于 曉 肖 艷 楊 柳

高危型人乳頭瘤病毒(HPV)的持續(xù)感染是引發(fā)宮頸癌的主要原因之一,近年來隨著HPV疫苗的問世,宮頸癌發(fā)病率和死亡率有下降趨勢,但其發(fā)生發(fā)展機制依然是醫(yī)學界研究的熱點問題。遺傳是影響宮頸癌發(fā)生的因素之一,單核苷酸多態(tài)性是指基因水平上單個核苷酸變異引發(fā)的DNA序列多態(tài)性,進一步造成轉(zhuǎn)錄核苷酸變化,是一種常見的人類可遺傳變異[1]。目前已有研究報道亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)[2]、抑癌基因p53[3]等基因多態(tài)性與婦女感染高危HPV后發(fā)生宮頸癌有關(guān)。Toll樣受體(TLR)家族是一類能識別微生物保守分子成分的蛋白,能通過激活機體免疫系統(tǒng)從而清除病原菌。相關(guān)研究顯示,TLR2/4基因多態(tài)性與HPV感染者的尖銳濕疣易感性有關(guān),而與宮頸癌易感性尚不明確[4]?；诖?本次通過分析宮頸癌、宮頸上皮瘤變、無病變的HPV感染人群TLR2/4基因多態(tài)性,旨在為宮頸癌發(fā)病機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年1月到2021年12月我院收治的83例高危型HPV感染宮頸癌患者作為宮頸癌組,納入標準:①經(jīng)病理活檢確診為宮頸癌,參考2014年NCCN提出的診斷標準[5];②HPV篩查陽性,存在高危型HPV感染者;③本地區(qū)常住人口;④病歷資料完整。排除標準:①存在其他惡性腫瘤或存在放化療及免疫治療史;②存在嚴重肝腎功能不全、糖尿病、心血管疾病等。另選75例高危型HPV感染的同期體檢女性作為對照組,2組患者一般資料比較無顯著差異(P>0.05),見表1。

表1 2組一般資料比較

1.2 方法

采集所有受試者靜脈血5 mL,經(jīng)EDTA抗凝后于-4 ℃保存,并在7 d以內(nèi)采用蛋白酶K消化飽和NaCl鹽析法提取其中DNA。根據(jù)Pubmed官網(wǎng)查詢的基因序列進行引物設(shè)計,引物序列及產(chǎn)物見表2。TLR2-196 to -174 del基因多態(tài)性檢測:PCR擴增,95 ℃預(yù)處理5 min,變性95 ℃ 30 s,退火58 ℃ 40 s,延伸72 ℃ 30 s,共30 cycle,最后72 ℃ 10 min。獲得的產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳,然后在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察。TLR2 15607(A/G)及TLR4 Asp299Gly、Thr399Ile的基因多態(tài)性檢測:PCR擴增,95 ℃預(yù)處理5 min,變性95 ℃ 30 s,退火55 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s,共30 cycle,最后72 ℃ 10 min。獲得產(chǎn)物采用限制性內(nèi)切酶進行切割,每個樣本各取5 μL在瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察。選擇有代表性的產(chǎn)物采用末端終止法進行測序,完成后與基因庫中對應(yīng)野生型序列進行對比,以驗證PCR-RFLP結(jié)果。

表2 引物序列比較

1.3 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 2組TLR2-196 to -174 del基因多態(tài)性比較

宮頸癌組、對照組TLR2-196 to -174 del基因缺失率(ins/del+del/del)分別為57.83%、61.34%,組間比較無明顯差異(P>0.05),表明TLR2-196 to -174 del多態(tài)性與宮頸癌發(fā)生無明顯關(guān)系(P>0.05),見表3。

表3 各組TLR2、4基因多態(tài)性比較(例,%)

2.2 2組TLR2 15607(A/G)基因多態(tài)性比較

宮頸癌組和對照組TLR2 15607(A/G)基因型及等位基因頻率無明顯差異(P>0.05),見表4。

表4 2組TLR2 15607(A/G)基因多態(tài)性比較(例,%)

2.3 2組TLR4 Asp299Gly基因多態(tài)性比較

宮頸癌組和對照組TLR4 Asp299Gly基因型及等位基因頻率無明顯差異(P>0.05),見表5。

表5 2組TLR4 Asp299Gly基因多態(tài)性比較(例,%)

2.4 2組TLR4 Thr399Ile基因多態(tài)性比較

宮頸癌組和對照組TLR4 Thr399Ile基因型及等位基因頻率無明顯差異(P>0.05),見表6。

表6 2組TLR4 Thr399Ile位點多態(tài)性比較(例,%)

3 討論

HPV是一種雙鏈DNA病毒,能通過激活端粒酶植入癌蛋白從而使抑癌基因失活,并逐步引發(fā)宮頸上皮病變和宮頸癌的發(fā)生[6]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有30多種HPV的持續(xù)感染可導致宮頸癌的發(fā)生,常見有高危型HPV16/18[7-8]。HPV感染后可刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答,起到清除病原體作用,而此過程依賴于模式識別受體起作用。TLR2是模式識別受體TLR家族的重要成員,具有廣泛配體特異性,可協(xié)助TLR4參與機體對內(nèi)毒素脂多糖(LPS)的免疫反應(yīng)[9]。有研究發(fā)現(xiàn),TLR2、4基因突變可引發(fā)其配體信號傳導過程,進而影響機體免疫功能和HPV感染進程,最終導致宮頸癌的發(fā)生[10]。臨床觀察也可發(fā)現(xiàn),僅有小部分HPV感染者最終會發(fā)展為宮頸癌,推測TLR2、4基因突變可能在其中起了重要作用。

目前關(guān)于TLR2、4基因多態(tài)性與HPV易感性研究較多,如有學者認為,TLR2、4基因突變可引發(fā)機體免疫系統(tǒng)對HPV清除能力不足,引發(fā)HPV的持續(xù)感染及對宮頸癌上皮的損傷,最終導致宮頸癌的發(fā)生[11]。還有學者研究認為,TLR2、4、9基因多態(tài)性與HPV感染及宮頸癌易感性無明顯關(guān)系[12],但目前相關(guān)研究結(jié)論并未達成一致。本次研究顯示2組人群TLR2-196 to -174 del基因頻率分布無明顯差異,提示其與宮頸癌發(fā)生無關(guān)。TLR2-196 to -174 del突變會導致其出現(xiàn)22 bp位點缺失,有研究認為其可能會影響TLR2啟動子區(qū)功能,進而影響蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯[13]。但本次研究中宮頸癌患者與對照組人群此位點基因缺失率較高(57.83%和61.34%),但組間比較均無明顯差異,與Hu等[14]調(diào)查結(jié)果類似。此外,有研究發(fā)現(xiàn)TLR2 15607(A/G)多態(tài)性與HPV感染及生殖器皰疹皮損數(shù)目有關(guān)[15],本次研究顯示其與宮頸癌發(fā)生無明顯相關(guān),推測TLR2 15607(A/G)基因突變在不同性別人群或不同疾病進程中作用存在差異。TLR4是免疫系統(tǒng)識別LPS后激活免疫應(yīng)答的必經(jīng)途徑,其基因突變可引發(fā)TLR4受體功能不足,針對LPS反應(yīng)的Th1型細胞因子分泌減少,從而影響機體免疫功能及炎癥反應(yīng)。目前主要針對TLR4的Asp299Gly、Thr399Ile位點進行研究,但相關(guān)結(jié)論差距較大。有學者檢測了挪威地區(qū)宮頸癌及正常人群TLR4的兩位點基因頻率,但并未發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性[16]。還有學者研究了日本地區(qū)健康人群,發(fā)現(xiàn)兩位點突變率分別19.5%和22.0%[17]。本次研究顯示,TLR4 Asp299Gly、Thr399Ile位點基因多態(tài)性與宮頸癌發(fā)生無明顯相關(guān)性,與Makni等[18]研究一致。有研究發(fā)現(xiàn)TLR4 Asp299Gly、Thr399Ile位點的基因多態(tài)性與印度北部婦女發(fā)生宮頸癌相關(guān),但在亞洲其他地區(qū)婦女中并不相關(guān),推測TLR4基因多態(tài)性可能有地域及種族差異,這也可能是各研究結(jié)果不一致的原因[19]。還有研究發(fā)現(xiàn)TLR2 597、1350位點及TLR4 896、1196位點的基因頻率變化與HPV感染及尖銳濕疣(CA)治療后復(fù)發(fā)有關(guān)[20],推測TLR2、4基因多態(tài)性與HPV易感性關(guān)系可能在不同位點中存在差異。

綜上所述,高危型HPV感染人群TLR2-196 to-174del、15607(A/G)及TLR4 Asp299Gly、Thr399Ile基因多態(tài)性與罹患宮頸癌無明顯相關(guān)性。但不同基因多態(tài)性位點差異導致生物學功能改變的相關(guān)機制尚不明確,具體情況有待更多研究進一步證實。