陳 琦 崔哲卿 黃維平

鼻咽癌是起源于鼻咽部上皮的惡性腫瘤[1-3]。目前,采用常規(guī)檢查方法如電子鼻咽鏡檢查、計(jì)算機(jī)斷層掃描及磁共振成像早期發(fā)現(xiàn),結(jié)合病理確診后立即采取有效的治療策略,近年來(lái)鼻咽癌死亡率逐漸下降,但是仍有一部分鼻咽癌患者直到疾病的晚期才被診斷出來(lái),其對(duì)常規(guī)治療的敏感性仍然較差[4]。鼻咽癌在早期無(wú)癥狀疾病狀態(tài)時(shí),由于其隱匿性,不易被發(fā)現(xiàn)[5]。因此,為改善鼻咽癌患者的臨床預(yù)后,需要提出新穎、可靠的篩查方案。microRNA(miRNA)是一種長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的小型非編碼RNA,其功能為基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子,在多種腫瘤中表達(dá)失調(diào),包括鼻咽癌[6]。已經(jīng)為包括鼻咽癌在內(nèi)的多種癌癥類型定義了預(yù)后和預(yù)測(cè)miRNA生物標(biāo)志物,這些生物標(biāo)志物為評(píng)估疾病狀態(tài)以及預(yù)測(cè)治療反應(yīng)和臨床結(jié)局提供了一個(gè)潛在的重要臨床工具。因此,對(duì)鼻咽癌中表達(dá)異常的miRNAs的進(jìn)一步檢查和驗(yàn)證將有助于深入了解該病的基本驅(qū)動(dòng)因素,有助于發(fā)現(xiàn)新的靶向治療方法。Zou 等[7]發(fā)現(xiàn)早期鼻咽癌患者血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照組。但是,血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p對(duì)早期鼻咽癌的聯(lián)合診斷尚未有人研究?；诖?本研究旨在探討血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p聯(lián)合檢測(cè)對(duì)早期鼻咽癌的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入2017年3月至2020年3月我院收治的早期鼻咽癌患者90例為研究組,其中男53例,女37例,平均年齡(52.95±23.01)歲。鼻咽炎患者90例為炎癥組,其中男性50例,女性40例,平均年齡(53.51±22.94)。早期鼻咽癌患者和鼻咽炎患者均經(jīng)病理確診。排除標(biāo)準(zhǔn):①抽取血液前接受任何治療的患者;②合并其他腫瘤的患者;③合并全身性自身免疫性疾病;④嚴(yán)重心、肝、腎功能損害者;⑤長(zhǎng)期使用皮質(zhì)類固醇激素及免疫抑制劑者。納入2017年3月至2020年3月至我院體檢的90例健康體檢者為對(duì)照組,其中男性45例,女性45例,平均年齡(54.23±24.31)歲。各組一般資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),可納入此次分析。受試者均知情同意且獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 RNA抽取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采取90例早期鼻咽癌患者,90例鼻咽炎患者和90例健康體檢者的外周血10 ml。使用北京潤(rùn)澤康生物科技有限公司的RNA小量提取試劑盒(貨號(hào):R6814-01)進(jìn)行總RNA的抽取。用特定的逆轉(zhuǎn)錄(RT)引物和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對(duì)miRNA進(jìn)行擴(kuò)增。RT反應(yīng)在42 ℃條件下進(jìn)行60 min,70 ℃條件下進(jìn)行10 min;PCR反應(yīng)在95 ℃條件下進(jìn)行20秒,然后在7900HT實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)上進(jìn)行40個(gè)循環(huán),95 ℃條件下進(jìn)行10秒,60 ℃條件下進(jìn)行20秒,然后70 ℃條件下進(jìn)行10秒。通過(guò)SYBR Green Dye (SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ,TaKaRa,)釋放的熒光水平計(jì)算PCR產(chǎn)物的相對(duì)量。采用溶解曲線分析方法評(píng)價(jià)PCR產(chǎn)物的特異性。2-ΔΔCt方法應(yīng)用于確定miRNA的表達(dá)水平。U6作為檢測(cè)miRNA相對(duì)表達(dá)水平的內(nèi)參基因。引物序列:U6:(Forward primer:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′;Reverse primer:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′);miR-140-3P:(Forward primer:5′-GCGCGTACCACAGGGTAGAA-3′;Reverse primer:5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′);miR-223-3p:(Forward primer:5'-ACACTCCAGCTGGGTGTCAGTTTGTCAAAT-3';Reverse primer:5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTC-AGTTGAGTGGGGTAT-3');miR-192-5p:(Forward primer:5′-GGACTTTCTTCATTCACACCG;Reverse primer:5′-GACCACTGAGGTTAGAGCCA)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

RISM 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)評(píng)估研究組、炎癥組、對(duì)照組血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的表達(dá)水平差異。應(yīng)用受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)分析血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p檢測(cè)早期鼻咽癌的臨床診斷價(jià)值。陽(yáng)性臨界值為ROC曲線中靈敏度-(1-特異度)的最大值所對(duì)應(yīng)的數(shù)值。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組受試人員血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的表達(dá)水平

研究組、炎癥組、對(duì)照組受試人員血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的表達(dá)水平具有顯著差異(P<0.05),并且研究組受試人員血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的表達(dá)水平均高于炎癥組和對(duì)照組(P<0.05)、炎癥組受試人員血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P<0.05),見表1。

表1 3組受試人員血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的表達(dá)水平

2.2 兩組血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的ROC曲線、AUC、靈敏度、特異度和截?cái)嘀?/h3>

為了評(píng)估血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p在早期鼻咽癌與鼻咽炎中的診斷價(jià)值,繪制90例鼻咽癌患者和90例鼻咽炎的ROC曲線(圖1)。miR-140-3p的受試者工作特征曲線的AUC為0.90±0.03(95%CI 0.8501～0.9531),以miR-140-3p的陽(yáng)性臨界值1.79,其診斷靈敏度為91%,特異度為90%; miR-192-5p的受試者工作特征曲線的AUC為0.88±0.02(95%CI 0.8427～0.9370),以 miR-192-5p的陽(yáng)性臨界值2.04,其診斷靈敏度為89%,特異度為90%;miR-223-3p的受試者工作特征曲線的AUC為0.95±0.01(95%CI 0.9284～0.9790),以miR-223-3p的陽(yáng)性臨界值1.68,其診斷靈敏度為98%,特異度為94%。見圖1和表2。

圖1 兩組血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的ROC曲線

表2 兩組血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的AUC、靈敏度、特異度和截?cái)嘀?/p>

2.3 兩組血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的ROC曲線、AUC、靈敏度、特異度和截?cái)嘀?/h3>

為了評(píng)估血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p在早期鼻咽癌患者與健康體檢者中的診斷價(jià)值,繪制90例鼻咽癌患者和90例健康體檢者的ROC曲線(圖2)。miR-140-3p的受試者工作特征曲線的AUC為0.96±0.02(95%CI 0.9296～0.9926),以miR-140-3p的陽(yáng)性臨界值1.09,其診斷靈敏度為96%,特異度為95%; miR-192-5p的受試者工作特征曲線的AUC為0.94±0.02(95%CI 0.9009～0.9838),以 miR-192-5p的陽(yáng)性臨界值1.34,其診斷靈敏度為94%,特異度為95%;miR-223-3p的受試者工作特征曲線的AUC為0.95±0.02(95%CI 0.9059～0.9844),以miR-223-3p的陽(yáng)性臨界值0.88,其診斷靈敏度為95%,特異度為95%。見圖2和表3。

圖2 兩組血清中miR-140-3p,miR-192-5p,miR-223-3p的ROC曲線

表3 兩組血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的AUC、靈敏度、特異度和截?cái)嘀?/p>

2.4 血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p對(duì)早期鼻咽癌的聯(lián)合診斷價(jià)值

患有早期鼻咽癌的為真陽(yáng)性,未患有早期鼻咽癌的為真陰性。以miR-140-3p的陽(yáng)性臨界值1.79、miR-192-5p的陽(yáng)性臨界值2.04、miR-223-3p的陽(yáng)性臨界值1.68為診斷標(biāo)準(zhǔn),三者均滿足為聯(lián)合診斷陽(yáng)性,反之則為聯(lián)合診斷陰性。聯(lián)合診斷陽(yáng)性96例(其中病理診斷陽(yáng)性85例、陰性11例)、陰性174例(其中病理診斷陽(yáng)性5例、陰性169例)。因此,血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p聯(lián)合檢測(cè)對(duì)早期鼻咽癌的診斷的的靈敏度為94.44%(85/90),特異度為93.89%(169/180),準(zhǔn)確度為94.07%(254/270)。

3 討論

鼻咽癌由于病變隱匿且早期癥狀不典型,很難早期發(fā)現(xiàn)和診斷。大約70%～80%的鼻咽癌患者在診斷時(shí)出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甚至是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,這成為限制患者生存的重要因素。同時(shí),有相當(dāng)一部分鼻咽癌患者直到病情發(fā)展到晚期才被發(fā)現(xiàn),導(dǎo)致其預(yù)后差,臨床治療效果不理想[8-9]。因此,有效的預(yù)防和預(yù)測(cè)策略是減輕鼻咽癌負(fù)擔(dān)的關(guān)鍵。越來(lái)越多的證據(jù)表明miRNAs可能通過(guò)調(diào)控靶基因在鼻咽癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用?？梢栽谘獫{或血清中穩(wěn)定檢測(cè)到的miRNA已被證明是多種癌癥類型生物標(biāo)志物的穩(wěn)定來(lái)源[10]。在本研究中,我們基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)90例早期鼻咽癌患者、90例鼻咽炎患者、90例健康體檢者血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的檢測(cè)和ROC曲線分析,發(fā)現(xiàn)血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p聯(lián)合對(duì)早期鼻咽癌的診斷的靈敏度為94.44%,特異度為93.89%,準(zhǔn)確度為94.07%。

越來(lái)越多的證據(jù)表明,miRNA與癌癥生物學(xué)過(guò)程有著密切的關(guān)系[11]。miRNA作為潛在的生物標(biāo)志物在包括鼻咽癌在內(nèi)的各種癌癥類型中具有特殊的意義[12]。與其他分子標(biāo)記相比,血清中miRNA具有穩(wěn)定、易于測(cè)量、樣品采集過(guò)程簡(jiǎn)單、檢測(cè)技術(shù)成熟等優(yōu)點(diǎn)[13-14]。miR-140-3p對(duì)肺癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲有正向作用[15]。也發(fā)現(xiàn)其與非小細(xì)胞肺癌中miR-140/PD-L1/cyclin E通路相關(guān),這為腫瘤免疫治療帶來(lái)了新的靶點(diǎn)[16]。在本研究中,發(fā)現(xiàn)研究組、炎癥組、對(duì)照組血清中miR-140-3p的表達(dá)水平具有顯著差異(P<0.05),并且研究組血清中miR-140-3p的水平均高于炎癥組合對(duì)照組。因此,我們推測(cè)其在鼻咽癌患者血清中的上調(diào)可能導(dǎo)致腫瘤抑制功能的缺失。miR-192-5p在肝癌、胃癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤等多種癌癥中被發(fā)現(xiàn)上調(diào)[17]。據(jù)報(bào)道[18],它是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期通路中的關(guān)鍵因子(如Dicer1)而成為腫瘤啟動(dòng)子。然而,在其他一些癌癥如結(jié)直腸癌中,它經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)具有下調(diào)、反向抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)[19],miR-192-5p通過(guò)直接靶向USP1抑制骨肉瘤的起始和進(jìn)展。在本研究中,發(fā)現(xiàn)研究組、炎癥組、對(duì)照組血清中miR-192-5p的表達(dá)水平具有顯著差異(P<0.05),并且研究組血清中miR-192-5p的水平均高于炎癥組合對(duì)照組。其在不同腫瘤中的復(fù)制性揭示了miR-192-5p生物學(xué)功能的復(fù)雜性。據(jù)報(bào)道[20],MiR-223-3p在卵巢癌中過(guò)表達(dá),體外過(guò)表達(dá)MiR-223-3p通過(guò)調(diào)節(jié)性別決定區(qū)Y-box 11促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。研究發(fā)現(xiàn)[21],miR-223-3p在DU-145和LNCaP細(xì)胞中的表達(dá)降低會(huì)降低多西紫杉醇的IC50值并提高細(xì)胞凋亡率,這表明miR-223-3p抑制劑可提高DU-145和LNCaP對(duì)多西紫杉醇的化學(xué)敏感性。因此,miR-223-3p可能是一個(gè)抗化療因子。在化療的同時(shí),在合適的呈遞系統(tǒng)的情況下,給鼻咽癌患者給予miR-223-3p inhibitor的治療可能會(huì)提高化療的效果。此外,雖然大多數(shù)miRNA是胞內(nèi)的,但細(xì)胞外miRNA的穩(wěn)定表達(dá)譜提示miRNA不僅可以被動(dòng)地向外釋放,還可以以某些特定的方式主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn),從而導(dǎo)致表達(dá)失衡。

然而,本研究仍然有不足之處。為了擴(kuò)大已識(shí)別的miRNA在血清中的診斷應(yīng)用,需要進(jìn)一步探索了具有不同臨床病理特征的鼻咽癌患者血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的表達(dá)。例如,EBV感染是鼻咽癌發(fā)生的誘因之一[22]。愛因斯坦-巴爾病毒(EBV)在病因上與霍奇金淋巴瘤,伯基特淋巴瘤,胃癌和鼻咽癌等幾種癌癥相關(guān),是第一個(gè)報(bào)道的人類腫瘤病毒。EBV的攜帶感染率高達(dá)90%,但只有少數(shù)人會(huì)感染鼻咽癌。因此,有理由認(rèn)為不同的miRNA表達(dá)模式可能參與了鼻咽癌中某些EBV相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程,將鼻咽癌患者分為EBV陽(yáng)性和EBV陰性后值得進(jìn)一步探討血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p在此兩組患者中的表達(dá)差異。

綜上所述,血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的表達(dá)水平檢測(cè)可作為早期鼻咽癌的潛在標(biāo)志。