劉鈺 周勝芳 夏豫川 任羽

摘? ?要? ?以開花后的蝴蝶蘭花梗為外植體，對影響外植體誘導的消毒方式、二次消毒、外源激素等進行探究，對蝴蝶蘭外植體實驗過程中產(chǎn)生的污染進行原因分析。試驗結(jié)果表明： ① 0.1%的HgCl2消毒16分鐘時效果最好;0.15% HgCl2的消毒效果要優(yōu)于0.1%的，且在消毒10分鐘時效果最好。② 對污染的花梗進行二次消毒，按初次消毒的方式消毒后，再用多菌靈浸泡15分鐘后放入添加抗生素的培養(yǎng)基效果最好。

關(guān)鍵字? ?蝴蝶蘭;誘導;組織培養(yǎng);污染

蝴蝶蘭，是蘭科蝴蝶蘭屬的常綠草本植物。因蝴蝶蘭的色彩鮮艷、造型別致、花期較長而享有“洋蘭皇后”的美譽，深得消費者的喜愛。蝴蝶蘭的葉大、莖短、花一到數(shù)枚，由于花形似蝶得名，與卡特蘭、石斛蘭、萬代蘭并稱為四大觀賞蘭。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過70個蝴蝶蘭的原生種，其原產(chǎn)于熱帶、亞熱帶雨林地區(qū)， 我國臺灣和東南亞等地區(qū)均有分布。現(xiàn)有的蝴蝶蘭雜交品種很多，經(jīng)過官方認證的蝴蝶蘭品種已經(jīng)達到了10萬多個，現(xiàn)已在全世界廣泛栽植。蝴蝶蘭不是寄生性植物，而是附生蘭，僅立足于附生物上，在空氣中吸收水分，在樹皮裂隙的腐殖質(zhì)中汲取有機物。

蝴蝶蘭是單莖性氣生蘭，其種子小且無胚乳，只有一層非常薄的種皮，在自然條件下很難萌發(fā)。因此組織培養(yǎng)是蝴蝶蘭快速繁殖的重要途經(jīng)，植物組織培養(yǎng)技術(shù)可以保持植株優(yōu)良性狀，保存種質(zhì)資源，還能夠?qū)⒑m繁殖周期縮短，從而獲得大量的植株。

現(xiàn)在生產(chǎn)和工業(yè)上使用的蝴蝶蘭植物組織培養(yǎng)技術(shù)主要有：①原球莖途徑。原球莖途徑主要是指采用蝴蝶蘭的離體器官如葉、莖等來誘導產(chǎn)生原球莖，進一步誘導原球莖獲得分生苗;②利用種子無菌播種得到實生苗;③直接誘導出叢生芽。一直以來，原球莖途徑是人們研究的重點，但主要有兩方面不足，一是繁殖系數(shù)低或容易使母株喪失，二是遺傳不穩(wěn)定，后代容易發(fā)生變異。利用叢生芽途徑快速繁殖就能很好的解決變異的問題。

根據(jù)外植體不同的帶菌程度采取有效的消毒措施是組織培養(yǎng)的關(guān)鍵。酒精和升汞是植物組織培養(yǎng)中常用的消毒試劑，能夠使蛋白質(zhì)脫水變性從而達到消毒效果。宋火元研究表明，0.1%升汞對蝴蝶蘭外植體有明顯的消毒效果，但是處理時間過長后升汞殘留較多，其毒性影響了外植體的生長，在消毒時間超過22分鐘時外植體甚至完全失活。因此研究外植體消毒時間對外植體脫毒效果的影響，對蝴蝶蘭擴繁產(chǎn)業(yè)有重要的? ? 意義。

1 材料與方法

1.1 材料? ?蝴蝶蘭花梗取自西華師范大學生命科學學院培養(yǎng)室。

1.2? ?方法

1）外植體的消毒。選擇生長健壯的蝴蝶蘭植株，取已開花的花梗作為誘導的外植體材料，不破壞腋芽。枝剪消毒后將外植體剪成2～3 cm的小段，每段含一個腋芽，先用洗潔精溶液沖洗去表面的灰塵雜質(zhì)，放入肥皂水浸泡20～30分鐘后，再用自來水沖洗20～30分鐘，然后進行無菌消毒處理。

在超凈工作臺上先用75%的酒精消毒30秒后用HgCl2（升汞）消毒（濃度及時間見表1），然后用無菌水沖洗莖段上殘留的HgCl2，再用無菌濾紙吸干水分后放置在無菌盤中，將花梗切成 1～1.5 cm 的莖段（保留腋芽，并將花梗腋芽外的包葉剝?nèi)ィ?，芽的下端斜切，上端平切，順勢插于培養(yǎng)基中，不要淹沒芽點。培養(yǎng)室溫度設(shè)置為（25±1） ℃，光/暗周期14小時/10小時。

2）二次消毒。將污染的外植體按照初次消毒的方式同樣消毒后，放入多菌靈中浸泡（0分鐘、15分鐘、30分鐘）后放入培養(yǎng)基（含抗生素、不含抗生素）。采用正交試驗方法設(shè)計正交表（表2），接種20天后統(tǒng)計出芽率。

2 結(jié)果分析

2.1? ?消毒方式對外植體誘導的影響? ?在蝴蝶蘭生長過程中，植株體內(nèi)會攜帶一定的內(nèi)生菌，要達到徹底消毒的效果，關(guān)鍵是選擇有效的消毒方式。從表4中可以看出，當HgCl2的濃度為0.1%時，消毒的時間越長，消毒的效果越好，其污染率越低，0.1%HgCl2消毒16分鐘效果最好，但是存活率為零。可能是因HgCl2毒性大損傷腋芽影響植株正常生長。HgCl2濃度為0.1%時，最佳消毒時間為14分鐘。但此組消毒效果不理想，或許是由于外植體自身攜帶的病菌較多或操作過程出現(xiàn)失誤所致。0.15%的消毒效果優(yōu)于0.1%，0.15%氯化汞消毒10分鐘，污染率20%，存活率80%，效果最好，但隨著消毒時間的增加污染率呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢。

2.2? ?二次消毒效果對比? ?經(jīng)過和二次消毒后結(jié)果見表4?？梢钥闯?，在相同的多菌靈浸泡時間下，培養(yǎng)基中添加抗生素二次消毒效果更好;在相同的培養(yǎng)基中，使用多菌靈浸泡，二次消毒效果更好，多菌靈浸泡15分鐘污染率雖達50%、但存活率較浸泡30分鐘高出25%。綜合考慮使用多菌靈浸泡15分鐘后植入添加抗生素的培養(yǎng)基效果較好。

3? ?污染原因分析

污染是蝴蝶蘭組培過程中無法回避的。培養(yǎng)基滋生各種霉菌，影響組培材料生長、發(fā)育。在工廠化育苗過程中，若是污染率持續(xù)走高，導致蝴蝶蘭組織培養(yǎng)的成本升高，將影響整個工廠化育苗的成功與否。

3.1? ?外植體? ?外植體是植物組織培養(yǎng)或其他體外實驗的植物器官和組織的切段。蝴蝶蘭外植體長期暴露在空氣中，與外界的環(huán)境直接接觸，對外植體滅菌不徹底，是導致污染的一個十分重要因素。外植體內(nèi)攜帶的病原菌產(chǎn)生的污染是全身性的，占一定比例。具體表現(xiàn)為：通常培養(yǎng)數(shù)周后，外植體攜帶的病菌從培養(yǎng)基接觸外植體的地方擴散開來，甚至直接從外植體中長出。

3.2? ?環(huán)境? ?在操作過程中，接種臺周圍，或者環(huán)境中含有霉菌和成熟孢子，組培苗污染率將會大大提高。

3.3? ?操作不規(guī)范? ?接種過程中使用的各種器械，如鑷子、接種盤等工具滅菌不完全會導致污染，不規(guī)范操作也會造成污染。整個接種過程步驟和操作繁雜，接種人員不經(jīng)意會造成工具污染。

3.4? ?后期管理? ?接種工作完成后，組培瓶放在培養(yǎng)室培養(yǎng)，不僅要嚴格把控培養(yǎng)室的溫度和光照情況，衛(wèi)生狀況也要嚴格要求。培養(yǎng)室保持干燥，防止霉菌滋生，及時觀察和清除污染的瓶苗。

4? ?褐化

在整個組織培養(yǎng)過程中，蝴蝶蘭材料常常出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。產(chǎn)生褐化主要是因為植物組織多酚氧化酶和酚類物質(zhì)相結(jié)合，在氧氣的作用下發(fā)生化學反應(yīng)形成醌類物質(zhì)。醌類物質(zhì)呈褐色，當其進入培養(yǎng)基不僅影響植物體內(nèi)酶的活性，使得植物無法正常代謝，還甚至會使植物死亡。

為防止褐化常常使用抗氧化劑和吸附劑?？寡趸瘎┲饕芯S生素等，吸附劑有活性炭等。谷胱甘肽和檸檬酸一般控制褐變，但對植物生根和芽形成影響不大。及時切除變黑區(qū)域，及時更換培養(yǎng)基也可以有效防止變褐化。

5? ?結(jié)論與討論

莖尖、葉片、根尖、頂芽等都可以用作外植體進行組織培養(yǎng)，不同部位方法和難易程度不同，如選用腋芽為外植體，蝴蝶蘭植株損傷小且取材方便。研究外植體升汞消毒時間對外植體脫毒效果的影響，為蝴蝶蘭擴繁產(chǎn)業(yè)提供理論依據(jù)。當前常見的花梗消毒處理方式是采用0.1%升汞浸泡，具有方法簡單，消毒效率高的優(yōu)點，但是安全性低。付鎮(zhèn)芳等將NaClO（次氯酸鈉）溶液和升汞的消毒效果進行比較，發(fā)現(xiàn)NaClO溶液的消毒殺菌作用遠不如升汞好。

本實驗考慮到取開花后的花梗作為外植體，故使用0.1%、0.15% 的HgCl2對外植體進行消毒。研究表明在HgCl2的濃度為0.1%時，消毒的時間越長，消毒的效果越好，但是隨著消毒時間的增加存活率降低。當HgCl2的濃度為0.15%時，結(jié)果顯示0.15%HgCl2消毒效果要優(yōu)于0.1%。當0.15%HgCl2的氯化汞消毒10分鐘時，消毒效果最好，隨著消毒時間的增加污染率呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢。

蝴蝶蘭花梗外植體寶貴，污染后直接扔掉很浪費，因此將污染的外植體進行二次消毒對工廠化育苗和實驗室培養(yǎng)都有著重要的意義。對初次消毒后污染的蝴蝶蘭花梗外植體進行二次消毒，研究表明多菌靈和抗生素對二次消毒的效果較好，但多菌靈浸泡時間過長，毒性大損傷芽，影響植株正常生長。

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