李天心，胡曼曼，李志裕，胡曉

·論著·

重組基因工程大腸桿菌制備1,3-二羥基丙酮

李天心，胡曼曼，李志裕，胡曉

830017 烏魯木齊，新疆醫(yī)科大學藥學院（李天心）；235058 淮北，安徽瑞賽生化科技有限公司（胡曼曼、胡曉）；210009 南京，中國藥科大學藥學院（李志裕）

探尋甘油發(fā)酵合成 1,3-二羥基丙酮（DHA）的高效工程菌。以肺炎克雷伯菌基因組 DNA 為模板，運用 PCR 擴增到編碼甘油脫氫酶（GDH）的基因（A），并克隆到大腸桿菌表達載體 pET28a 上，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒 pET-A；將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109，經(jīng)篩選后獲得了 DHA 重組基因工程菌。該工程菌在含有甘油的培養(yǎng)基中發(fā)酵后的次級代謝產(chǎn)物經(jīng)分離純化，通過1H 和13C核磁共振譜確定為目標產(chǎn)物 DHA，產(chǎn)量≥ 120 g/L。發(fā)酵液經(jīng)過濾、有機溶劑萃取和結(jié)晶后，獲得高質(zhì)量 DHA。該二菌株的基因能夠高效重組，并獲得甘油發(fā)酵合成 DHA 的重組基因工程菌的成功表達。

重組基因工程菌； 肺炎克雷伯菌； 甘油脫氫酶； 甘油； 1,3-二羥基丙酮

1,3-二羥基丙酮（DHA）是一種非常重要的生物基平臺化合物，廣泛應用于醫(yī)藥、化工、化妝品和食品領(lǐng)域[1]。目前，DHA 可作為多重耐藥菌廣譜藥物、傷口敷劑和糖苷酶抑制劑在低血糖、糖尿病以及某些病毒性皮膚病的治療上廣泛應用。DHA 通過抑制 α 糖苷酶活性治療2型糖尿病已成為醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點。

DHA 的合成方法主要包括化學合成法和微生物合成法。在化學合成法方面，Hirasawa 等[2]研究了 Pd-Ag/C 作催化劑的甘油氧化法。Rodriguese 等[3-4]以 Au 為催化劑、以多壁碳納米管（MWCNTs）為載體制備的 DHA 收率達到 60%。Wang 等[5]通過甘油間接氧化法合成 DHA，采用磁性的聚苯乙烯納米球固定催化劑 2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物（TEMPO）完成。在微生物合成法方面，Ma 等[6]采用 He-Ne 輻射對氧化葡萄糖酸桿菌進行誘變，獲得了甘油脫氫酶突變株 GM51；Hu 等[7]采用離子注入法誘變氧化葡萄糖酸桿菌獲得了突變株 G.oxydans ZJB09113，并通過響應面優(yōu)化了突變株的發(fā)酵培養(yǎng)條件；Mishra 等[1]和Hirasawa 等[2]通過表達AB 基因提高了 DHA 產(chǎn)量；Rodriguese 等[3]通過敲除A 基因和通過表達AB 基因提高了 DHA 產(chǎn)量，并縮短了發(fā)酵周期。

DHA 化學合成法存在收率低和污染環(huán)境等問題，而微生物合成法也存在底物與產(chǎn)物抑制等問題。本文采用重組基因工程菌法[8]制備 DHA，所獲得的基因工程菌已成功應用于工業(yè)化生產(chǎn) DHA，基本解決了微生物法生產(chǎn) DHA 中存在的收率低、成本高和環(huán)境污染等問題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 限制性內(nèi)切酶、Taq 酶、T4 DNA 連接酶均購自大連寶生物公司；其他化學試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒 肺炎克雷伯桿菌分離株由上海實驗動物質(zhì)量監(jiān)督檢驗站提供；克隆表達質(zhì)粒 pET28a、大腸桿菌JM109 購自上海康朗生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

⑴肺炎克雷伯菌分離培養(yǎng)基：蒸餾水 1000 ml、甘油 5 g、NaCl 5 g、酵母粉 5 g、葡萄糖 20 g、瓊脂粉 15 g，調(diào) pH 7.0。培養(yǎng)基 121 ℃、0.1 MPa 滅菌 20 min，冷卻至 35 ～ 45 ℃時，加入 3 mg/L 的尼羅紅二甲基亞砜溶液 2 ml，無菌條件下倒入培養(yǎng)皿，冷卻后備用。

⑵肺炎克雷伯菌富營養(yǎng)培養(yǎng)基：蒸餾水1000 ml、酵母粉 10 g、瓊脂粉 10 g、甘油 3 g、(NH4)2SO45 g，調(diào) pH 7.0。培養(yǎng)基121 ℃、0.1 MPa 滅菌 15 ～ 20 min。

⑶DHA 發(fā)酵培養(yǎng)基：

DHA 基因工程菌富集培養(yǎng)基：LB 培養(yǎng)基（胰蛋白胨 10 g、酵母提取物 5 g、NaCl 10 g，pH 7.0）。

DHA 基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基：添加 15.0% 甘油的 LB 培養(yǎng)基。

1.2.2 肺炎克雷伯菌培養(yǎng) 肺炎克雷伯菌前培養(yǎng)是在 L-試管中，以無菌操作加入 5 ml 富營養(yǎng)培養(yǎng)基，以無菌牙簽接入肺炎克雷伯菌的單菌落。35 ℃、120 r/min 培養(yǎng) 15 h。4 ℃、6000 ×離心 10 min，棄上清，在離心管中用滅菌磷酸鹽緩沖液振蕩混勻，然后 4 ℃、6000 ×離心 12 min，棄上清。將前培養(yǎng)物 0.5 ml 接種至含有 100 ml 富營養(yǎng)培養(yǎng)基的500 ml三角瓶中，30 ℃、130 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h。4 ℃、6000 ×離心 10 min，棄上清，在離心管中以滅菌磷酸鹽緩沖液振蕩混勻，再次 4 ℃、6000 ×離心 12 min，棄上清。再分別將含有富營養(yǎng)培養(yǎng)基的菌體接入 10 瓶含有 100 ml 發(fā)酵培養(yǎng)基的 500 ml 三角瓶中，30 ～ 37 ℃、130 r/min 振蕩培養(yǎng) 72 h。

1.2.3 肺炎克雷伯菌 DNA 模板提取 細菌菌株接種于 5 ml 胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，35 ℃振搖過夜培養(yǎng)。次日取 1.5 ml 菌液以 12 000 r/min 離心 1 min 收集菌體。菌體沉淀重懸于 100 μl 溶液I（50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，溶菌酶 20 mmol/L，pH 8.0），37 ℃水浴 1.5 h。加溶液II 100 μl（2 mmol/L NaOH，1% SDS），快速顛倒離心管，待混合物變得澄清黏稠后置冰水上放置 5 min 后加入溶劑III 150 μl（5 mmol/L KAc 60 ml，冰醋酸 11.5 ml，水 28.5 ml），混合物變?yōu)樾鯛畛恋砗笾帽?30 min，8000 r/min 離心 10 min。取上清加入等體積的酚/氯仿，8000 r/min 離心 10 min，取上層水相，加入等體積氯仿，8000 r/min 離心 10 min。取上層水相加入 2.5 倍體積的無水乙醇，混合后–20 ℃放置 1 h 以上，再經(jīng) 12 000 r/min 離心 10 min，棄上清，沉淀于–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 甘油脫氫酶基因擴增與重組表達質(zhì)粒構(gòu)建 通過對甘油脫氫酶基因進行序列分析，設(shè)計了保守引物 primer I，核苷酸序列為5' GGTGGGATCCTACATGCGCACTTATTTGAG 3'，以及 primer II，核苷酸序列為5' AATGCTCGAGCGAATTAAC GCGCCAGCCAC 3'。以肺炎克雷伯菌基因組 DNA 為模板，擴增目的基因A。擴增條件：97 ℃預變性 10 min；94 ℃變性 60 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 60 ～ 120 s，30 個循環(huán)；之后 72 ℃延伸 10 min。每一個溫降過程均為瞬變。

含目的基因A 的 PCR 擴增 DNA 片段以及克隆表達質(zhì)粒 pET28a 都進行I 和R I 雙酶切后，利用 T4 DNA 連接酶將A 基因連接到質(zhì)粒 pET28a中，獲得重組表達質(zhì)粒 pET-A。

1.2.5 大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞制備與轉(zhuǎn)化 采用氯化鈣法制備大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞并進行重組表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。上述轉(zhuǎn)化反應液接種于 1 ml LB 培養(yǎng)基，于36 ℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng) 2 h 后，再均勻涂布于含有氨芐青霉素的LB 平板上，36 ℃培養(yǎng)過夜篩選含有重組表達質(zhì)粒 pET-A 的大腸桿菌JM109。按照600nm= 0.3 ～ 0.4 的標準，篩選得到的轉(zhuǎn)化菌株，通過菌落 PCR 和限制性內(nèi)切酶酶切重組質(zhì)粒，進行驗證。從平板上挑取單菌落重組基因工程菌，接種到裝有30 mg DHA 基因工程菌富集培養(yǎng)基的250 ml 搖瓶中，35 ℃、120 r/min 培養(yǎng)14 h，以鼓入空氣中的氧氣作為基因工程菌氧化甘油為DHA 的氧化劑。

1.2.6 重組基因大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn) DHA –70 ℃保藏的重組基因大腸桿菌在 LB 培養(yǎng)基平板上活化，以滅菌牙簽挑取單菌落接于 20 ml LB 培養(yǎng)基中，30 ～ 37 ℃培養(yǎng)過夜，以 2% 接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入 1 ～ 2 mmol/L 的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導A 表達，發(fā)酵培養(yǎng)72 h。

1.2.7 DHA 定量分析 采用高效液相色譜法，檢測條件為：HILIC 色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流動相為乙腈和5 mmol/L 乙酸銨混合液，兩者體積比為 92:8；流速為 1.0 ml/min；檢測波長為 200 nm；柱溫為 25 ℃；進樣量為 10 μl。

1.2.8 DHA 分離純化 DHA 工程菌發(fā)酵液過濾后的濾液用乙酸丁酯萃取。萃取液經(jīng)濃縮后，使用乙酸丁酯和石油醚體積比為1:3 ～ 1:4的溶液重結(jié)晶，得到 DHA 產(chǎn)品。

2 結(jié)果

2.1 DHA 基因工程菌構(gòu)建

2.1.1PCR 擴增驗證A 基因擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果（圖 1）顯示，成功擴增出 1 條約 1600 bp 的特異性條帶，與預測的大小一致，表明 PCR 擴增成功。

圖1 gldA 基因 PCR 擴增產(chǎn)物的電泳圖譜（M：DNA marker；1、2：gldA 的 PCR 擴增產(chǎn)物）

Figure 1 Electrophoretic map of PCR products ofA gene (M: DNA marker; 1, 2: PCR products ofA)

2.1.2 質(zhì)粒酶切驗證 將構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒 pET-A 經(jīng)雙酶切驗證（圖 2）和進一步測序，結(jié)果表明插入目的片段正確，且未出現(xiàn)移碼，證明重組質(zhì)粒 pET-A 構(gòu)建成功。

2.1.3 工程菌生物活性測定 工程菌經(jīng)最佳條件誘導后，pET-A 活性可達（4.65 ± 0.15）U/ml，出發(fā)菌A 的活性為（0.29 ±0.21）U/ml。工程菌 pET-A 活性是出發(fā)菌A 的 16.0 倍。

2.2 甘油發(fā)酵轉(zhuǎn)化為 DHA

所得產(chǎn)物經(jīng)熔點測定、13C和1H 核磁共振譜測定，證明產(chǎn)物為 DHA。

圖2 重組質(zhì)粒 pET-gldA 雙酶切片段的電泳圖譜（M：DNA marker；1：重組質(zhì)粒 pET-gldA 的雙酶切片段）

Figure 2 The electrophoretic map of the recombinant plasmid was obtained (M: DNA marker; 1: Recombinant plasmid pET-A double enzyme fragments)

2.2.1 熔點測定 使用MPA100熔點儀測定產(chǎn)物的熔點為78.9 ～ 79.5 ℃，與文獻值78 ～ 80 ℃一致。

2.2.213C 和1H 核磁共振譜測定 對經(jīng)分離純化后獲得的產(chǎn)物，通過1H 核磁共振譜（圖 3）確定為目標產(chǎn)物 DHA，即4.91（t，=5.5 Hz，2H），4.69（d，=5.6 Hz，4H）（500 MHz，CD3CN）。通過13C核磁共振譜（圖 4）確定為目標產(chǎn)物 DHA，即13C-NMR（125 MHz，CD3CN）201.3，66.4。

對經(jīng)分離純化后獲得的產(chǎn)物，采用高效液相色譜法測定純度為 99.65%（圖 5）。所獲得的基因工程菌發(fā)酵合成 DHA 生產(chǎn)水平大于 120 g/L，實現(xiàn)了 DHA 產(chǎn)業(yè)化應用。

圖3 1,3-二羥基丙酮1H 核磁共振譜圖

Figure 3 1,3-Dihydroxyacetone1H nuclear magnetic resonance spectroscopy

圖4 1,3-二羥基丙酮13C核磁共振譜圖

Figure 413C nuclear magnetic resonance spectroscopy of 1,3-dihydroxyacetone

圖5 DHA 高效液相色譜分析圖譜

Figure 5 High-performance liquid chromatography map of DHA

3 討論

本研究通過基因重組構(gòu)建高效表達的工程菌，并利用甘油為底物合成了生物基平臺化合物 DHA。同時，從誘導表達 pET-A 高活力和發(fā)酵產(chǎn)物的高收率出發(fā)，探討工程菌構(gòu)建的策略、方法和實現(xiàn)的手段，旨在解決工業(yè)化中的產(chǎn)量低、質(zhì)量差、成本高和環(huán)境污染等難題。目前，發(fā)達國家重組基因工程菌的開發(fā)研究已經(jīng)達到一定的水平，而國內(nèi)起步較晚，還處在實驗室小試階段，實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的并不多見。該研究創(chuàng)新性獲得重組基因工程菌的構(gòu)建新工藝、發(fā)酵新技術(shù)和產(chǎn)物分離提純新方法等，并通過工業(yè)化，實現(xiàn)了研究成果轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力的新突破。在構(gòu)建重組基因工程菌的過程中，由于缺少系統(tǒng)理論的指導和成功經(jīng)驗的借鑒，往往很難尋找到有效的重組基因組。而工程菌構(gòu)建完畢后，需要通過發(fā)酵來證明目的產(chǎn)物是否能得到和發(fā)酵是否有高收率，這其中有繁瑣的操作過程和非常大的工作量。為了解決發(fā)酵過程的巨大工作量問題，嘗試將樣品室系統(tǒng)、反應系統(tǒng)（微孔板）、靈敏快速檢測系統(tǒng)、自動化操作系統(tǒng)和計算機分析系統(tǒng)等組合在一起，構(gòu)建高通量篩選技術(shù)平臺，極大提高了工作效率。從工業(yè)化的目標出發(fā)，系統(tǒng)探究基因重組的新理論，工程菌構(gòu)建的新工藝，發(fā)酵的新技術(shù)和產(chǎn)物分離提純的新技巧，使得研究成果具備一定的理論水平、較強的工藝技術(shù)創(chuàng)新能力、較好的實際應用價值和可推廣應用的前景。

[1] Mishra R, Jains SR, Kumar A. Micrbiai production of dihydroxyacetone. Biotechnol Adv, 2008, 26(4):293-303.

[2] Hirasawa S, Watanabe H, Kizuka T, et al. Performance, structure and mechanism of Pd-Ag alloy catalyst for selectiveoxidation of glycerol to dahydroxyacetone. J Catalysis, 2013, 300:205-216.

[3] Rodriguese EG, Carabinerosa SAC, Delgaj JJ, et al. Gold supported on carbon nanotubes for the salecive oxidation of glycerol. J Catalysis, 2012, 285(1):83-91.

[4] Rodriguese EG, Pereiramf MFR, Delgadoj JJ, et al. Enhancement of the salectivity to dihydroxyacetone inglycerol oxidationusing gold nanoparticles supported on carbonnanotubes. Catalysis Commun, 2011, 16(1):64-69.

[5] Wang JL, Zhang M, Zheng Z, et al. The indlrect conversion of glycerol into 1,3-dihydroxyacetone over TEMPO catlyst. Chem Eng J, 2013, 229:234-238.

[6] Ma LJ, Lu WY, Xia ZD, et al. Bnhancement of dihydroxyacetone production by a mutant of Gluconobacter oxydans. Biochem Eng J, 2010, 49(1):61-67.

[7] Hu ZC, Liu ZG, Xu JM, et al. Improvement of 1,3-dihyroxyacetone production from Gluconobacter oxydans by ionbeam implantation. Prep Biochem Biotechnol, 2012, 42(1):15-28.

[8] Anhui Ruisai Biochemical Technology Co., Ltd. A method for preparing a recombinant genetically engineered strain for producing 1,3-Dihydroxyacetone: CN, 201210282821X. 2014-02-12. (in Chinese)

安徽瑞賽生化科技有限公司. 一種生產(chǎn)1,3-二羥基丙酮的重組基因工程菌的制備方法. CN, 201210282821X. 2014-02-12.

[9] Anhui Ruisai Biochemical Technology Co., Ltd. Immobilization and application of 1,3-Dihydroxyacetone recombinant bacteria: CN, 201510178763X. 2015-08-19. (in Chinese)

徐州奧格曼新材料科技有限公司. 產(chǎn)1,3-二羥基丙酮重組基因工程菌的固定化及應用: CN, 201510178763X. 2015-08-19.

Construction of a recombinant genetically engineeredto produce 1,3-dihydroxyacetone

LI Tian-xin, HU Man-man, LI Zhi-yu, HU Xiao

Author Affiliations: School of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi 830017, China (LI Tian-xin); Anhui Ruisai Biochemical Technology Co., Ltd, Huaibei 235058, China (HU Man-man, HU Xiao); College of Pharmacy, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China (LI Zhi-yu)

To construct engineered bacteria for glycerol fermentation to efficiently produce 1,3-dihydroxyacetone (DHA).Usinggenomic DNA as template, the glycerol dehydrogenase gene (A) was amplified by PCR and cloned intoexpression vector pET28a to construct the recombinant expression plasmid pET-A. After transfection toJM109, a recombinant strain with high yield of DHA was obtained.The secondary metabolite of the engineered strain fermented in glycerol-containing medium was purified and identified as the target product DHA by1H and13C NMR spectroscopy. The yield of DHA was ≥ 120 g/L. After filtration, organic solvent extraction and crystallization, high quality DHA was obtained.The genes of these two strains could be efficiently recombined, and the successful expression of recombinant genetic engineering bacteria for glycerol fermentation to synthesize DHA was obtained.

recombinant genetic engineering strain;; glycerol dehydrogenase; glycerol; 1,3-dihydroxyacetone

HU Xiao, Email: hx@risachem.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2023.03.005

安徽省高技術(shù)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展項目（皖發(fā)改高技[2012]487 號）

胡曉，Email：hx@risachem.com

2023-02-24