宋陽(yáng)，宋雪，楊生寶，張燕，劉建凱

·論著·

不同胰蛋白酶在制備腮腺炎減毒活疫苗中的效果比較

宋陽(yáng)，宋雪，楊生寶，張燕，劉建凱

102600 京民海生物科技有限公司/北京市新型聯(lián)合疫苗工程技術(shù)研究中心

比較基因重組胰蛋白酶和豬源胰蛋白酶在腮腺炎減毒活疫苗中的使用效果。使用濃度為 10%、15%、20% 基因重組胰蛋白酶制備雞胚成纖維細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞密度、細(xì)胞活性、24 h 以及48 h 細(xì)胞貼壁狀態(tài)等指標(biāo)確定基因重組胰蛋白酶使用濃度；與豬源胰蛋白酶進(jìn)行比較，通過(guò)細(xì)胞密度、細(xì)胞活性、48 h 細(xì)胞貼壁狀態(tài)以及病毒滴度等指標(biāo)比較兩種胰蛋白酶的使用效果；使用基因重組胰蛋白酶制備 3 批腮腺炎減毒活疫苗，檢定疫苗的穩(wěn)定性；規(guī)模化放大驗(yàn)證該工藝的穩(wěn)定性。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)基因重組胰蛋白酶的使用濃度為 15%；與豬源胰蛋白酶進(jìn)行比較，兩種胰酶制備的細(xì)胞密度水平一致，無(wú)顯著性差異（> 0.05），48 h 后細(xì)胞均生長(zhǎng)至單層，細(xì)胞狀態(tài)良好，按照同一 MOI 進(jìn)行接毒，病毒滴度無(wú)顯著性差異（> 0.05）；使用 CF-10 進(jìn)行試驗(yàn)，病毒滴度也無(wú)差異（> 0.05）；連續(xù) 3 批使用基因重組胰蛋白酶制備的疫苗熱穩(wěn)定性良好，且該工藝可以規(guī)?；糯?。在制備腮腺炎減毒活疫苗中可以使用濃度 15% 的基因重組胰蛋白酶替代豬源胰蛋白酶，作為雞胚成纖維細(xì)胞消化液使用。

基因重組胰蛋白酶； 豬源胰蛋白酶； 雞胚成纖維細(xì)胞； 腮腺炎病毒

流行性腮腺炎，是由腮腺炎病毒感染導(dǎo)致的急性呼吸道傳染病，主要通過(guò)飛沫在空氣中進(jìn)行傳播，其主要威脅兒童等免疫力較為低下的人群，被我國(guó)列為法定傳染病之一，根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)在 2021 年共發(fā)生 119 955 例（人）的感染，給公共衛(wèi)生和人民健康帶來(lái)巨大威脅。

接種腮腺炎減毒活疫苗是控制該病流行的重要手段[1]。目前我國(guó)使用的腮腺炎疫苗均為減毒活疫苗，在生產(chǎn)時(shí)需要將其弱毒株接種在細(xì)胞基質(zhì)上。腮腺炎減毒活疫苗使用的細(xì)胞基質(zhì)為雞胚成纖維細(xì)胞，在制備該細(xì)胞時(shí)需要使用胰蛋白酶將雞胚組織細(xì)胞消化[2]。目前在此工藝中使用的胰蛋白酶多為豬源胰蛋白酶。但是在疫苗制備過(guò)程中需要嚴(yán)格控制原料的來(lái)源與質(zhì)量[3]，而目前仍有使用動(dòng)物源性胰蛋白酶造成產(chǎn)品被外源因子污染的現(xiàn)象發(fā)生[4]。此外，豬源胰蛋白酶中雜質(zhì)較多，雜質(zhì)主要來(lái)源于胰腺的脂類、蛋白和核酸等，在胰蛋白酶處理細(xì)胞的過(guò)程中，雜質(zhì)可能會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)[5]，是嚴(yán)重影響病毒復(fù)制和提高病毒滴度的重要因素之一，尤其在大規(guī)模工廠化生產(chǎn)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致原材料損失和經(jīng)濟(jì)成本的增加[6-7]。

基因重組胰蛋白酶是使用基因工程方法生產(chǎn)的新型蛋白酶，生產(chǎn)過(guò)程不使用任何動(dòng)物源性原料，不存在外源性的病毒污染的可能性。而且其具有純度高、比活高、性狀比較均一且質(zhì)量比較穩(wěn)定等特點(diǎn)，目前已經(jīng)開(kāi)始被大量應(yīng)用在疫苗研究和生產(chǎn)等環(huán)節(jié)中[8]。

本研究通過(guò)摸索基因重組胰蛋白酶使用濃度，并與豬源胰蛋白酶進(jìn)行比較，通過(guò)細(xì)胞密度、細(xì)胞活性以及病毒滴度等重要參數(shù)確定基因重組胰蛋白酶能否替代豬源胰蛋白酶應(yīng)用在腮腺炎減毒活疫苗制備中，為后期大規(guī)模應(yīng)用和其他生物制品的研究和生產(chǎn)提供重要理論和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 SPF 雞胚購(gòu)自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司；豬源胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；基因重組胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó) Thermo Fisher 公司；腮腺炎病毒為 Jeryl Lynn 株，由北京民海生物科技有限公司自制。

1.1.2 儀器設(shè)備 Counstar 自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購(gòu)自上海睿鈺生物科技有限公司；倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司。

1.2 方法

1.2.1 基因重組胰蛋白酶濃度的確定 選用10 日齡雞胚，經(jīng)消毒后，取出雞胚，去除雞胚頭部及內(nèi)臟，剪成碎塊。使用 0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.2 ～ 7.4）將基因重組胰蛋白酶（10×）稀釋成 10%、15%、20%，將其分別加入至雞胚進(jìn)行消化，37 ℃水浴消化 20 ～ 30 min 后，棄去上清液。吹打分散細(xì)胞并使用含新生牛血清的水解乳蛋白溶液進(jìn)行雞胚成纖維細(xì)胞制備，使用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定細(xì)胞密度以及活率。培養(yǎng) 24、48 h 后觀察細(xì)胞狀態(tài)。48 h 后各取 1 瓶，用胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，計(jì)算體外培養(yǎng) 48 h 的細(xì)胞增殖比。

1.2.2 基因重組胰蛋白酶與豬源胰蛋白酶比較 選用 10 日齡雞胚，經(jīng)消毒后，取出雞胚，去除雞胚頭部及內(nèi)臟，剪成碎塊。實(shí)驗(yàn)組按照確定好的濃度使用基因重組胰蛋白酶進(jìn)行消化，對(duì)照組使用豬源胰蛋白酶進(jìn)行消化。吹打分散細(xì)胞并使用含新生牛血清的水解乳蛋白溶液進(jìn)行雞胚成纖維細(xì)胞制備，測(cè)定細(xì)胞密度以及活率。按同一 MOI 接種腮腺炎病毒，病毒培養(yǎng) 48 h 后進(jìn)行細(xì)胞洗滌及換液，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到 40% 以上時(shí)進(jìn)行腮腺炎病毒收獲，對(duì)收獲液進(jìn)行病毒滴定。

1.2.3 三批腮腺炎單次病毒收獲液特性的比較 按照上述方法制備腮腺炎單次病毒收獲液，并對(duì)收獲液進(jìn)行病毒滴定、無(wú)菌檢查和支原體檢查。配制得到腮腺炎病毒原液（即腮腺炎減毒活疫苗半成品），凍干后得到成品，對(duì)原液及成品進(jìn)行檢定。同時(shí)將成品于 37 ℃放置 7 d 后，對(duì)凍干成品進(jìn)行熱穩(wěn)定性研究。

1.2.4 規(guī)模化放大驗(yàn)證 每批次使用 16 個(gè)細(xì)胞工廠進(jìn)行連續(xù) 3 批工藝規(guī)?；糯篁?yàn)證。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 GraphPad Prism7 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用檢驗(yàn)，以< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因重組胰蛋白酶濃度的確定

使用 15%、20% 基因重組胰蛋白酶制備的細(xì)胞密度可達(dá) 6.0 × 105個(gè)/ml 以上，細(xì)胞活性分別為86%、81%。10% 基因重組胰蛋白酶制備的細(xì)胞密度僅為 5.0 × 105個(gè)/ml，細(xì)胞活性在 84%，結(jié)果見(jiàn)圖 1。在相同的培養(yǎng)情況下，24 h 觀察細(xì)胞狀態(tài)，10% 基因重組胰蛋白酶制備的細(xì)胞 50% 貼壁、15% 基因重組胰蛋白酶制備的細(xì)胞 90% 貼壁、20% 基因重組胰蛋白酶制備的細(xì)胞 85% 貼壁，貼壁細(xì)胞狀態(tài)良好；48 h 時(shí)，10%、15%、20% 三組依次有 80%、100%、100% 細(xì)胞貼壁，貼壁細(xì)胞狀態(tài)良好且 48 h 后的細(xì)胞增殖比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖 2 和圖 3）。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，15%、20% 基因重組胰蛋白酶的消化能力相當(dāng)，基于生產(chǎn)成本考慮，確定基因重組胰蛋白酶使用濃度為 15%。

2.2 基因重組胰蛋白酶（15%）與豬源胰蛋白酶比較

使用基因重組胰蛋白酶（15%）與豬源胰蛋白酶進(jìn)行比較，細(xì)胞培養(yǎng)在 T225 瓶中或 CF-10 中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 4 所示，兩種胰酶制備的細(xì)胞密度和細(xì)胞活性水平一致，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（0.227）。48 h 后細(xì)胞均生長(zhǎng)至單層，細(xì)胞狀態(tài)良好（圖 5）。按照同一 MOI 進(jìn)行接毒，收獲后進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，基因重組胰蛋白酶（15%）組病毒滴度為6.5 lgCCID50/ml，豬源胰蛋白酶組病毒滴度為6.6 lgCCID50/ml，無(wú)顯著性差異（0.379）；使用 CF-10 進(jìn)行工藝放大，病毒滴度均為6.9 lgCCID50/ml，無(wú)顯著性差異（0.649），結(jié)果見(jiàn)圖 6。

圖1 不同濃度基因重組胰蛋白酶制備雞胚成纖維細(xì)胞密度（A）和活性（B）比較

Figure 1 Comparison of density (A) and activity (B) of chicken embryo fibroblasts prepared with different concentrations of recombinant trypsin

圖2 不同濃度基因重組胰蛋白酶制備雞胚成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)比較

Figure 2 Comparison of growth status of chicken embryo fibroblasts prepared with different concentrations of recombinant trypsin

圖3 不同濃度基因重組胰蛋白酶制備雞胚成纖維細(xì)胞 48 h 增殖比

Figure 3 Comparison of proliferation ratios of chicken embryo fibroblasts prepared with different concentrations of recombinant trypsin

圖4 不同胰蛋白酶制備雞胚成纖維細(xì)胞密度（A）和活性（B）比較

Figure 4 Comparison of density (A) and activity (B) of chicken embryo fibroblasts prepared by different trypsin

Figure 5 Comparison of cell growth status of chicken embryo fibroblasts prepared by porcine trypsin (A) and recombinant trypsin (B)

Figure 6 Comparison of titers of mumps single virus harvest prepared by different trypsin

表1 腮腺炎單次病毒收獲液檢定結(jié)果

Table 1 The results of control tests on mumps virus single harvests

批次 Batch病毒滴度（lgCCID50/ml） Virus titer (lgCCID50/ml)無(wú)菌檢查 Sterility test支原體檢查 Mycoplasma test 16.3符合規(guī)定 Conforms符合規(guī)定 Conforms 26.4符合規(guī)定 Conforms符合規(guī)定 Conforms 36.3符合規(guī)定 Conforms符合規(guī)定 Conforms

表2 腮腺炎病毒原液檢定結(jié)果

Table 2 The results of control tests on mumps virus bulks

批次Batch鑒別試驗(yàn)Identification test病毒滴度（lgCCID50/ml）Virus titer (lgCCID50/ml)無(wú)菌檢查Sterility test支原體檢查Mycoplasma test牛血清白蛋白殘留量（ng/ml）BSA residue (ng/ml) 1符合規(guī)定 Conforms5.5符合規(guī)定 Conforms符合規(guī)定 Conforms20.3 2符合規(guī)定 Conforms5.6符合規(guī)定 Conforms符合規(guī)定 Conforms20.3 3符合規(guī)定 Conforms5.6符合規(guī)定 Conforms符合規(guī)定 Conforms22.6

2.3 3 批腮腺炎減毒活疫苗比較分析

進(jìn)行連續(xù) 3 批腮腺炎減毒活疫苗實(shí)驗(yàn)，對(duì)腮腺炎單次病毒收獲液、原液進(jìn)行檢定，結(jié)果見(jiàn)表 1、表 2。

表2 結(jié)果表明，腮腺炎病毒原液各項(xiàng)檢測(cè)均符合要求。制成 3 批成品并于 37 ℃放置 7 d，病毒滴度結(jié)果見(jiàn)表 3。各批次腮腺炎病毒滴度結(jié)果均不低于 4.0 lgCCID50/ml，病毒滴度下降均不高于1.0 lgCCID50/ml，符合現(xiàn)行版藥典對(duì)于腮腺炎病毒滴度標(biāo)準(zhǔn)要求。

表3 腮腺炎減毒活疫苗成品 37 ℃熱加速穩(wěn)定性結(jié)果（lgCCID/ml）

Table 3 The thermal stability results of mumps virus t 37 ℃(lgCCID/ml)

批次 Batch0 天 0 day 7 天 7 day 14.84.6 25.34.5 34.84.5

以上數(shù)據(jù)說(shuō)明，使用重組胰蛋白酶制備的腮腺炎減毒活疫苗的各項(xiàng)指標(biāo)符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.4 規(guī)模化放大驗(yàn)證

使用基因重組胰蛋白酶（15%）進(jìn)行 3 批腮腺炎減毒活疫苗制備工藝規(guī)?；糯篁?yàn)證，每批次使用 16 個(gè)細(xì)胞工廠，對(duì)腮腺炎單次病毒收獲液、原液進(jìn)行檢定，結(jié)果見(jiàn)表 4、表 5。

表4、5 結(jié)果表明，腮腺炎單次病毒收獲液和病毒原液各項(xiàng)檢測(cè)均符合要求。制成 3 批成品檢定結(jié)果見(jiàn)表 6，各項(xiàng)檢定結(jié)果均符合現(xiàn)行版藥典對(duì)于腮腺炎減毒活疫苗成品的要求。

使用重組胰蛋白酶制備的腮腺炎減毒活疫苗的各項(xiàng)檢定均符合標(biāo)準(zhǔn)要求，經(jīng)過(guò)規(guī)模化放大驗(yàn)證，重組胰蛋白酶可以用于替代豬源胰蛋白酶使用。

3 討論

目前國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)腮腺炎減毒活疫苗主要是以雞胚細(xì)胞為基質(zhì)。有研究使用二倍體細(xì)胞進(jìn)行腮腺炎減毒活疫苗的制備[9]。雖然使用二倍體細(xì)胞可以建立細(xì)胞工作庫(kù)，有利于質(zhì)量控制以及工藝的穩(wěn)定。而雞胚細(xì)胞由于其是原代細(xì)胞系，更有益于保留病毒的免疫原性，腮腺炎病毒等更易感染和擴(kuò)增，所以目前雞胚細(xì)胞制備仍是生產(chǎn)腮腺炎減毒活疫苗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。但是雞胚成纖維細(xì)胞也存在質(zhì)量不均一、生物安全性高等問(wèn)題，已有研究通過(guò)對(duì)其永生化試圖解決該問(wèn)題，但目前還未有成功構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系的報(bào)道[10]。

對(duì)于原料的嚴(yán)格控制是影響生物制品產(chǎn)品質(zhì)量的最為重要的環(huán)節(jié)之一，《中國(guó)藥典》三部（2020 版）明確要求，動(dòng)物源胰酶用于疫苗生產(chǎn)時(shí)，需檢測(cè)胰酶相關(guān)的外源性病毒[11]。由于我國(guó)外來(lái)動(dòng)物疫病和重要人畜共患病防控壓力的加大，對(duì)于重要?jiǎng)游镌葱约膊?duì)生物制品的威脅也愈發(fā)嚴(yán)峻，同時(shí)因外來(lái)動(dòng)物疫病檢測(cè)方法缺失和相關(guān)檢測(cè)方法敏感性的不足，導(dǎo)致目前不能完全消除外源性病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)。所以使用動(dòng)物源性原料作為原料生產(chǎn)的減毒活疫苗，其帶來(lái)的外源因子污染的風(fēng)險(xiǎn)始終不能忽視[12]。

表4 工藝放大實(shí)驗(yàn)中腮腺炎單次病毒收獲液檢定結(jié)果

Table 4 The results of control tests on mumps virus single harvests in amplification

批次 Batch病毒滴度（lgCCID50/ml） Virus titer (lgCCID50/ml)無(wú)菌檢查 Sterility test支原體檢查 Mycoplasma test 16.3符合規(guī)定 Conforms符合規(guī)定 Conforms 26.4符合規(guī)定 Conforms符合規(guī)定 Conforms 36.6符合規(guī)定 Conforms符合規(guī)定 Conforms

表5 工藝放大實(shí)驗(yàn)中腮腺炎病毒原液檢定結(jié)果

Table 5 The results of control tests on mumps virus bulks in amplification

批次Batch鑒別試驗(yàn)Identification test病毒滴度（lgCCID50/ml）Virus titer (lgCCID50/ml)無(wú)菌檢查Sterility test支原體檢查Mycoplasma test牛血清白蛋白殘留量（ng/ml）BSA residue (ng/ml) 1符合規(guī)定 Conforms5.5符合規(guī)定 Conforms符合規(guī)定 Conforms18 2符合規(guī)定 Conforms5.3符合規(guī)定 Conforms符合規(guī)定 Conforms18 3符合規(guī)定 Conforms5.3符合規(guī)定 Conforms符合規(guī)定 Conforms19

表6 腮腺炎減毒活疫苗成品檢定結(jié)果

Table 6 The results of control tests on mumps vaccine

項(xiàng)目Items批次 Batch 123 無(wú)菌檢查 Sterility test符合規(guī)定 Conforms符合規(guī)定 Conforms符合規(guī)定 Conforms 鑒別試驗(yàn) Identification test符合規(guī)定 Conforms符合規(guī)定 Conforms符合規(guī)定 Conforms 外觀 Appearance inspection符合規(guī)定 Conforms符合規(guī)定 Conforms符合規(guī)定 Conforms pH7.47.27.3 滲透壓摩爾濃度（mOsmol/kg） Osmolality (mOsmol/kg)801799783 牛血清白蛋白殘留量（ng/劑） BSA residue (ng/dose)101516 異常毒性 Abnormal toxicity符合規(guī)定 Conforms符合規(guī)定 Conforms符合規(guī)定 Conforms 細(xì)菌內(nèi)毒素（EU/劑） Bacterial endotoxin (EU/dose)< 50< 50< 50 水分（%） Water (%)1.82.02.1 病毒滴度（lgCCID50/ml） Virus titer (lgCCID50/ml)4.55.04.6 37 ℃，7 d 病毒滴度（lgCCID50/ml）Virus titer at 37 ℃ 7 day (lgCCID50/ml)4.14.64.2

使用基因重組胰蛋白酶替代動(dòng)物源性胰蛋白酶是解決上述困境的方法之一。隨著目前生物工程等技術(shù)的發(fā)展，基因重組胰蛋白酶的生產(chǎn)技術(shù)和成本日趨簡(jiǎn)單和廉價(jià)，使得其作為生產(chǎn)原材料用于生物制品的生產(chǎn)成為可能，而且其具有純度高、安全系數(shù)較高等先天優(yōu)勢(shì)。使用基因重組胰蛋白酶成為趨勢(shì)[13]。

研究中我們首先確定了用于雞胚細(xì)胞制備的重組胰蛋白酶濃度為 15%。使用 10% 濃度制備的雞胚細(xì)胞密度少，導(dǎo)致貼壁細(xì)胞率較低，無(wú)法滿足后續(xù)工藝要求。原因可能在于低濃度的胰蛋白酶對(duì)于制備雞胚成纖維細(xì)胞尤其是大量制備時(shí)的消化狀態(tài)不理想，容易形成細(xì)胞團(tuán)塊，導(dǎo)致細(xì)胞貼壁效果差。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，雖然豬源胰蛋白酶與基因重組胰蛋白酶在細(xì)胞活性、細(xì)胞密度和病毒滴度等參數(shù)上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但基因重組胰蛋白酶組的離散度要低于豬源胰蛋白酶組，組間穩(wěn)定性更好。分析其原因一是基因重組胰蛋白酶由于其生產(chǎn)不受原材料和提取技術(shù)限制，純度和批間穩(wěn)定性更好；二是基因重組胰蛋白酶的理化性質(zhì)更加穩(wěn)定，在配制時(shí)更為方便，差異更小。

本研究通過(guò)比較兩種胰蛋白酶在腮腺炎減毒活疫苗中的應(yīng)用，基因重組胰蛋白酶達(dá)到豬源胰蛋白酶的效果，細(xì)胞密度和細(xì)胞活性達(dá)到工藝需求，且生產(chǎn)出的腮腺炎單次病毒收獲液滴度無(wú)顯著差異，初步建立了使用基因重組胰蛋白酶制備腮腺炎減毒活疫苗的方法，為優(yōu)化相應(yīng)工藝提供依據(jù)。

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Comparison of the effects of different trypsin on the preparation of live attenuated mumps vaccine

SONG Yang, SONG Xue, YANG Sheng-bao, ZHANG Yan, LIU Jian-kai

Author Affiliation: Beijing Minhai Biotechnology Co. Ltd, Beijing Engineering Technology Research Center for New Conjugate Vaccine, Beijing 102600, China

To compare the efficacy of recombinant trypsin and porcine trypsin in live attenuated mumps vaccine.Chicken embryo cells were prepared by using 10%, 15%, 20% recombinant trypsin, and the concentration of recombinant trypsin was determined by cell density, cell viability, 24 h and 48 h cell adhesion. The effects of the two trypsins were compared by cell density, cell activity, 48 h cell adherence status and virus titer. Three batches of live attenuated mumps vaccine were prepared with recombinant trypsin, and the stability of the vaccine was tested. The stability of the process was verified by large-scale amplification.The concentration of recombinant trypsin was 15%. The results showed that the density levels of the cells prepared by the two trypsins were the same with no significant difference (> 0.05). After 48 h, the cells grew to monolayer, and the cells were in good condition. After being infected according to the same MOI, there was no significant difference in disease progression and virus titer (> 0.05). There was no difference in virus titer when CF-10 was used for process amplification (> 0.05). The vaccine prepared by using recombinant trypsin in three consecutive batches possessed good thermal stability, and the process could be scaled up.Recombinant trypsin (15%) can be used as chicken embryo cell digest in the preparation of live attenuated mumps vaccine.

recombinant trypsin; porcine trypsin; chicken embryo fibroblasts; mumps virus

ZHANG Yan, Email: zhangyan@biominhai.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2023.03.007

張燕，Email：zhangyan@biominhai.com

2023-01-12