 × 106 陰性對(duì)照組-

注：“-”表示未見(jiàn)渾濁或無(wú)菌落生長(zhǎng)；n# 代表第 n 支樣本。

3 討論

過(guò)氧化氫低溫等離子體滅菌的原理是在負(fù)壓及低溫（45 ～ 60 ℃）條件下，等離子化的過(guò)氧化氫迅速汽化后擴(kuò)散到待滅菌物體表面從而進(jìn)行滅菌[8]。影響過(guò)氧化氫低溫等離子體滅菌效果的因素常見(jiàn)有器械的干燥度、裝載量和裝載方式等[9-10]。其滅菌效果可根據(jù)化學(xué)指示卡、生物指示劑或過(guò)程挑戰(zhàn)裝置等來(lái)進(jìn)行判斷[11]，將 ATCC7953 嗜熱脂肪桿菌芽孢菌液滴加在電子輸尿管硬鏡的鏡管通道內(nèi)壁中，模擬樣本實(shí)際污染及最難滅菌情況，比放置各類包內(nèi)滅菌指示卡等更有挑戰(zhàn)性和代表性。

3.1 染菌量及干燥時(shí)間的影響

待滅菌物品的干燥程度會(huì)影響過(guò)氧化氫低溫等離子體滅菌效果，有研究顯示器械的不同干燥方式會(huì)影響滅菌效果[12]。本研究用染色液模擬菌液能更方便快速地進(jìn)行觀察判斷染菌量及干燥時(shí)間。本次實(shí)驗(yàn)所用電子輸尿管硬鏡的鏡管通道內(nèi)徑約為 2 mm，長(zhǎng)度約為 0.43 m，內(nèi)鏡管道細(xì)長(zhǎng)導(dǎo)致染菌后樣本不易干燥，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)液體加樣量很?。?0 μl）時(shí)置于 55 ℃干燥 16 h 之后，電子輸尿管硬鏡的鏡管通道方能達(dá)到干燥狀態(tài)。而當(dāng)液體加樣量為 200 μl 時(shí)，部分染色液可能直接流出鏡管，鏡管通道內(nèi)的液體量降低也會(huì)導(dǎo)致陽(yáng)性菌回收率降低，這提示菌液加樣量應(yīng)盡量縮小。

3.2 沖洗液類型及體積的影響

前期實(shí)驗(yàn)用 0.9% 無(wú)菌氯化鈉溶液對(duì)樣本進(jìn)行沖洗，發(fā)現(xiàn)使用此沖洗液若未完全干燥會(huì)導(dǎo)致樣本部分生銹，這可能是沖洗液中的氯離子對(duì)樣本材質(zhì)有腐蝕作用[13]。后續(xù)研究中將沖洗液替換為磷酸鹽緩沖液便無(wú)生銹現(xiàn)象。參考GB 27955-2020《過(guò)氧化氫氣體等離子體低溫滅菌器衛(wèi)生要求》[14]中規(guī)定的嗜熱脂肪桿菌芽孢載體陽(yáng)性回收菌量要求為 1 × 106～ 5 × 106CFU/載體，因此實(shí)驗(yàn)需要確保足夠量的沖洗液和沖洗頻率方能將樣本上滴染的陽(yáng)性菌進(jìn)行有效回收。本研究結(jié)果顯示用 500 ml pH7.0 磷酸鹽緩沖溶液對(duì)每支樣本進(jìn)行少量多次沖洗（50 ml/次），陽(yáng)性回收菌量能達(dá)到 1.29 × 106～ 1.68 × 106CFU/支，陽(yáng)性回收率為 73.30% ～ 85.08%，平均陽(yáng)性回收率為 80.80%，能滿足上述國(guó)標(biāo)的要求。

3.3 器械裝載量的影響

有研究顯示管腔器械的裝載量也會(huì)對(duì)低溫等離子體滅菌效果有影響[15]，因此分別選擇了針對(duì) LK/MJQ-100 型過(guò)氧化氫低溫等離子體滅菌器而言的單支樣本與 8 支樣本兩個(gè)最低和最高的裝載量進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果顯示滅菌后樣本均能達(dá)到無(wú)菌。在采用過(guò)氧化氫低溫等離子體滅菌時(shí)一般待滅菌物品不會(huì)超過(guò)滅菌器裝載容量的 80%，本研究中可能是由于樣本結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單和品類單一，因此在最高裝載量時(shí)進(jìn)行滅菌后也能達(dá)到無(wú)菌。

綜上所述，可為類似復(fù)用腔鏡器械上市前進(jìn)行過(guò)氧化氫低溫等離子體滅菌效果驗(yàn)證提供一種可行研究思路。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2023.03.012

蘭婉玲，Email：894064256@qq.com；劉曉飛，Email：liuxiaofei021@126.com

2022-10-27

*同為第一作者