周進國，白麗梅

（1.邯鄲市第一醫(yī)院麻醉科，河北 邯鄲 056000；2.邯鄲市第一醫(yī)院東區(qū)急診內(nèi)科，河北 邯鄲 056000）

丙泊酚具備促使神經(jīng)元無序凋亡、抑制增殖等神經(jīng)毒性，過量使用可引起海馬組織損傷，并誘發(fā)認知功能障礙[1]。神經(jīng)炎癥、缺血再灌注損傷、氧自由基超載和TNF- /NF- B炎性因子異常激活等導(dǎo)致的神經(jīng)細胞凋亡被公認為海馬損傷病理過程的關(guān)鍵調(diào)控機制[2]，因此抑制缺血再灌注損傷及阻滯TNF- /NF- B 炎性因子表達成為治療及預(yù)防丙泊酚麻醉損傷導(dǎo)致神經(jīng)元受損保護的思路之一。

澤蘭植物為唇形科地筍屬植物毛葉地瓜兒苗（Lycopus lucidus Turcz.var. hirtus Regel）及地瓜兒苗（Lycopus lucidus Turcz.）莖上植物部分，毛葉地瓜兒苗的莖、苗、花和葉部分被收錄于2010 年版《中國藥典》（一部），被廣泛用于活血調(diào)經(jīng)，祛瘀消癰，利水消腫等方面；現(xiàn)代藥理藥學(xué)認為其具備抗凝血、活血化瘀、增加膽汁含量、熊去氧膽酸量、清除二苯代苦味酰肼和超氧陰離子自由基能力、兼具還原Fe3+能力及抑制脂質(zhì)過氧化能力[3]。

研究表明，澤蘭提取物具備調(diào)控PI3K/Akt 信號通路，下調(diào)HIF-1a 基因表達及其下游蛋白表達[4]，有效緩解急性缺氧導(dǎo)致的局灶性腦組織缺血損傷[5]，澤蘭素可能在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用，然而在丙泊酚麻醉損傷后腦神經(jīng)保護與TNF- /NF- B 通路間的調(diào)節(jié)關(guān)系尚未被完全闡釋。因此，該研究擬建立丙泊酚麻醉誘導(dǎo)的小鼠海馬組織損傷模型，解析澤蘭素對丙泊酚誘導(dǎo)的C57 小鼠海馬神經(jīng)細胞損傷及TNF- /NF- B 信號通路的關(guān)聯(lián)機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物準(zhǔn)備

SPF 級健康C57 小鼠，體質(zhì)量35.0~70.0 g，購自北京維通利華試驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SYXK（京）2021-006。喂養(yǎng)環(huán)境：溫度22.0~25.0 ℃，濕度45.0%~60.0%，光照12 h/陰暗12 h 循環(huán)。

1.2 試驗耗材及儀器

澤蘭素水提物532-48-9（CAS：YT70340，濃度為10.0%）購自北京伊塔生物科技有限公司；3-N-丁苯酞6066-49-5（貨號：ESSMB00312, CAS：6066-49-5，規(guī)格：100mg）購自香港吉斯恩貝國際貿(mào)易有限公司；Mouse TNF- ELISA Kit [小鼠腫瘤壞死因子（TNF- ）ELISA 試劑盒（貨號：70-EK282/3）]購自聯(lián)科生物；小鼠核因子B 亞基p65（NF- B p65）ELISA 試劑盒（批號：EK-R37440）購自上海酶研生物科技有限公司；BDNF ELISA 試劑盒（批號：l110740）購自上海貝諾生物科技有限公司。

奧盛Feyond-A300 多功能酶聯(lián)免疫分析儀（杭州奧盛）；Chemi-Doc XRS 型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Chemi Doc XRS+，BIO-RAD）。

1.3 試驗方法

C57 成年小鼠60 只隨機數(shù)法隨機分組，丁苯酞陽性藥物對照組（Dl-3-N-Butylphthalide，丁苯酞組，n=40）、澤蘭素給藥組（澤蘭素組，n=40）和海馬損傷模型組（模型組，n=40），通過50 mg/kg丙泊酚腹腔旋轉(zhuǎn)注射方式誘導(dǎo)C57 成年小鼠海馬組織腦損傷模型，依據(jù)已發(fā)表文獻[4]的造模成功標(biāo)準(zhǔn)，試驗鼠全部成功制備丙泊酚誘導(dǎo)海馬損傷模型。另選取同批次小鼠作為空白對照組（空白組，n=40）。丁苯酞組、澤蘭素組、模型組和空白組以腹腔旋轉(zhuǎn)注射方式分別給予2 mg/kg丁苯酞、1.24 mL/kg 自備澤蘭素混懸液1 mL、0.9%生理鹽水1 mL和0.9%生理鹽水1 mL，1 次/d，持續(xù)28 d。第29 天采用頸動脈脫臼法處死全部試驗小鼠，剝離雙側(cè)腦實質(zhì)組織，參照Shi 的方法[6]，ELISA 方法檢測干預(yù)前及試驗開始第28 天測定腦實質(zhì)的TNF- /NF- B、BDNF 表達。

HE 染色，取試驗鼠雙側(cè)腦實質(zhì)組織于10.0%福爾馬林液體中行酒精脫水、石蠟包埋，冠狀切面取片，選擇典型海馬組織切片行脫蠟、水化及Nissl 染色液浸染30 min 后漂洗，100%pH=7.030 中性樹膠后封閉10 min 后行纖維切片。

各組小鼠干預(yù)前、試驗開始第28 天分別行水迷宮試驗、神經(jīng)功能評分和糖水偏好試驗。水迷宮試驗，設(shè)置室內(nèi)平均噪聲數(shù)低于25 分貝，隨機選取4 處不同象限等間隔池壁入水點，各組小鼠分別獨立依次從入水點放置，記錄3 min內(nèi)平臺尋找時間、靜置平臺穿越頻次，訓(xùn)練4 d，每天2 次，限定時間為2 min，訓(xùn)練間隔10min，記錄逃避潛伏時長、對側(cè)象限停留時間（s）和穿越初始平臺頻次。神經(jīng)功能評分：依據(jù)Masso Shmiizu-Sasamata評價方法，在干預(yù)前、試驗開始第28天兩個時間節(jié)點依據(jù)動物神經(jīng)行為記錄神經(jīng)損傷嚴(yán)重缺損評分。糖水偏好試驗：在規(guī)定時間節(jié)點內(nèi)對試驗小鼠進行糖水偏好試驗，分別給予每只試驗小鼠1 瓶無菌蒸餾水和1 瓶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%蔗糖溶液，24 h 后分別計算無菌蒸餾水及蔗糖溶液減少質(zhì)量，統(tǒng)計小鼠糖水偏好指標(biāo)。糖水偏好指標(biāo)= 蔗糖水減少量/（蔗糖水減少量+無菌蒸餾水減少量） 100%。

1.4 觀察指標(biāo)

Nissl染色法檢測大鼠海馬組織神經(jīng)元損傷程度；神經(jīng)功能評分、Morris 水迷宮試驗和糖水偏好試驗3種試驗方式檢測干預(yù)前后神經(jīng) 行為變化；ELISA 方法比較TNF- /NF- B、BNDF 水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方案

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t 檢驗，雙尾檢驗，以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色檢測小鼠海馬組織神經(jīng)元損傷

澤蘭素組、丁苯酞組和空白組大鼠神經(jīng)元結(jié)構(gòu)相對完整，邊緣界限明確清晰，神經(jīng)元突觸圓潤飽滿，細胞核位于中央；模型組損傷處神經(jīng)元皺起，邊緣界限不清，組織紋理及結(jié)構(gòu)紊亂，見圖1。

圖1 海馬組織切片形態(tài)圖（HE 染色，200 ）Fig.1 Morphological map of hippocampal tissue sections (HE staining,200 )

圖2 各組糖水偏好試驗指數(shù)變化百分比Fig.2 Percentage change in sugar preference test index by group

2.2 各組干預(yù)前后水迷宮試驗指標(biāo)變化

Morris水迷宮結(jié)果提示：與空白組比較，模型組單位逃避時間、對側(cè)象限停留時間顯著延長（P＜0.05）；澤蘭素組、丁苯酞組單位逃避時間、對側(cè)象限停留時間顯著縮短（P ＜0.05）。模型組穿越初始平臺頻次顯著減少，澤蘭素組、丁苯酞組顯著增加（P ＜0.05）。與模型組比較，澤蘭素組、丁苯酞組單位逃避時間、對側(cè)象限停留時間顯著縮短、穿越初始平臺頻次明顯增加（P＜0.05），見表1。

表1 各組干預(yù)前后水迷宮試驗指標(biāo)變化（n=40）Table 1 Changes in water maze experimental indicators before and after intervention in each group

2.3 各組干預(yù)前后模型組神經(jīng)功能評分變化

與試驗前相比，試驗后澤蘭素組、丁苯酞組神經(jīng)功能缺損程度評分明顯下降（P ＜0.05）；模型組評分比較則無明顯差異（P ＞0.05）。試驗后Masao Shmiizu-Sasamata 神經(jīng)功能評分比較中發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，澤蘭素組、丁苯酞組評分下降，差異顯著（P ＜0.05），見表2。

表2 各組神經(jīng)功能評分干預(yù)前后的變化（n=40）Table 2 Changes of neurological function scores in each group before and after intervention

2.4 各組干預(yù)前后糖水偏好試驗評價

與模型組相比，澤蘭素組、丁苯酞組糖水偏好試驗指數(shù)明顯上升，差異（P＜0.05）。與陽性藥物丁苯酞組相比，澤蘭素組糖水偏好試驗指數(shù)略顯降低，但差異不顯著（P ＞0.05）。

2.5 ELISA檢驗TNF- /NF- B、BNDF水平

表3 結(jié)果顯示，與空白組相比，澤蘭素組、丁苯酞組NF- B、BNDF 明顯上升，TNF- 明顯下降，差異極顯著（P ＜0.01）；與模型組相比，澤蘭素組、丁苯酞組NF- B、BNDF明顯上升，TNF- 明顯下降，差異顯著（P＜0.05）。

表3 ELISA 檢驗TNF- ，NF- B 和BNDF 的表達水平（n=40）Table 3 Detection of expression level of TNF- ,NF- B and BNDF by ELISA

3 討論

過量丙泊酚可過度激活海馬CA1 區(qū)谷氨酸受體導(dǎo)致調(diào)控功能障礙[7,8]，可導(dǎo)致空間認知功能障礙及可逆性記憶減退。澤蘭水提取物能減輕神經(jīng)元細胞氧化應(yīng)激、自由基超載和抑制炎癥因子表達，減少神經(jīng)元缺血再灌注損傷等作用，其分子機制之一為促進PI3K/Akt Pathway 及其下游HIF-1a 從而發(fā)揮拮抗ROS 等因子表達[9-11]，因此，澤蘭素理論上具備延緩丙泊酚海馬CA1 區(qū)受體損傷的作用，然而機制尚未探明。研究表明，NF- B 作為Rel 蛋白家族內(nèi)多向性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，是TLR4/MyD88信號通路調(diào)控節(jié)點，可發(fā)揮轉(zhuǎn)錄IL-1 、IL-8 和TNF- 調(diào)控，激活炎癥因子表達，并抑制神經(jīng)元細胞炎癥凋亡[12-14]；TNF- 可降低海馬神經(jīng)元突觸間傳遞效率[15]，增強TNF- 受體疼痛遺忘效應(yīng)并降低突觸可塑性[16]；BDNF 可作為腦神經(jīng)元神經(jīng)保護的功能性指標(biāo)之一，具備維持神經(jīng)元突觸塑造、調(diào)控分化及神經(jīng)電生理損傷后再修復(fù)等功能，反應(yīng)海馬組織丙泊酚類化學(xué)藥物損傷再修復(fù)程度[17-20]。

海馬麻醉損傷往往導(dǎo)致快感喪失，經(jīng)典糖水偏好試驗常用作衡量海馬受損抑郁狀態(tài)程度的重要指標(biāo)之一。本研究通過對海馬損傷模型小鼠進行丙泊酚麻醉處理方式建立海馬麻醉損傷模型，使用陽性對照藥物丁苯酞、澤蘭素對模型鼠進行試驗。Morris水迷宮檢測結(jié)果顯示，澤蘭素組單位逃避時間、對側(cè)象限停留時間顯著縮短和穿越初始平臺頻次明顯增加，這表明澤蘭素提高了空間記憶鞏固能力及記憶提取的精確性。糖水偏好試驗則證實，澤蘭素可有效增強對抗抑郁行為，緩解海馬損傷大鼠認知功能的受損。

澤蘭素可使腦海馬組織內(nèi)TNF- 、BNDF 表達升高，NF- B 表達降低，此項結(jié)果表明，澤蘭素在增強突觸傳遞效率、腦神經(jīng)保護及TNF 受體調(diào)控突觸可塑性方面具備一定效應(yīng)，驗證了澤蘭素對丙泊酚藥物麻醉損傷海馬功能的保護作用。

澤蘭素可顯著上調(diào)NF- B、BNDF 蛋白表達，抑制TNF- 合成和釋放，增強神經(jīng)元功能恢復(fù)，強化小鼠的空間規(guī)劃及瞬時記憶能力，協(xié)助抗抑郁，以緩解小鼠丙泊酚誘導(dǎo)的海馬組織損傷。