高宇婷，潘 安，姚保利，馬彩文*

（1.中國科學(xué)院 西安光學(xué)精密機械研究所，陜西 西安 710119；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.中國科學(xué)院 空間精密測量技術(shù)重點實驗室，陜西 西安 710119）

1 引 言

17 世紀(jì)時，荷蘭科學(xué)家列文虎克首次使用自制透鏡組合，實現(xiàn)了270 倍放大率，可以觀測到細菌和微觀生物，成為顯微鏡發(fā)明第一人，正式開啟了顯微時代。19 世紀(jì)至20 世紀(jì)，光學(xué)理論蓬勃發(fā)展，工業(yè)革命帶來了機械制造業(yè)飛速進步，此外，數(shù)學(xué)、材料、物理等領(lǐng)域技術(shù)也突飛猛進，這一切都促使顯微技術(shù)煥發(fā)出全新的生機。而各式各樣的顯微鏡又使得光學(xué)顯微鏡從更清晰、分辨率更高轉(zhuǎn)向多元化、多用途，開啟了全新的發(fā)展之路。得益于高性能計算機、高精度探測器以及高效照明器件的發(fā)明，荷蘭物理學(xué)家澤尼克于1935 年提出了澤尼克相襯顯微術(shù)［1］。隨之陸續(xù)誕生的各種計算成像方法將光學(xué)顯微鏡引入了由硬件組合到軟硬件結(jié)合的新紀(jì)元。

進入現(xiàn)代以來，顯微鏡整體結(jié)構(gòu)并沒有太大變化，雖然機械部分也在不斷優(yōu)化，但是主體仍舊使用笨重且昂貴的光學(xué)器件。盡管經(jīng)歷了幾個世紀(jì)的發(fā)展，可現(xiàn)代光學(xué)顯微鏡仍然存在一些難以突破的物理限制，如光學(xué)衍射極限、視場與分辨率之間的矛盾關(guān)系、景深狹小、像差等。本質(zhì)則是由于衍射效應(yīng)與像差的影響，導(dǎo)致點物不能成理想的點像，光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計上必須做出相應(yīng)取舍。同時，病理學(xué)、生物學(xué)研究等領(lǐng)域?qū)τ诩毎旱膩喗Y(jié)構(gòu)研究也為現(xiàn)代顯微學(xué)科提出高分辨率與大視場結(jié)合的現(xiàn)實需求。然而傳統(tǒng)顯微鏡的視場與分辨率之間存在權(quán)衡關(guān)系，使用相同探測器下，通常低倍率的物鏡能夠?qū)⒏嗑拔镅b入視野內(nèi)，從而視場大但分辨率不高；高倍率的物鏡只關(guān)注較小的視野，從而視場小但分辨率高。如何突破視場與分辨率的限制實現(xiàn)高通量成像成為顯微成像領(lǐng)域的一大難點。根據(jù)實現(xiàn)高通量成像方法的不同，顯微成像技術(shù)大致可以分為4 類。第一類技術(shù)代表是大孔徑物鏡制造與曲面探測技術(shù)［2-6］：基于純光學(xué)設(shè)計的思想，直接制造更大孔徑的物鏡，從而同時獲得大視場與高分辨率。但所引入的幾何像差需要更多片的透鏡進行優(yōu)化補償，導(dǎo)致整個系統(tǒng)體積極其龐大，超過了傳統(tǒng)物鏡齊焦距離的限制，同時視場的增大也會帶來嚴(yán)重的畸變。為簡化光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計復(fù)雜度，需引入曲面探測。通俗理解這一類方法可以為“大力出奇跡”，這類方法成本極高，需要足夠空間，適合儀器固定樣本更替的場景。第二類是以掃描拼接技術(shù)［7-12］為代表：先獲取高分辨率再獲取大視場，“分而治之”的思想，諸如在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的基礎(chǔ)上，通過添加機械位移平臺，實現(xiàn)樣本與探測器之間的相對位移，利用高倍率物鏡保證成像分辨率，利用視場拼接技術(shù)保證大視場，從而得到高通量成像。這也是拍攝全景照片常用的思路，方法簡單、成本低，但存在拼接偽影、重影、失敗等不確定因素，存在景深狹小、效率低等限制。第三類是以數(shù)字合成孔徑概念為基礎(chǔ)，先獲取大視場再獲取高分辨率。相比于掃描拼接的空域重構(gòu)，這類方法則是頻域重構(gòu)，以傅里葉疊層顯微成像技術(shù)［13-59］、寬場結(jié)構(gòu)光照明技術(shù)［60-63］等為代表，有效解決了上述掃描拼接方案的內(nèi)生問題，但依然存在諸多挑戰(zhàn)，如對高性能探測器、算力、算法的依賴。第四類則是以無透鏡成像技術(shù)為代表［64-72］，徹底放棄了物鏡，從本質(zhì)上繞過或者突破了像差帶來的各種系統(tǒng)限制，通俗理解這一類方法可以為“逆向思維”，但隨之而來的則是探測器方面的限制。

本文系統(tǒng)介紹了5 種具有代表性的高通量顯微成像技術(shù)原理及特點，包括物理定義與數(shù)學(xué)描述、大孔徑物鏡制造與曲面探測技術(shù)、掃描拼接技術(shù)、傅里葉疊層顯微成像技術(shù)、寬場結(jié)構(gòu)光照明技術(shù)和無透鏡片上顯微成像技術(shù)。展示了相關(guān)實驗結(jié)果并進行了比較。對5 種高通量成像技術(shù)而言，并不存在誰絕對優(yōu)于誰，而是都有最適合或者專屬的應(yīng)用場景。甚至對于復(fù)雜場景，同時使用多種技術(shù)是一重要趨勢。最后針對現(xiàn)存的問題、挑戰(zhàn)及未來趨勢進行了詳細討論。

2 高通量顯微成像技術(shù)介紹與比較

2.1 物理定義與數(shù)學(xué)描述

阿貝根據(jù)光柵原理推導(dǎo)出阿貝衍射極限為［73］：

其中：λ為入射光波長，NA為物鏡的數(shù)值孔徑（Numberical aperture，NA）。早期的提升分辨率的方式聚焦于降低入射光波長，使用光源為10-3nm 的電子束構(gòu)成的電子顯微鏡，實現(xiàn)了0.1 nm 甚至更高的成像分辨率［74］。但是短波長射線照射生物細胞時會對其結(jié)構(gòu)造成損傷，且觀測時所使用的樣本必須在高真空的條件下制備，使得觀測難度提升。故一味通過縮小波長并不適用于生物醫(yī)學(xué)對細胞微結(jié)構(gòu)的觀測與分析。NA 的計算公式為：

其中：θ為物鏡最大吸收光束的半角大小，η為物空間折射率。由此不難看出NA衡量的是光學(xué)系統(tǒng)對光束的吸收能力。物鏡作為一個低通濾波器，NA 則衡量了其截止頻率，只有在截止頻率范圍內(nèi)的信息才可以通過物鏡。通過使用更高倍率的物鏡（更大的NA）可以獲得更高的成像分辨率，然而這也意味著更狹小的景深以及像差更難校正。顯微鏡理想視場的計算方法如式（3）所示：

其中：FN 為視場數(shù)，Mag 為放大倍率，可看出放大倍率的增大也會使得視場大幅減小。視場與分辨率無法同時兼顧，也導(dǎo)致針對復(fù)雜樣本的小區(qū)域研究成為難題。視場與分辨率之間矛盾的權(quán)衡，成為制約顯微領(lǐng)域的一個難題，而顯微鏡的視場與分辨率也決定了其成像的信息量。

光學(xué)中通常使用空間帶寬積（Space-bandwidth product，SBP）來衡量光學(xué)系統(tǒng)的信息量。對顯微鏡而言，則是視場中可解析的有效像素數(shù)量，即成像通量。成像系統(tǒng)的SBP 越大，代表其可分辨的信息就越多。對于非相干成像系統(tǒng)，其SBP計算方法為：

SBP 的計算同時衡量了光學(xué)系統(tǒng)中視場與分辨率性能。“空間”指的是顯微系統(tǒng)可實現(xiàn)的觀測視場大小，而“帶寬”則衡量了頻域中的截止頻率，兩者共同描述了成像系統(tǒng)的信息承載能力。其他研究領(lǐng)域?qū)Α案咄俊睋碛胁煌亩x，如在數(shù)字病理學(xué)領(lǐng)域，通量指的是病理切片掃描儀單次可自動化實現(xiàn)的連續(xù)觀測切片的數(shù)量，通常將能連續(xù)實現(xiàn)20 片以上切片觀測的病理切片掃描儀定義為高通量掃描儀。本文中的“高通量”指的是利用SBP 衡量的光學(xué)領(lǐng)域的定義。現(xiàn)階段的光學(xué)顯微鏡由于其光學(xué)系統(tǒng)的限制，可以達到的SBP一般為千萬像素級，隨著顯微鏡所搭載物鏡的放大倍率的提升，SBP 逐漸下降。

2.2 大孔徑物鏡制造與曲面探測技術(shù)

由于顯微鏡存在視場和分辨率的制約，所以實現(xiàn)集群細胞的亞細胞結(jié)構(gòu)就十分困難。如圖1所示，圖1（a）為4×顯微鏡物鏡（0.1 NA，Nikon），視場直徑為5.5 mm；圖1（b）為20×/0.45 NA 物鏡（Plan Fluor），視場是1.1 mm 直徑，其分辨率較4×/0.1 NA 的Nikon 物鏡提升了4.5 倍，F(xiàn)OV卻縮小了25 倍。

圖1 使用4×與20×物鏡的顯微系統(tǒng)采集圖像比較。（a）使用4×物鏡采集到的分辨率板灰度圖像，（a1）為（a）中對應(yīng)位置的放大圖；（b）使用20×物鏡時采集到的分辨率板灰度圖像。Fig.1 Comparison of images acquired by microscope systems using 4× and 20× objectives.（a）Grayscale image of a USAF acquired with a 4× objective，（a1）is an enlarged view of the corresponding position in（a）；（b）Grayscale image of a USAF acquired with a 20× objective.

從硬件層面考慮，在保證高分辨率的前提下，若將物鏡的FOV 擴大，則可使SBP 突破視場與分辨率的制約限制，最直接的就是制造更大尺寸的透鏡。但是更大尺寸的透鏡也會帶來更嚴(yán)重的幾何像差，此時就需要在系統(tǒng)光路中添加額外透鏡對像差進行補償。此類實現(xiàn)高通量的方案會造成系統(tǒng)龐大、不便攜帶、光路標(biāo)校困難，不滿足光學(xué)系統(tǒng)高性能、輕量化和微型化的要求，故一般使用在擁有足夠空間，儀器固定，樣本流替的場景，如光刻機［2］上。圖2（a）為ASML 的DUV 光刻機系統(tǒng)示意圖，可以看到顯微物鏡占據(jù)了近1/2 的體積。此外，僅在高倍物鏡前提下，一味擴大視場會產(chǎn)生更大的畸變，所以需要運用更加復(fù)雜的光學(xué)結(jié)構(gòu)校正，然而傍軸近似已經(jīng)不適用于更大視場，這會帶來更明顯的場曲。通過學(xué)習(xí)“眼睛”結(jié)構(gòu)，構(gòu)造彎曲的焦平面來補消除因視場過大而造成的場曲畸變。Nikzad S［3-4］等人最先提出曲面探測思想并設(shè)計了最初的曲面探測器，設(shè)計弧形焦平面陣列的思想主要為兩個方面：一方面是減小探測器厚度使其符合曲度要求；另一方面是使用背照式照明和厚探測器平面結(jié)合。Heung Cho Ko 設(shè)計實現(xiàn)了基于可壓縮硅光電子器件的半球形電子眼探測器［5］。利用人眼結(jié)構(gòu)的啟發(fā)，其對光學(xué)系統(tǒng)的畸變矯正結(jié)果如圖2（b）所示。在此后的實際應(yīng)用中也驗證了曲面檢測方法的正確性，例如圖2（c）所示的空間監(jiān)視望遠鏡（Space Surveillance Telescope，STT）［6］，為3.5 m 的主鏡對應(yīng)設(shè)計了曲面交面陣列，為大孔徑成像系統(tǒng)提供了無畸變的清晰視野。然而曲面探測方法需要十分精密的制造工藝，與超大的透鏡組相結(jié)合，使得系統(tǒng)的整體成本上升。此外，龐大的同軸系統(tǒng)調(diào)整困難且系統(tǒng)復(fù)雜度的提升會導(dǎo)致其穩(wěn)定性不足。

圖2 曲面檢測技術(shù)實例。（a）高分辨大視場的光刻物鏡［2］；（b）半電子眼探測器的設(shè)計流程與實驗結(jié)果［5］；（c）SST 搭載的曲面探測器設(shè)計與實物［6］。Fig.2 Example of two types of freeform designs.（a）High-resolution wide-FOV photolithographic objective lens［2］；（b）Design solutions and experiment result of hemispherical electronic eye camera［5］；（c）SST array and it’s process［6］.

2.3 掃描拼接技術(shù)

傳統(tǒng)的顯微觀測需要進行手動調(diào)焦，并通過目鏡進行肉眼觀測，對于大視場觀測還需要手動移動切片，不僅耗時、耗力，還容易出現(xiàn)誤判和漏判，無法直觀地實現(xiàn)全切片區(qū)域亞細胞結(jié)構(gòu)的觀察，不利于病理學(xué)的相關(guān)研究以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的會診、診斷等。1986年Weinsten R S首次提出了“自動化顯微鏡”的概念［75］，開啟了數(shù)字病理學(xué)時代。數(shù)字病理切片掃描儀集光學(xué)、信息處理、計算機科學(xué)、自動控制學(xué)科為一體，通過自動聚焦技術(shù)［76-78］、掃描拼接技術(shù)等，利用集成化自動化設(shè)備代替了人的手眼操作，全自動大批量生產(chǎn)出高分辨率、全視場的數(shù)字化病理學(xué)切片［7-9］。此項技術(shù)現(xiàn)在被廣泛應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)中，為病理學(xué)分析、遠程會診等提供了很大幫助。數(shù)字病理學(xué)中最為常見的實現(xiàn)高通量的方法是利用數(shù)字病理切片掃描儀承載高倍率物鏡，對生物樣本進行掃描拼接，也就是先實現(xiàn)高分辨率，再獲得大視場。值得注意的是數(shù)字病理學(xué)中的高通量指的是單次自動實現(xiàn)更多的生物切片成像，本文提到的高通量是實現(xiàn)SBP 的提升。數(shù)字病理切片掃描儀主要包括顯微鏡、可移動載物臺和裝卸機構(gòu)。數(shù)字病理切片掃描技術(shù)（Whole side imaging，WSI）利用數(shù)字掃描儀對傳統(tǒng)的病理切片進行掃描，采集具有高分辨率的數(shù)字圖像，再通過計算機將得到的碎片化圖像進行無縫拼接整合。目前比較主流的掃描方式主要有“塊掃描”和“線掃描”方式［10］，其掃描圖示及成像結(jié)果如圖3（e）所示。

圖3 掃描拼接技術(shù)的掃描方式［10］與固有缺陷［80］Fig.3 Scanning method［10］ and intrinsic drawbacks［80］ of conventional digital pathologic scanners

WSI是病理學(xué)研究由人眼小視場讀片到數(shù)字化全視場讀片，由生物切片保存到數(shù)字化保存的里程碑。在醫(yī)院、生物研究實驗室等場景下的切片制備及保存實現(xiàn)了整片采集、高分辨率、數(shù)字化，有助于科研成果的分析與交流。通過在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域為常規(guī)以及疑難病例的病理資料可視化，實現(xiàn)遠程會診、協(xié)同治療以及病理資料的數(shù)字化保存。此外，掃描拼接技術(shù)的應(yīng)用實現(xiàn)了全自動高速、多切片的病理學(xué)切片成像。數(shù)字病理切片掃描技術(shù)通過在圖像采集端以及圖像合成端的系統(tǒng)優(yōu)化實現(xiàn)高通量顯微成像。3DHISTECH 公司研發(fā)的Pannoramic1000 數(shù)字病理切片分析儀可以搭載20×和40×物鏡，實現(xiàn)單次1 000 片的生物切片信息采集，是可以代表先進水平的WSI系統(tǒng)。

數(shù)字病理切片掃描技術(shù)雖然結(jié)合視場拼接與機械掃描技術(shù)實現(xiàn)了SBP 的飛躍，但是WSI 系統(tǒng)存在一些固有缺陷，如圖3（a～d）所示。視場拼接與機械掃描技術(shù)處理需要時間較長，使得成像的時空帶寬積（Space Time-Bandwidth Product，STBP，即單位時間內(nèi)的SBP）下降，可以理解為犧牲成像時間來換取成像SBP，這也使得這類技術(shù)無法實現(xiàn)快速成像，不利于活體生物細胞的定量觀測。系統(tǒng)搭載高倍率物鏡使得系統(tǒng)NA 受限，物鏡的工作距離過短，生物切片的厚度受限，僅適用于薄切片的觀測，如組織病理學(xué)和血液學(xué)成像等領(lǐng)域。由于機械移動部件不可避免地存在漂移問題，會導(dǎo)致成像重影、成像成功率和準(zhǔn)確率下降等問題。由于機械掃描和重聚焦［11-12］耗時嚴(yán)重，使系統(tǒng)中的成像器件大部分時間都處于空轉(zhuǎn)狀態(tài)，時間效率低。目前市場上的數(shù)字病理切片掃描設(shè)備售價在100 萬元以上，十分昂貴，且由于系統(tǒng)構(gòu)造復(fù)雜，后續(xù)的維護難度較大且對實驗室環(huán)境要求較高。

2.4 傅里葉疊層顯微成像技術(shù)

僅依靠硬件手段來提升系統(tǒng)SBP 勢必會造成成像效率的損失。在傳統(tǒng)幾何光學(xué)的基礎(chǔ)上，引入物理光學(xué)來拓展光場信息，結(jié)合數(shù)學(xué)與信號處理實現(xiàn)高維光場信息的解算，計算光學(xué)成像應(yīng)運而生。采用計算成像方法可以簡化成像流程，并去除成像系統(tǒng)中的掃描和拼接部分，同時還可實現(xiàn)高分辨率和大視場，能有效突破傳統(tǒng)顯微成像的瓶頸。利用信息處理技術(shù)，還可以深度挖掘光場信息，實現(xiàn)SBP 的提升。合成孔徑的思想最先被用在雷達上，可以被看做最早的計算成像技術(shù)之一，其工作原理與拍攝實例如圖4 所示。20 世紀(jì)50 年代，為了改變雷達體積較大的弊端，Wiley C 提出了合成孔徑雷達（Synthetic Aperture Radar，SAR）的概念。1957 年美國伊利諾伊大學(xué)及密歇根大學(xué)的研究人員首次公開了合成孔徑圖像［80-81］。合成孔徑雷達的主要思想是利用天線與目標(biāo)的相對運動，構(gòu)建一個等效虛擬的大孔徑天線，利用“多普勒頻移”記錄平臺不同位置處的回波信號，實現(xiàn)多個點擴散函數(shù)在頻域內(nèi)的合成，獲得方位向的高分辨率圖像。此外，通過對目標(biāo)回波進行脈沖壓縮，可獲得距離向的高精度信息。微波的特性可以穿云破霧，能在能見度極低的氣象條件下得到類似光學(xué)照相的高分辨率雷達圖像。

圖4 合成孔徑技術(shù)與傅里葉疊層顯微成像術(shù)。（a）SAR 的工作原理與拍攝圖像；（b）FPM 擴展時空帶寬積；（c）FPM 系統(tǒng)構(gòu)造與成像實驗；（d）FPM 圖像重構(gòu)流程圖［13］。Fig.4 SAR and FPM.（a）Working principle and real image of SAR；（b）Space-time bandwidth product extended by FPM；（c）System construction and imaging experiment of FPM；（d）Flow chart of FPM reconstruction［13］.

SAR 工作時，全復(fù)數(shù)域包括振幅和相位均可用能將時間分辨率精確到皮秒量級的天線直接測量，所以多個雷達回波信號具備直接相干融合的條件，其所對應(yīng)的合成孔徑的大小將比天線物理口徑大出許多個數(shù)量級，由此實現(xiàn)重建圖像等效分辨率的提升。在微波波段下，天線能夠以皮秒分辨率直接獲取復(fù)振幅信息實現(xiàn)高分辨率成像。但是由于光學(xué)波段具有非侵入式、無損傷的優(yōu)點，非常適合進行生物體、組織或細胞的動態(tài)成像，目前用于生物醫(yī)學(xué)的顯微鏡多為可見光波段。然而對于光學(xué)波段而言，其頻率高出微波多個量級，要想捕獲其相位信息，必須使用超過1 fs的探測器進行信號采集，現(xiàn)有的商業(yè)探測器，如以濱松公司2022 年推出的C15550-20UP［82］為例，其可以達到的讀出速度為120 幀/s，遠未達到捕獲相位的要求。2013 年，美國加州理工學(xué)院Yang 教授課題組提出將合成孔徑技術(shù)與相位恢復(fù)算法相結(jié)合的傅里葉疊層顯微成像術(shù)（Fourier ptychographic microscopy，F(xiàn)PM）［13-34］，使用2×/0.8 NA物鏡，實現(xiàn)最大合成NA 為0.5，可獲得分辨率為0.78 μm、視場大小為120 mm2的成像，同時實現(xiàn)無像差、無標(biāo)記、長景深、長工作距離、高通量、定量相位全彩色的成像，圖4（c）展示的是FPM 的系統(tǒng)構(gòu)成與成像結(jié)果，圖4（d）為FPM 的重建流程及頻譜的拓展。

與WSI 系統(tǒng)相比，F(xiàn)PM 將傳統(tǒng)顯微鏡中的聚光鏡用價格更加低廉的發(fā)光二極管陣列（LED）代替，LED 單元依次點亮實現(xiàn)合成孔徑，提高分辨率。由于光對生物樣本的散射特性，使得在高照明角度的光通過散射進入探測器，將高頻信息調(diào)制到物鏡的通頻帶內(nèi)，通過低頻信息的形式表現(xiàn)，提升分辨率。此外，與WSI 的機械掃描方式實現(xiàn)大視場相比，F(xiàn)PM 利用低倍物鏡在傅里葉域內(nèi)進行頻譜的搬移與拼接，同時實現(xiàn)高分辨率與大視場，從根本上解決了WSI系統(tǒng)存在的拼接偽影、重影等問題，保證了成像的正確率，同時在保證成像成功率的基礎(chǔ)上，大幅降低了系統(tǒng)的成本。

假設(shè)LED 的出射波為平面波，將薄生物樣本簡化為二維目標(biāo)，物函數(shù)為o(x，y)。其中，（x，y）代表二維平面的笛卡爾坐標(biāo)。點亮第m行、第n列的LEDm，n，其照明波矢為(kx，m，n，ky，m，n)。經(jīng)過物函數(shù)后，其透射光波場為隨后透射光波場進入相干光學(xué)成像系統(tǒng)，經(jīng)傅里葉變換后被系統(tǒng)CTF 低通，表達為{o(x，y)·P(kx，ky)，其中P(kx，ky)是系統(tǒng)的光瞳函數(shù)，可以看作是一個低通濾波器。經(jīng)低通濾波后的光波場又經(jīng)一次傅里葉逆變換到達成像平面，探測器采集到的低分辨率強度圖像表達式為：

其中：F 為傅里葉變換，F(xiàn)-1為逆傅里葉變換，O為物函數(shù)的傅里葉頻譜。FPM 的主要原理是解決一個非凸優(yōu)化問題，通過迭代縮小所猜測物函數(shù)對應(yīng)的低分辨率振幅與實際采集的低分辨率振幅的差異：

FPM 借助了相位恢復(fù)算法，在頻域中來回迭代時恢復(fù)相位信息，并使用合成孔徑中的傅里葉平移定理，將原先錯位的頻域信息移回正確的位置。LED 的高角度照明使得物函數(shù)中原本超過截止頻率的信息平移到通頻帶內(nèi)，通過低頻信息的形式表達，將這種錯誤表達的高頻信息移動到正確的位置，使得原本的通頻帶得到拓展。對于m×n的LED 陣列，相鄰LED 單元距離為d，則其照明NA 為：

其中：η為介質(zhì)中的折射率，θmax為LED 的最大入射角度，h為LED 與樣本之間的距離。系統(tǒng)的合成NA 為：

其中NAobj為物鏡NA。綜上，可以計算得到FPM可實現(xiàn)的理論分辨率為：

FPM 系統(tǒng)通常使用低倍率物鏡，也就是低NA物鏡，照明NA 通常會大于物鏡NA，從而分辨率可以遠超過兩倍的相干截止頻率。這一修改也被寫入Goodman 的《傅里葉光學(xué)導(dǎo)論》第四版［35］中。

FPM 是一種相干成像技術(shù)，無需引入?yún)⒖脊饧纯赏瓿上辔换謴?fù)，其原因與核心所在就是冗余的數(shù)據(jù)提供了“相對的參考光”。FPM 中的冗余數(shù)據(jù)主要來自于相鄰子頻譜的交疊，即交疊率。頻譜面的交疊率定義為相鄰兩CTF 的重疊面積與單孔徑面積之比，其計算方法為：

其中，St為照明NA 的增加步長。在FPM 中，合理的交疊率也是影響成像質(zhì)量的一個重要因素。在不存在欠采樣的條件下，F(xiàn)PM 的交疊率至少在30%以上時才能保證成像質(zhì)量［36］。在欠采樣情況下，則要相應(yīng)提高交疊率才能確保成像，如采樣率下降1/2，交疊率則要提升一倍。

通常一個技術(shù)可以分為3個發(fā)展階段，即“0-1”、“1-10”和“10-100”，如圖5所示，具體可見文獻［79］。技術(shù)的探索與產(chǎn)業(yè)化可以具象化為攜手并行的螺旋上升態(tài)勢，并不是技術(shù)發(fā)展到一定階段就止步不前，而是當(dāng)新的應(yīng)用需求產(chǎn)生時，隨之會帶來技術(shù)需求，刺激技術(shù)的不斷發(fā)展與優(yōu)化。

圖5 FPM 的發(fā)展歷程Fig.5 Roadmap on FPM

“0-1”指的是FPM 的誕生階段，突破了傳統(tǒng)顯微成像的通量極限，利用低倍物鏡與多角度照明實現(xiàn)大視場前提下頻域內(nèi)頻譜的拓展，得到高分辨率的大視場成像。

“1-10”為FPM 的探索階段，此階段可以細分為3 個方向：方向1：實現(xiàn)高精度、高穩(wěn)定性成像。影響成像精度的誤差來源主要有雜散光［37］、系統(tǒng)像差［38-40］、成像探測器動態(tài)范圍［13，41］、周期排列LED 引入的柵格噪聲［21-42］、LED 強度不均［15，44］、LED 位置未校準(zhǔn)［45-46］、相機噪聲［46-53］、漸暈效應(yīng)［54］、部分相干性［54-55］、多種混合誤差［56］、樣品運動誤差［57］等，它們會影響成像結(jié)果，帶來偽影。文獻［79］詳細介紹了各類誤差以及對應(yīng)的解決方案。方向2：探索與突破通量極限。由于傳統(tǒng)FPM 利用LED 陣列代替了聚光鏡，故在高角度照明時能量損失嚴(yán)重。Sun 等人提出了基于油浸物鏡和緊密LED 平板陣列的FPM 平臺（Resolution-enhanced Fourier ptychographic microscopy，REFPM）［58］，實現(xiàn)了基于10×/0.4 NA 物鏡，合成NA 為1.6，使用波長為435 nm 光源，F(xiàn)OV 為2.34 mm2，可以實現(xiàn)9 800 萬像素的SBP。在使用相同物鏡的條件下，REFPM 的SBP 較傳統(tǒng)非相干物鏡提升10 倍有余。然而，為了滿足采樣率要求，REFPM 系統(tǒng)只能使用最低為10 倍放大倍率的物鏡，這使得視場大小受限。Pan A［44］等人提出一種使用數(shù)字聚光鏡實現(xiàn)亞波長分辨率的FPM 平臺（Subwavelength resolution Fourier ptychography，SRFP），使用4×/0.1 NA 物鏡，實現(xiàn)合成NA 為1.05，使用波長為465 nm 的入射光束，視場為14.6 cm2，得到24 500 萬像素的SBP 值。該方法相比于傳統(tǒng)的平行平板LED，SBP 提升了兩倍以上。此外，F(xiàn)PM還可以應(yīng)用于X 光波段的納米尺度的顯微成像，以及基于相機掃描的遠距離遙感高分辨率成像。方向3：實現(xiàn)高效成像。實現(xiàn)高效成像的兩種思想包括減少圖像和單次曝光成像，以這兩種思想為基礎(chǔ)，涌現(xiàn)出大量算法實現(xiàn)了高效高分辨大視場顯微成像。Sun J 等人提出了一種基于可編程環(huán)形照明的高速FPM 技術(shù)（High-speed FPM technique based on programmable annular illuminations，AIFPM）［83］，單次重建僅使用4 個環(huán)形光照明，實現(xiàn)了4.11 億的STBP，在亞細胞水平和整個細胞群中觀察到快速的細胞動態(tài)。揭示了FPM 在體外活細胞的高速高通量成像方面的重要能力。

“10-100”指的是關(guān)注用戶體驗與FPM 的產(chǎn)業(yè)化推進階段。此階段的研究重點在于如何讓FPM 更加滿足市場需求，從而實現(xiàn)全彩色、批量化、自動化、智能化。實現(xiàn)并行化FPM 有助于提升細胞培養(yǎng)與分析的效率。Chan A 等人研發(fā)了基于并行FPM 的96 通道生物細胞培養(yǎng)成像篩選系統(tǒng)［33］，能夠在單次LED 陣列掃描時實現(xiàn)光源復(fù)用，實現(xiàn)90 s 內(nèi)96 通道并行的明場、無像差定量相位成像和30 s 內(nèi)雙色熒光成像的數(shù)據(jù)采集。深度學(xué)習(xí)與FPM 技術(shù)的有機結(jié)合可以突破FPM技術(shù)的瓶頸。Zhang J 等人提出了一個基于深度學(xué)習(xí)方法的FPM 重建框架［84］，并設(shè)計了一個用于FPM 重建的多尺度深度殘差神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Fourier ptychographic neural network，F(xiàn)PNN），實現(xiàn)了高精度、高穩(wěn)定性、強魯棒性的FPM 重建。實現(xiàn)彩色化成像可以為術(shù)中病理學(xué)等領(lǐng)域帶來極大的方便。本課題組基于FPM 成像技術(shù)，將光學(xué)自動聚焦技術(shù)、快速全彩色重構(gòu)技術(shù)、壓縮感知技術(shù)結(jié)合，并輔以機械臂自動移片和高效率照明，來提高傳統(tǒng)數(shù)字病理學(xué)的成像通量，同時利用深度學(xué)習(xí)實現(xiàn)病理圖像的自動分類及識別。目前本課題組已經(jīng)提出了成熟的快速全彩色重構(gòu)技術(shù)。Gao Y 等人受彩色匹配的啟發(fā)，提出基于彩色傳遞的FPM 彩色化（Color-transfer FPM，CFPM）［34］，將低分辨率全視場彩色圖像與高分辨率的FPM重構(gòu)圖像進行亮度直方圖匹配，將低分辨率全彩色圖像的顏色傳遞給高分辨率的FPM 重構(gòu)圖像，使染色后的高分辨率彩色FPM 圖像最大程度地接近低分辨率全彩色圖像，實現(xiàn)了較傳統(tǒng)FPM 彩色化方案兩倍的效率提升，并且消除了灰塵導(dǎo)致的相干偽影。在此基礎(chǔ)上，Chen J 等人利用局部二值模式和雙邊濾波組成代表空間相似度?；叶认嗨贫群吞卣飨嗨贫鹊娜厼V波函數(shù)取代CFPM 中的亮度直方圖匹配方案，提出彩色傳遞濾波FPM（color-transfer filtering FPM，CFFPM）［59］，其原理與實驗結(jié)果如圖6 所示，突破了CFPM 不適用于多染色劑染色樣本的局限，進一步提升了彩色傳遞的效率與精確度。多模態(tài)信號的獲取有利于更深入地探究細胞的內(nèi)在結(jié)構(gòu)。Song S 等人將FPM 與偏振成像系統(tǒng)相結(jié)合，實現(xiàn)了對透明物體的雙折射信息的成像（Polarization-sensitive Fourier ptychographic microscopy，PS-FPM）［85］。PS-FPM 無需引入系統(tǒng)的機械旋轉(zhuǎn)和位移，可以實現(xiàn)約1 250 萬像素的SBP。Zhang P 等人對傳統(tǒng)的FPM 系統(tǒng)進行優(yōu)化，利用鹵素?zé)糇鳛楣庠矗c濾波器相結(jié)合，捕獲不同波長的低分辨率圖像。此外，文章還提出了基于插值補償?shù)母吖庾V分辨率成像與相位恢復(fù)算法相結(jié)合的高分辨率大視場圖像恢復(fù)算法，實現(xiàn)了5 nm 的光譜分辨率［86］。

圖6 CFFPM 的原理與實驗結(jié)果。（a）顏色匹配與彩色傳遞［34］；（b）FPM 與CFFPM 的成像系統(tǒng)［34］；（c）FPM 與CFFPM的顏色空間［34］；（d）CFFPM 的流程圖與成像實驗［59］。Fig.6 Principle and experimental results of CFFPM.（a）Match color and color transfer［34］；（b）Imaging system of CFPM and FPM［34］；（c）Color space of CFPM and CFFPM［34］；（d）Schematic diagram of CFFPM method and it’s imaging results［59］.

2.5 寬場結(jié)構(gòu)光照明技術(shù)

阿貝衍射極限限制了系統(tǒng)的極限分辨率，導(dǎo)致物函數(shù)中超過光學(xué)系統(tǒng)截止頻率的信息會被去除，這其中就包含高分辨率的高頻信號，致使傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡分辨率受限。通過解算圖像的高頻信息可以實現(xiàn)圖像細節(jié)信息的恢復(fù)，從而在固定的物鏡NA 下實現(xiàn)更高的分辨率。Gustafsson［60］于2000 年提出了結(jié)構(gòu)光照明技術(shù)（Structured Illumination Microscopy，SIM），如圖7（a1～a4）所示，實現(xiàn)了較普通寬場顯微鏡兩倍的橫向分辨率提升。SIM 的主要思想是通過結(jié)構(gòu)化照明，將待測物體的高頻信號以混頻形式進入到顯微系統(tǒng)的通頻帶內(nèi)，突破阿貝衍射極限。SIM 主要利用莫爾效應(yīng)，在光路中添加結(jié)構(gòu)光發(fā)生裝置（如空間光調(diào)制器（Spatial Light Modulator，SLM）、光柵等）對入射光波進行移項調(diào)制，產(chǎn)生調(diào)制光，經(jīng)物鏡投影在被測物體上，由探測器接收熒光信號，該信號包含了結(jié)構(gòu)光信號與樣本的熒光信號的卷積，形成莫爾條紋，最后通過解算可以得到高分辨率的樣本信息，其圖解見圖7（b1～b3）。SIM 中可以使用點陣、條紋甚至是完全隨機圖案的照明光場。SIM 具有時間優(yōu)越性，可以實現(xiàn)高速成像，適用于活細胞探測。

圖7 SIM 與SSIM。（a1～a4）SIM 的頻譜重構(gòu)過程［60］；（b1～b3）利用莫爾效應(yīng)實現(xiàn)分辨率提升［61］；（c1～c5）非線性結(jié)構(gòu)光照明提高分辨率的原理［61］；（d）生物體細胞的SIM 成像［63］；（e）生物體細胞的SSIM 成像［63］。Fig.7 SIM and SSIM.（a1～a4）Concept of resolution enhancement by SIM［60］；（b1～b3）Resolution extension through the Moir effect［61］；（c1～c5）Resolution extension by nonlinear structured illumination［61］；（d）SIM imaging of organism cells［63］；（e）SSIM imaging of organism cells［63］.

與相干成像系統(tǒng)不同，非相干系統(tǒng)的截止頻率f0由系統(tǒng)的光學(xué)傳遞函數(shù)（Optical transfer function，OTF）決定，指的是能夠傳遞的強度呈余弦變化的最高頻率f0=2 NA/λ。當(dāng)系統(tǒng)的光瞳函數(shù)為圓時，OTF 是以原點為圓心，f0為半徑的圓。假設(shè)結(jié)構(gòu)光頻率為f1，對于樣本的每個頻率f，在頻率f-f1處產(chǎn)生莫爾條紋。當(dāng)|f-f1|＜f0時，探測器可以觀測到莫爾條紋，也可以理解為此時的OTF 以f1為圓心，f0為半徑，通過相移可以反解出此部分的信息，此時系統(tǒng)的截止頻率為f1+f0。所以要想更大限度地提升系統(tǒng)的截止頻率就要增大f1，但是由于結(jié)構(gòu)照明光與探測熒光都會受系統(tǒng)衍射極限的影響，f1最大不超過f0，也就是說，線性SIM 的分辨率較傳統(tǒng)寬場顯微鏡的最高可提升2 倍。要想在線性結(jié)構(gòu)光照明條件下進一步提升系統(tǒng)分辨率，一方面可以更換大NA 物鏡，但是這會導(dǎo)致視場減小，綜合SBP 并不會有較大提升；另一方面可以使用兩個相同的高NA 物鏡，SBP 會提升4 倍。在激發(fā)光微弱的情況下，熒光強度和激發(fā)光強度為線性關(guān)系，此時為線性SIM，如果可以改變這種線性關(guān)系，即可獲得更高的頻域信息?；诖?，Gustafsson 等人提出基于非線性結(jié)構(gòu)照明的飽和結(jié)構(gòu)照明顯微鏡（Saturated structured-illumination microscopy，SSIM）［61］，其原理見圖7（c1～c5），實現(xiàn)了低于50 nm 的橫向分辨率。當(dāng)激發(fā)光的強度不斷增強時，熒光強度和激發(fā)光的強度原本的線性關(guān)系被破壞。當(dāng)激發(fā)光強度達到一定程度時，熒光強度達到飽和狀態(tài)，此時其頻域內(nèi)的強度分布函數(shù)可以展開為一系列的非線性項，可以突破線性SIM 的分辨率瓶頸。理論上這種方法只要不斷提升激發(fā)光強度，就可以實現(xiàn)無限分辨率的提升。但是由此而產(chǎn)生的光漂白和光損傷會對細胞產(chǎn)生不可逆?zhèn)?，這與SIM 成像速度快、適用于活細胞成像的優(yōu)勢相悖。且此時高頻信息易受噪聲影響，從而會使得偽影嚴(yán)重。Hirvoven 等人提出了基于光開關(guān)熒光蛋白實現(xiàn)非線性結(jié)構(gòu)光的理論［62］。Rego 等人驗證了該理論［63］，他們在激發(fā)光強降低6 個數(shù)量級的情況下實現(xiàn)了熒光激發(fā)并獲得了50 nm 的橫向分辨率。

2.6 無透鏡片上顯微成像技術(shù)

傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡系統(tǒng)的組成大體相同，都是由光源、物鏡、筒鏡、探測器構(gòu)成（根據(jù)應(yīng)用場景的不同，會增加其他光學(xué)元件，如偏振片、濾光片、光柵、高精密機械掃描設(shè)備等），這使得顯微鏡的構(gòu)造十分笨重，與易便攜、輕量化、低成本的應(yīng)用需求相悖。為了解決傳統(tǒng)顯微鏡的應(yīng)用弊端，無透鏡片上顯微成像技術(shù)應(yīng)運而生。無透鏡系統(tǒng)摒棄了傳統(tǒng)顯微鏡的透鏡，利用探測器直接采集緊貼其放置的物體的衍射圖像。將無透鏡片上顯微技術(shù)、最先進的光電傳感器芯片和像素超分辨率技術(shù)相結(jié)合，可以實現(xiàn)在單位放大倍率下，大于10 億像素的SBP 輸出。根據(jù)成像原理，可以簡單地將無透鏡技術(shù)分為3 大類：無需圖像重構(gòu)算法的投影式成像［87-88］、基于數(shù)字重聚焦的無透鏡成像以及基于解析延拓的無透鏡成像。

2.6.1 投影式無透鏡成像技術(shù)

投影式無透鏡成像技術(shù)無需任何圖像恢復(fù)算法，為了盡量消除衍射對成像質(zhì)量的影響，通常會將傳感器的窗口玻璃去除，以盡可能地減小待測物體與探測器之間的距離［87］。為了提升投影式無透鏡成像的分辨率，通常使用的方法是在樣本與探測器之間放置亞納米級別的小孔陣列，構(gòu)成光流體顯微鏡（Optofluidic microscope，OFM），如圖8 所示。兩相鄰的小孔之間的距離為探測器的一個像元尺寸的大小，當(dāng)待測樣本與小孔陣列發(fā)生相對位移時，可以看作是對待測樣本進行線掃描。在待觀測細胞不會發(fā)生形變的基礎(chǔ)上，投影式無透鏡顯微成像一般使用的掃描方式是制造傾斜微流通道使待測樣本形成微流［64］，實現(xiàn)小孔陣列與物的相對移動。Ozcan 等人［65-66］利用微流式片上無透鏡顯微技術(shù)成功實現(xiàn)了對生物細胞的檢測。

2.6.2 數(shù)字重聚焦無透鏡成像技術(shù)

基于數(shù)字全息的無透鏡成像技術(shù)主要是在相干照明下，利用數(shù)字重聚焦，通過對干涉條紋進行分析與計算，獲得待測樣本的復(fù)振幅信息，即使用采集到的強度信息來恢復(fù)二維待測物的散射光波場的強度和相位信息。整個成像過程可以簡化為：

其中：U(x，y)為重構(gòu)得到的待測物體的復(fù)振幅信息，UI(x，y)為探測器采集到的復(fù)振幅信息，H(x，y)為角譜傳遞函數(shù)，(x，y)為二維樣本的笛卡爾坐標(biāo)?；跀?shù)字全息的無透鏡成像技術(shù)主要聚焦于兩方面，即實現(xiàn)相位信息的恢復(fù)與實現(xiàn)分辨率的進一步提升。本文僅討論分辨率提升方面。

傳統(tǒng)的實現(xiàn)分辨提升的方法與投影的無透鏡成像實現(xiàn)高分辨率的思路大致相同，即通過樣本與探測器的相對亞像素位移實現(xiàn)超分辨。提升思路一為：橫向移動探測器或者是樣本。但是現(xiàn)有的成像探測器像元大小一般在微米量級，要想實現(xiàn)探測器或亞像素級的位移，必須搭載高精密的機械移動元件，其實現(xiàn)難度大且設(shè)備成本高。思路二為：橫向移動光源位置［67］。如圖9（a）所示，光源的移動距離與對應(yīng)到相機與物的相對移動距離之比，可以利用光源與待測物體的距離a1和物體與探測器距離a2之比計算得出。由于物體緊靠探測器表面，所以要實現(xiàn)物與探測器的小范圍相對移動，則要使光源進行長距離移動，這對于機械位移平臺的精度要求大幅減小。除了橫向?qū)崿F(xiàn)物與探測器的相對位移外，Greenbaum A 等人提出了多高度無透鏡成像［68］。該方法結(jié)合迭代相位恢復(fù)算法和像素超分辨技術(shù)，在每一個高度下，按圖9（b）所示的掃描方式，生成多幅低分辨率（LR）無透鏡全息圖像，再利用像素超分辨成像技術(shù)生成該高度條件下的超分辨全息圖像。M次調(diào)整高度就可以得到M張超分辨全息圖像，但是這些圖像可能會存在空間差異，故增加數(shù)字配準(zhǔn)步驟，之后采取多高度的迭代相位恢復(fù)算法重建高密度樣本的復(fù)振幅信息。然而，上述方法都需要對系統(tǒng)元件進行機械位移來實現(xiàn)高分辨率。機械移動裝置由于其器件參數(shù)漂移等原因，會給成像系統(tǒng)帶來額外的誤差。為了消除這些位移或者旋轉(zhuǎn)帶來的誤差，就需要在圖像恢復(fù)前增加校準(zhǔn)算法，這也使得整體的計算復(fù)雜度增加。Bishara W 等人引入光纖器件代替機械位移平臺［69］，如圖9（c）所示。利用多個光纖與發(fā)光二極管對接耦合，由低成本的微控制器控制，依次照亮樣品，再由探測器捕獲其全息圖，經(jīng)像素超分辨算法處理，最終獲得高分辨率的全息圖像。但這種方法會使成像系統(tǒng)的成本提高，且精確的光纖裝配也為系統(tǒng)的裝調(diào)帶來壓力。與增加系統(tǒng)元件相比，Luo W 等人提出了基于合成孔徑的無透鏡成像技術(shù)（Lensfree imaging using synthetic aperture，LISA）［70］，進一步簡化了成像系統(tǒng)。該技術(shù)將合成孔徑的思想帶入到數(shù)字全息無透鏡顯微技術(shù)中，使用部分相干光對樣本進行多角度的照射，如圖9（d）所示。通過掃描穹頂表面的照明角度，將重建無透鏡圖像的有效NA 提高到1.4，在單位放大倍率下，在700 nm波長下實現(xiàn)250 nm 分辨率。

圖9 可實現(xiàn)相位恢復(fù)的無透鏡超分辨成像。（a）橫向移動光源實現(xiàn)高分辨率片上無透鏡成像的系統(tǒng)構(gòu)成與成像實驗［67］；（b）多高度像素超分辨率無透鏡片上成像裝置及巴氏實驗的無透鏡相位成像［68］；（c）基于光纖陣列的無透鏡片上顯微鏡結(jié)構(gòu)圖及感染瘧疾寄生蟲的紅細胞成像［69］；（d）LISA 的系統(tǒng)構(gòu)成和乳腺癌組織的無透鏡彩色成像［70］；（e）基于波長掃描的超分辨成像系統(tǒng)構(gòu)成及Pap 成像實驗結(jié)果［71］。Fig.9 Lensless super-resolution imaging with phase recovery.（a）System composition and imaging experiment of highresolution on-chip lensless imaging by laterally moving light source［67］；（b）Schematic diagram of the multi-height pixel super-resolution based lensfree on-chip imaging set-up and phase image of a Pap test［68］；（c）Structure of lensless on-chip microscopy using a fiber-optic array and imaging of red blood cells infected with malaria parasites［69］；（d）Structure of LISA and imaging of breast cancer tissue［70］；（e）Optical setup of wavelength-scanning pixel-super resolution and Lens-free imaging of a Papanicolaou（Pap）smear［71］.

Luo W 等提出基于波長掃描的像素超分辨成像方法［71］，對光源在窄譜帶上進行波長調(diào)制和無透鏡高分辨率圖像重建，并與合成孔徑成像方法相結(jié)合，獲得待測物體的高分辨復(fù)振幅信息，其系統(tǒng)構(gòu)成如圖9（e）所示。該方法利用中心波長范圍為10～30 nm 的可調(diào)光源，采集多幅低分辨率圖像，利用迭代算法與合成孔徑相結(jié)合，實現(xiàn)420 mm2視場大小的250 nm 分辨率。但是美中不足的是這種方法需要進行波長標(biāo)定和色散補償處理。

2.6.3 解析延拓?zé)o透鏡成像技術(shù)

傳統(tǒng)的無透鏡疊層成像主要利用物體相對于探針的移動獲得遠場的衍射數(shù)據(jù)，在實際空間中進行拼接，實現(xiàn)視場的拓展。而FPM 則是利用頻域空間內(nèi)的掃描來實現(xiàn)頻譜的拓展。Song P等人將上述兩種方法結(jié)合，提出了基于合成孔徑疊層成像的片上無透鏡成像（Synthetic aperture ptychography，SAP）［72］。如圖10 所示，首先使用一擴展的平面波照射樣本，再利用放置在樣本后的可移動編碼傳感器采集衍射圖像，圖像傳感器表面的編碼掩膜對來自樣本的衍射光進行調(diào)制，其作用等效于傳統(tǒng)疊層成像的探針光束。與傳統(tǒng)的疊層成像相比，SAP 無交疊率需求，在衍射屏上同時實現(xiàn)高分辨率和大視場，將疊層成像的“薄樣本”限制轉(zhuǎn)而成為“薄編碼掩膜”的要求，實現(xiàn)厚物體成像，突破了傳統(tǒng)疊層成像的應(yīng)用局限。編碼傳感器的移動距離決定了SAP 的分辨率極限。

2.7 五種高通量顯微成像技術(shù)的比較

本文分別從成像原理、系統(tǒng)構(gòu)成以及發(fā)展概況深入介紹了5 種二維高通量顯微成像技術(shù)，這些成像方法在不同的應(yīng)用場景下各有千秋，表1 列舉了這些技術(shù)的優(yōu)勢與不足以及它們各自的應(yīng)用場景。從增加FOV 角度出發(fā)，制造大孔徑物鏡與曲面探測技術(shù)可以實現(xiàn)單次曝光成像，然而單純地從機械加工角度拓寬視場會使整體系統(tǒng)體積過大，調(diào)軸、調(diào)焦困難，且隨之而來的離軸像差、色差問題都不可避免，這一切加大了整體系統(tǒng)的制造難度。成本過高也使得此項技術(shù)僅適用在光刻機等空間大、設(shè)備固定的場景。全劃片數(shù)字病理分析技術(shù)以操作簡便且能實現(xiàn)切片的數(shù)字采集被廣泛應(yīng)用，然而，這項技術(shù)存在耗時、穩(wěn)定性差等不足。隨著光源、高性能探測器、處理系統(tǒng)、系統(tǒng)元件加工等技術(shù)的快速發(fā)展，以及計算成像技術(shù)的出現(xiàn)，都為高通量顯微技術(shù)注入了新的活力。計算成像技術(shù)另辟蹊徑，融合了信息光學(xué)、信號處理等多學(xué)科理論，突破了傳統(tǒng)光學(xué)成像“所見即所得”的成像模式，是一門正在興起且有廣泛前景的交叉學(xué)科。計算光學(xué)成像技術(shù)在對信息的獲取、信息的挖掘、信息量的擴展等方面展現(xiàn)出了強大的優(yōu)越性，是實現(xiàn)高通量顯微成像技術(shù)性能飛躍的主要力量。傅里葉疊層顯微成像術(shù)利用低倍物鏡視場大的優(yōu)勢，結(jié)合迭代算法實現(xiàn)高分辨率，其系統(tǒng)成本低，利用相位恢復(fù)算法可以實現(xiàn)無標(biāo)記的定量相位成像。但是該技術(shù)目前主要采用GPU 進行全視場分塊并行恢復(fù)后合成大視場圖像，成像速度受限，且迭代算法對噪聲敏感度高，數(shù)據(jù)預(yù)處理成為必經(jīng)之路。寬場結(jié)構(gòu)光照明技術(shù)的時間分辨率高，適用于活細胞檢測場景。該技術(shù)不需要使用特殊的熒光探針，降低了拍攝過程中熒光蛋白/分子的漂白，以及光毒性對活細胞的傷害。SIM 在線性結(jié)構(gòu)光照明條件下僅能實現(xiàn)兩倍分辨率的提升，然而飽和熒光激發(fā)態(tài)獲得超過兩倍的分辨率提升的同時也會使光漂白、光中毒等現(xiàn)象對細胞造成破壞。無透鏡片上顯微成像技術(shù)進一步簡化了成像系統(tǒng)，使整體系統(tǒng)體積減小，節(jié)約了制造成本，然而與FPM 的分塊處理相同，無透鏡技術(shù)的全視場成像速度同樣受限。

表1 5 種技術(shù)的比較Tab.1 Comparison of five technologies

3 結(jié) 論

本文對5 種具有代表性的拓展SBP 的技術(shù)進行了詳細介紹與分析，剖析了各類方法的優(yōu)勢與不足。通過對5 類技術(shù)的分析與比較不難發(fā)現(xiàn)，計算成像技術(shù)的出現(xiàn)解決了很多依靠硬件無法解決的問題，為高通量顯微成像帶來了很多新的思想與獨特的方法，2023 年阿里達摩院把它列入十大科技趨勢。計算光學(xué)成像處于高速發(fā)展階段，已取得許多令人振奮的研究成果，但是計算成像同時也面臨著眾多挑戰(zhàn)：

（1）計算成像技術(shù)的底層理論并不十分完善，其計算效率有待進一步提升。

（2）計算成像技術(shù)需要使用到樣本的暗場信息，這使得信噪比下降，然而暗場的引入對成像信噪比的影響程度并未從理論層面進行解釋。

（3）多模態(tài)成像深度挖掘光場信息，輔助實現(xiàn)高分辨率成像，如純相位物體從強度信息上無法對其形態(tài)進行獲取，而定量相位成像技術(shù)則可以從相位角度對樣本進行分析。將多模態(tài)信息的獲取能力作為衡量成像技術(shù)性能的指標(biāo)，將SBP的指標(biāo)由二維拓展到多維。

（4）計算成像在“所見即所得”的成像模式上加入了復(fù)雜的計算流程。在當(dāng)前發(fā)展階段，“計算”的加入會帶來對成像結(jié)果的懷疑，這就如同目前醫(yī)學(xué)診斷金標(biāo)準(zhǔn)的計算機掃描斷層技術(shù)（Computed Tomography，CT）在其誕生時同樣背負著質(zhì)疑與詬病。但是隨著技術(shù)的進步，計算成像的成像結(jié)果也定會成為其應(yīng)用行業(yè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

（5）計算成像的算力需求大，需要性能更加優(yōu)越的芯片與不斷優(yōu)化的信息壓縮技術(shù)才能助力其發(fā)展。

（6）計算成像技術(shù)與人工智能技術(shù)相結(jié)合滿足不同的智能化需求也是未來的重要發(fā)展趨勢。就醫(yī)學(xué)診斷來講，人工智能（Artificial intelligence，AI）輔助診斷可以大幅節(jié)約人力資源，實現(xiàn)國民醫(yī)療覆蓋率的飛躍。計算成像獲得的高質(zhì)量成像結(jié)果，可以為AI 提供大量準(zhǔn)確率高的樣本信息，滿足訓(xùn)練集的樣本需求，確保診斷的準(zhǔn)確率。