王曉靜 趙曉娟 任曉轉(zhuǎn)

原發(fā)性肝癌中肝細(xì)胞癌(HCC)占80%～90%[1]。HCC患者早期癥狀較為隱匿,易誤診為血管瘤、肝囊腫等疾病,具有較大鑒別難度[2]?；颊呔驮\時(shí)大多已發(fā)展至中晚期,經(jīng)治療后,預(yù)后往往不理想,因此盡早診斷對(duì)改善HCC患者預(yù)后意義重大[3-4]。CEUS具有分辨率高、操作簡單等優(yōu)勢,能夠及時(shí)明確微血管、組織灌注狀態(tài),已在臨床廣泛應(yīng)用[5-6]。此外,生物標(biāo)志物中miRNAs能夠調(diào)控抑癌及控癌基因的表達(dá),參與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展過程。多項(xiàng)研究顯示,miR-122-5p能夠參與胃癌、原發(fā)性肝癌等多種惡性腫瘤進(jìn)展,亦為具有肝臟特性的miRNA,可多靶點(diǎn)作用于肝癌的發(fā)生與發(fā)展[7-8]。miR-133a-3p能夠抑制惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移及侵襲,在膿毒癥、肝癌等多種疾病中均呈低表達(dá)[9-10]。但是目前如何更為有效地診斷HCC仍為臨床探究的重點(diǎn)。因此,本研究分析CEUS聯(lián)合血清miR-122-5p、miR-133a-3p水平在HCC中的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取45例HCC患者(記為HCC組)及同期在本院接受治療的慢性乙型肝炎患者45例(記為對(duì)照組)(2020年10月至2022年10月)作為研究對(duì)象。HCC組年齡50～68歲,平均(56.78±5.72)歲;男性30例,女性15例;早期16例,晚期29例;分化程度:低分化22例,中高分化23例;浸潤程度:漿膜層18例,粘膜下層27例;轉(zhuǎn)移情況:淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例;TNM分期:Ⅰ+Ⅱ期23例,Ⅲ+Ⅳ期22例。對(duì)照組年齡48～71歲,平均(57.12±5.76)歲;男性28例,女性17例。2組年齡、性別等資料比較無明顯差異(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn):①HCC患者均符合《原發(fā)性肝癌的分層篩查與監(jiān)測指南(2020年版)》[11]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn);②生存時(shí)間超過3個(gè)月患者;③對(duì)照組患者符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[12]相關(guān)標(biāo)準(zhǔn);④臨床資料及隨訪資料完整患者。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并高血壓、糖尿病、甲亢及慢阻肺等慢性疾病患者;②有精神意識(shí)障礙患者;③依從性較差患者。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 CEUS檢測 使用多普勒診斷儀(Mindrary Resona7,Philips IU22)和C5-1凸型探頭,掃描超聲觀察病灶回聲、大小(低、等或高回聲),確定目標(biāo)病灶后,機(jī)械指數(shù)低于0.1,進(jìn)行檢查。取購自意大利Bracco的Sono Vue配置溶液2.4 mL,快速團(tuán)注(經(jīng)肘部淺靜脈),再快速注入5 mL 0.9%氯化鈉溶液。同時(shí)啟動(dòng)動(dòng)態(tài)錄像、計(jì)時(shí)器,至少觀察5 min目標(biāo)病灶?；仡櫡治霾≡罾寮霸鰪?qiáng)特征。記錄病灶內(nèi)造影劑的始消時(shí)間、持續(xù)時(shí)間、達(dá)峰時(shí)間及始增時(shí)間。

1.2.2 血清檢測 抽取患者空腹靜脈血3 mL,分離血清(以2500 r/min離心15 min),以Trizol法提取總RNA,測量吸光度值(A260 nm/A280 nm)(使用紫外分光光度計(jì)),A值為1.8～2.2時(shí)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。再進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(用購自德國凱杰公司的miScript II RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒),操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒進(jìn)行,再加入ddH2O進(jìn)行稀釋。本研究引物由北京康維世紀(jì)公司提供。使用購自德國凱杰公司的miScropt SYBR Green試劑盒進(jìn)行qPCR反應(yīng),條件:90 ℃加熱30 min,94 ℃變性15 s,55 ℃退火30 s,70 ℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參。計(jì)算血清miR-122-5p、miR-133a-3p的相對(duì)表達(dá)量。內(nèi)參U6下游引物:5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′;上游引物:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′。miR-122-5p下游引物:5′-AGUUUUGCAUGUUGCACUCAC-3′;上游引物:5′-AGUUUUGCAUAGUUGCACUCAC-3′。miR-133a-3下游引物:5′-TCCCAGCCGTAGACCAA-3′;上游引物:5′-ATTTTTCCCTCGACACCCGAT-3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 2組CEUS相關(guān)指標(biāo)

HCC組始消時(shí)間、持續(xù)時(shí)間、達(dá)峰時(shí)間及始增時(shí)間均低于對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

表1 2組CEUS相關(guān)指標(biāo)

2.2 CEUS對(duì)HCC患者的診斷價(jià)值

繪制CEUS各項(xiàng)指標(biāo)診斷HCC的ROC曲線顯示,單獨(dú)檢測時(shí)始增時(shí)間的敏感度最高,始消時(shí)間、持續(xù)時(shí)間的特異度最高,聯(lián)合檢測的AUC為0.978,特異度及敏感度均處于較高水平。見圖1,表2。

圖1 CEUS診斷HCC的ROC曲線

表2 CEUS診斷HCC患者的ROC曲線結(jié)果

2.3 2組患者血清miR-122-5p、miR-133a-3p水平

HCC組血清miR-122-5p、miR-133a-3p表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。見表3。

表3 2組患者血清miR-122-5p、miR-133a-3p水平

2.4 血清miR-122-5p、miR-133a-3p水平對(duì)HCC的診斷價(jià)值

繪制血清miR-122-5p、miR-133a-3p水平診斷HCC的ROC曲線,單獨(dú)檢測時(shí),miR-133a-3p的敏感度最高,miR-122-5p的特異度最高,兩者聯(lián)合檢測具有較高的敏感度及特異度。見圖2,表4。

圖2 血清miR-122-5p、miR-133a-3p水平診斷HCC的ROC曲線

表4 多因素COX分析影響診斷HCC的因素

2.5 CEUS聯(lián)合血清miR-122-5p、miR-133a-3p水平對(duì)HCC的診斷價(jià)值

CEUS聯(lián)合血清miR-122-5p、miR-133a-3p水平診斷HCC的ROC曲線顯示,AUC為0.999,截?cái)嘀禐?.712,敏感度、特異度分別為97.78%,99.99%,約登指數(shù)為0.9778,95%CI為0.958～1.000。見圖3。

圖3 CEUS聯(lián)合血清miR-122-5p、miR-133a-3p水平診斷HCC的ROC曲線

2.6 多因素COX分析影響診斷HCC的因素

行多因素COX分析顯示,始消時(shí)間、達(dá)峰時(shí)間、始增時(shí)間、血清miR-122-5p、miR-133a-3p均為影響HCC診斷的因素(P<0.05)。見表4。

3 討論

目前,我國肝癌居腫瘤相關(guān)死亡第三位,超過全世界發(fā)病人數(shù)的50%。原發(fā)性肝癌主要以肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌及HCC為主,其中HCC占85%～90%[13]。目前,尚不清楚肝癌的發(fā)病機(jī)制,多認(rèn)為是丙型、乙型肝炎病毒感染,長期酗酒、黃曲霉素?cái)z入及致癌基因遺傳等因素導(dǎo)致的。由于肝臟代償能力及再生功能較為強(qiáng)大,肝臟受損后常無自覺癥狀,導(dǎo)致普遍的肝癌指標(biāo)不能有效且全面地將所有肝癌患者篩查出來。隨著分子生物學(xué)及免疫組織化學(xué)的發(fā)展,多項(xiàng)研究顯示miRNA與腫瘤關(guān)系密切,其在腫瘤中的表達(dá)具有特異性,且在經(jīng)歷多次操作后,血清miRNA的表達(dá)仍較為穩(wěn)定,能夠作為診斷肝癌的輔助標(biāo)記物[14]。其中miR-122-5p在肝臟中呈特異性高表達(dá),能夠調(diào)控免疫應(yīng)答、衰老、代謝、分化及細(xì)胞發(fā)育等過程。miR-122-5p可通過結(jié)合Bcl-w、ADAM10等原癌基因,對(duì)原癌基因的表達(dá)起抑制作用,進(jìn)而抑制腫瘤發(fā)展。何佳等[15]研究顯示,miR-122-5p在肝癌中呈低表達(dá),若人工干預(yù)使其表達(dá)上調(diào)則可有效抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及分裂。而miR-133a-3p在結(jié)直腸癌、膀胱癌、胃癌等多種惡性腫瘤呈異常表達(dá),可抑制癌細(xì)胞遷移及增殖,參與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[16-17]。

因此,本研究探究血清miR-122-5p、miR-133a-3p在HCC患者中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,HCC組血清miR-122-5p、miR-133a-3p表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組。與張偉等[17]研究相同。說明,血清miR-122-5p、miR-133a-3p可能參與HCC的發(fā)生及發(fā)展。進(jìn)一步繪制ROC曲線評(píng)估其診斷價(jià)值顯示,單獨(dú)檢測時(shí),miR-133a-3p的敏感度最高,miR-122-5p的特異度最高,兩者聯(lián)合檢測具有較高的敏感度及特異度。說明兩者單獨(dú)檢測雖具有一定價(jià)值,但是聯(lián)合檢測價(jià)值更高。

還有研究表明,CEUS可觀察肝組織變化,顯示血流信號(hào),了解其增強(qiáng)類型明確肝臟及其周圍組織血供,利于診斷HCC[18]。本研究通過CEUS檢測HCC,結(jié)果顯示,HCC組始消時(shí)間、持續(xù)時(shí)間、達(dá)峰時(shí)間及始增時(shí)間均低于對(duì)照組。說明HCC與慢性乙型肝炎存在病理差異。再通過繪制ROC曲線評(píng)估各項(xiàng)CEUS指標(biāo)診斷HCC的價(jià)值顯示,單獨(dú)檢測時(shí)始增時(shí)間的敏感度最高,始消時(shí)間、持續(xù)時(shí)間的特異度最高,聯(lián)合檢測的AUC為0.978,特異度及敏感度均處于較高水平。亦說明CEUS用于診斷HCC具有一定價(jià)值。此外,本研究還通過繪制CEUS聯(lián)合血清miR-122-5p、miR-133a-3p水平診斷HCC的ROC曲線顯示,AUC為0.999,截?cái)嘀禐?.712敏感度、特異度分別為97.78%、99.99%,約登指數(shù)為0.9778,95%CI為0.958～1.000。這說明CEUS聯(lián)合血清miR-122-5p、miR-133a-3p水平診斷HCC價(jià)值較高。本研究另行多因素COX分析顯示,始消時(shí)間、達(dá)峰時(shí)間、始增時(shí)間、血清miR-122-5p、miR-133a-3p均為影響HCC診斷的因素。進(jìn)一步說明CEUS聯(lián)合血清miR-122-5p、miR-133a-3p水平可作為臨床診斷HCC的有效方式。

綜上所述,CEUS聯(lián)合血清miR-122-5p、miR-133a-3p水平均為影響HCC診斷的因素,三者聯(lián)合檢測具有較高的診斷價(jià)值。