謝希，高曦，鄧漢清，陳秋揚，石曄，婁宏君，王文韜

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.湖南中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，湖南 長沙 410208；4.中南大學計算機學院，湖南 長沙 410083；5.湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，湖南 長沙 410208）

頸椎病是一種椎間盤及相鄰結構的退行性病變，根據(jù)其病理改變累積的結構不同，可分為神經根型頸椎病、脊髓型頸椎病、交感神經型頸椎病、椎動脈型頸椎病以及其他型頸椎病[1]，其中神經根型頸椎?。–SR）是最常見的類型[2]。CSR 的臨床表現(xiàn)主要為頸部和單側或雙側手臂的持續(xù)性、彌漫性及放射性疼痛，常常伴隨著感覺異常和運動功能障礙[3]。

脊痛消膠囊是黑龍江中醫(yī)藥大學鄧樹福教授根據(jù)多年臨床經驗，并結合中醫(yī)理論確立的處方，臨床常用于CSR 及腰椎間盤突出等疾病的治療，療效確切[4-6]。但目前對于脊痛消膠囊治療CSR 的有效活性成分及其作用機制研究較少。因此，本研究運用網(wǎng)絡藥理學技術對脊痛消膠囊治療CSR 的活性成分及潛在靶點進行預測，研究其發(fā)揮效應的可能途經，再利用分子對接技術對網(wǎng)絡藥理學預測結果進行驗證，為研究脊痛消膠囊治療CSR 的作用機制提供新思路，為其臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 脊痛消膠囊活性成分收集與篩選

脊痛消膠囊是黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院院內制劑，由川芎、澤瀉、澤蘭、車前子、白芍、防己、當歸、杜仲、黃芪、延胡索、五靈脂、地龍、莪術和三棱共14 味藥物組成。利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、TCM-ID數(shù)據(jù)庫（bidd.group/TCMID）和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫（bionet.ncpsb.org.cn/batmantcm/index.php）收集脊痛消組方的活性成分，然后設置口服生物利用度（Oral bioavailability,OB）≥30%和類藥性（Drug-likeness,DL）≥0.18 為篩選條件對收集到的活性成分進行篩選，得到脊痛消膠囊的有效活性成分。

1.2 脊痛消膠囊活性成分靶點檢索和校正

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫對篩選出的脊痛消膠囊活性成分進行檢索，得到相關蛋白靶點，利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org） 對蛋白靶點名稱進行校正，以“Homo sapiens”為種屬來源，選擇已被驗證的（reviewed）蛋白，刪除未經驗證（unreviewed）和無對應基因名的蛋白，得到蛋白靶點的基因名稱。

1.3 CSR基因靶點篩選

利用GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org）、OMIM 數(shù)據(jù)庫（https://www.omim.org） 和DisGe-NET 數(shù)據(jù)庫（https://www.disgenet.org） 檢索CSR 相關基因。CSR 屬于周圍神經損傷的范疇，為了盡量得到全面準確的檢索結果，故將關鍵詞peripheral nerve injury（周圍神經損傷）、cervical radiculopathy（神經根型頸椎?。┓謩e進行檢索，獲取與CSR 相關基因[7]。

1.4 脊痛消膠囊“藥物—成分—靶點”網(wǎng)絡構建與有效活性成分篩選

將脊痛消膠囊活性成分靶點與CRS 基因靶點導入Venny2.1.0 網(wǎng)站[Venny 2.1.0 (csic.es)]進行映射分析，將交集靶點基因與其對應的活性成分導入Cytoscape 3.9.1 軟件構建脊痛消膠囊“藥物 成分 靶點”網(wǎng)絡，利用CytoNAC 插件進行拓撲分析，篩選出有效活性成分并保存分析結果。

1.5 蛋白相互作用網(wǎng)絡構建與關鍵靶點篩選

將脊痛消和CSR 交集靶點基因導入String 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org） ，設置置信度≥0.7，隱藏網(wǎng)絡中孤立的節(jié)點，將結果保存為TSV 格式文件并在Cytoscape 3.9.1 軟件中，對蛋白相互作用結果進行分析，構建可視化網(wǎng)絡，利用Cytoscape 3.9.1 軟件中的插件CytoNCA 進行關鍵靶點篩選。

1.6 GO功能分析和KEGG通路富集分析

將潛在治療靶點導入R Studio 軟件，利用ClusterProfiler 包對潛在靶點進行GO 功能和KEGG 通路富集分析，設置P ＜0.05，物種為Homo sapiens，再通過ggplot2 包對分析結果進行可視化。

1.7 分子對接及可視化

從Protein Data Bank（PDB）數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org）下載各靶點基因的蛋白質晶體結構，從TCMSP數(shù)據(jù)庫下載藥物有效活性成分的3D 結構，利用Discover Studio 軟件對受體蛋白進行去水和去配體等操作，運用AutoDockTools 軟件對受體蛋白和配體小分子進行加氫和平衡電荷等修飾。利用AutoDock Vina軟件對受體蛋白與配體小分子進行分子對接，結合能打分，之后利用PyMOL 軟件將對接結果可視化。

2 結果

2.1 脊痛消膠囊活性成分收集與篩選

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫、TCM-ID 數(shù)據(jù)庫和BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫收集脊痛消的活性成分，結果當歸2 種、地龍2 種、杜仲28 種、黃芪20 種、莪術3 種、三棱5 種、延胡索49 種、白芍13 種、防己3 種、車前子9 種、澤蘭2 種、澤瀉10 種、五靈脂6 種和川芎7 種。所有化合物去重后得到133 種活性成分。

2.2 脊痛消膠囊活性成分靶點預測

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫查詢脊痛消膠囊所含的133種活性成分，結果得到1 182 個靶點，其中當歸50 個、地龍60 個、杜仲211 個、防己36 個、黃芪川芎27 個、208 個、三棱76 個、莪術22 個、延胡索208 個、白芍80 個、澤蘭45 個、澤瀉5 個和車前子154 個。去重后共得到275 個唯一靶點。

2.3 CSR靶點篩選

在數(shù)據(jù)庫中以peripheral nerve injury（周圍神經損傷）和cervical radiculopathy（神經根型頸椎?。┻M行檢索后，分別獲得7 783 和102 個基因靶點，刪除重復值后共獲得7 111 個與CSR 有關的基因靶點。

2.4 脊痛消活性成分-作用靶點網(wǎng)絡構建與有效活性成分篩選

將上述獲得的脊痛消作用靶點與CSR 靶點取交集后，得到潛在作用靶點，共245 個（圖1）。使用Cytoscape 3.9.1 軟件構建網(wǎng)絡（圖2）。網(wǎng)絡由368 個節(jié)點和2 586 條邊組成，其中紅色V 形節(jié)點代表藥物，綠色方形節(jié)點代表基因靶點，黃色圓形節(jié)點代表藥物化學成分，藍色六邊形節(jié)點代表有效活性成分，每條邊表示藥物 活性成分、活性成分 潛在靶點之間的關系。根據(jù)度值（degree）大小篩選出排名前六的有效活性成分，見表1。

表1 有效活性成分信息Table 1 Active ingredient information

圖1 脊痛消靶點和CSR 靶點交集Fig.1 Intersection of Jitongxiao capsule target and CSR target

圖2 藥物-活性成分-潛在靶點網(wǎng)絡Fig.2 Drug active ingredient potential target network

2.5 蛋白 蛋白相互作用網(wǎng)絡構建與分析

將245 個潛在靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫，設置置信度＞0.7，構建蛋白 蛋白相互作用網(wǎng)絡，并利用Cytoscape 軟件進行分析（圖3），PPI 網(wǎng)絡去除孤立節(jié)點后，共涉及228 個節(jié)點和3 308 條邊。根據(jù)度值大小決定各節(jié)點大小、顏色深度和字體大小，節(jié)點越大、顏色越深，說明該節(jié)點是脊痛消作用于神經根型頸椎病的關鍵靶點，篩選出11 個核心靶點，見表2。

表2 核心靶點信息Table 2 Core target information

圖3 蛋白互作可視化結果Fig.3 Visualization results of protein interaction

2.6 GO功能分析

借助R 語言進行分子功能（MF）、生物過程（BP）和細胞組成（CC）分析，繪制結果排名前十的柱狀圖和氣泡圖（圖4）。生物學過程主要表現(xiàn)為對異種刺激的反應、對氧氣水平降低的反應、細胞對化學刺激的反應和對脂多糖的反應等；細胞組分主要包括突觸后膜、膜微結構域、突觸前膜組成部分和細胞膜上的膜筏等；分子功能主要包括神經遞質受體活性、G 蛋白偶聯(lián)受體活性、突觸后神經遞質受體活性、核受體活性、配體激活的轉錄因子活性、DNA結合轉錄因子的活性和兒茶酚氨結合等。

圖4 GO 功能分析Fig.4 GO function analysis

2.7 KEGG通路富集分析

KEGG 分析結果顯示，潛在靶點主要涉及脂質、動脈粥樣硬化（Lipidandatherosclerosis）、晚期糖基化終末產物 糖基化終末產物受體信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、前列腺癌（Prostate cancer）、白介素-17 信號通路（IL-17 signaling pathway）、乙型肝炎（Hepatitis B）、人類巨細胞病毒感染（Human cytomegalovirus infection）、絲裂原活化蛋白激酶信號通路（MAPK signaling pathway）、非小細胞肺癌（Non-small cell lung cancer）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）和人類T 細胞白血病病毒 型感染（Human T-cell leukemia virus 1 infection）等，見圖5。

圖5 KEGG 富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis

2.8 分子對接驗證結果

蛋白互作結果顯示：AKT1（PDB ID:1UNQ）、TP53（PDB ID:1AIE）、JUN（PDB ID:1S9K）、TNF（PDB ID:2AZ5）、HSP90AA1（PDB ID:3Q6N）、EGFR（PDB ID:2GS7）、IL6（PDB ID:4CNI）、CTNNB1（PDB ID:1G3J）、CASP3（PDB ID:1NMS）、RELA（PDB ID:3QSY）、MAPK1（PDB ID:4IZ5）在脊痛消膠囊治療CSR 的過程中發(fā)揮著重要作用。利用Autodock 軟件將脊痛消的關鍵活性成分與潛在靶點進行分子對接，結合能≤20.93 kJ/mol表明活性成分與靶點有較強的結合活性，分子對接結合能結果，見圖6。用PyMOL 軟件將對接的結果進行可視化（圖7），活性成分與作用靶點之間主要是通過氫鍵等分子作用力形成較強結合力，槲皮素與TYR-285、HIS-252 兩個氨基酸以氫鍵結合到RELA（圖7 A）；山柰酚與HIS-252以氫鍵結合到RELA（圖7 B）；山柰酚與ALA-422、CYS-569 和LYS-520三個氨基酸以氫鍵結合到JUN（圖7 C）；谷甾醇與ASP-831 和LYS-721 以氫鍵結合到EGFR（圖7 D）；山柰酚與SER-65、GLY-44、TRP-47、TYR-96和PHE-98五個氨基酸以氫鍵結合到IL-6（圖7 E）；槲皮素與ASP-831、YHR-830、LYS-721 和MET-769 4 個氨基酸以氫鍵結合到EGFR（圖7 F）；谷甾醇與ASP-1、GLU-64以氫鍵結合到IL-6（圖7 G）；谷甾醇與MET-108 以氫鍵結合到MAPK1（圖7 H）；山柰酚與GLU-29、HIS-61以氫鍵結合到MAPK1（圖7 I）；谷甾醇與TRP-80、LEU-78以氫鍵結合到AKT1（圖7J）；山柰酚與MET-769、THR-830 和LYS-721 以氫鍵結合到EGFR（圖7 K）；谷甾醇與LEU-260 以氫鍵結合到RELA（圖7 L）。

圖6 分子對接結合能熱圖Fig.6 Thermograph of molecular docking binding energy

圖7 分子對接示意圖Fig.7 Molecular docking diagram

3 討論

CSR 屬于中醫(yī)“痹癥”和“項強”的范圍，外傷或勞損等原因，導致局部氣血運行紊亂，正氣虛弱，瘀血內停，水濕內阻，血水互結，經脈不通，日久失養(yǎng)從而致病，總的病機是氣機不暢、經脈閉阻。根據(jù)不同臨床表現(xiàn)可將其分為風寒阻絡證、寒濕阻絡證、氣滯血瘀證、氣血虧虛證和肝腎虧虛證，可分別予以祛風散寒、散寒除濕、活血化瘀、補益氣血和滋補肝腎之法[8]。脊痛消膠囊是黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院院內制劑，由當歸、川芎、澤蘭、澤瀉、車前子、白芍、防己、杜仲、黃芪、延胡索、三棱、地龍、莪術和五靈脂共14 味藥物組成，其中當歸和白芍補血；車前子、澤瀉和防己利水消腫除濕；川芎和延胡索行氣止痛；黃芪補氣升陽，以助血行；五靈脂活血化瘀、緩急止痛，共奏活血化瘀、祛風通絡之功效[9]。臨床此方用于治療CSR 療效顯著，但尚未明確是哪些活性成分通過何種作用機制發(fā)揮相應效應的。

本研究利用網(wǎng)絡藥理學的方法從脊痛消膠囊14味藥物中篩選出了133 種活性成分，275 個靶點基因，其中245 個靶點基因與CSR 相關，構建藥物 活性成分 靶點網(wǎng)絡圖，顯示有385 個節(jié)點和2 648 條邊，顯示了脊痛消膠囊多成分、多靶點作用于CSR 的特點。GO 分析結果顯示，-谷甾醇、山柰酚、槲皮素、豆甾醇和常春藤皂苷元等化學成分與對異種刺激的反應、對氧氣水平降低的反應、細胞對化學刺激的反應和對脂多糖的反應等作用機制相關。分子對接結果顯示，-谷甾醇、山柰酚、槲皮素、豆甾醇和常春藤皂苷元與AKT1、JUN、TNF、HSP90AA1、P53 和IL-6 等關鍵靶點有較強的結合力，KEGG 分析結果顯示，脊痛消的有效成分可以調控AGE-RAGE 信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、白介素 17 信號通路和絲裂原蛋白活化激酶信號通路等，說明脊痛消膠囊包含的多種活性成分是通過多靶點和多通路實現(xiàn)對CSR 的治療作用的。

AKT 也稱為蛋白激酶B，是一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，AKT1 是最重要的亞型之一，在多種生物學過程中發(fā)揮重要作用[10]。研究顯示，AKT1 是治療神經根型頸椎病的關鍵靶點之一，激活AKT 信號通路可抑制神經細胞自噬和凋亡，修復受損神經根，顯著抑制椎間盤軟骨細胞的凋亡[11,12]。-谷甾醇和山柰酚可通過激活AKT 通路抑制細胞凋亡[13,14]，槲皮素可減輕神經縮窄引起的神經病理性疼痛[15]，抑制由脊髓損傷引起的神經元自噬[16]。腫瘤壞死因子（TNF），是一種炎癥介質，可以增加破骨細胞的分化從而加重關節(jié)損傷和骨質丟失[17]，頸椎間盤退化患者血清中TNF和IL-6水平顯著上升[18]，本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，脊痛消膠囊可顯著降低神經根型頸椎病模型大鼠神經根IL-6 的水平[19]。槲皮素可降低TNF- 水平從而減輕脊髓炎癥反應[20]，山柰酚可以靶向調節(jié)TLR4/NF- B信號通路，降低TNF 水平發(fā)揮保護神經元的作用。JUN 蛋白是激活蛋白-1（AP-1）復合體中研究最廣泛的蛋白，參與增殖、凋亡、存活和腫瘤發(fā)生等多種細胞活動[21]。據(jù)報道，JUN 蛋白在周圍神經系統(tǒng)損傷后修復中發(fā)揮重要作用，其表達上調可促進神經修復，然而隨著失神經時間延長，JUN的表達逐漸降低[22]，研究表明[23]，槲皮素可下調JUN 蛋白磷酸化水平發(fā)揮保護雪旺細胞（SCs）的成髓鞘功能。熱休克蛋白90（HSP90）是一種重要的分子伴侶，用以保證其他蛋白質在生物學過程中保持結構和功能的穩(wěn)定[24]。在周圍神經損傷模型中，HSP90通過與雙亮氨酸鏈激酶結合促進軸突損傷信號的傳遞，增加神經元的修復與再生[25]。研究表明，HSP90 在抑制神經病理性疼痛的過程中與TLR4 發(fā)揮著協(xié)同作用[26]。

脊痛消膠囊治療神經根型頸椎病的生物學過程主要涉及對（細胞）外刺激的反應、對缺氧的反應、細胞對化學刺激的反應、對活性氧的反應和對脂多糖的反應等。炎癥反應是神經根型頸椎病的重要病理過程，臨床研究表明，神經根型頸椎病患者血清中TNF、IL-1 和IL-6 水平顯著升高，IL-2 水平顯著降低，炎癥反應是導致神經根性痛的主要原因[27,28]?；钚匝酰≧OS）是一種分子質量小但活性高的物質，主要包括氧陰離子、氧自由基（超氧化物和羥基自由基）和過氧化氫等過氧化物，可以氧化包括蛋白質、DNA 和脂質在內的多種細胞組分[29]。最新研究顯示，ROS靶向介導NOX2/PI3K/AKT 信號通路的激活促進損傷后神經軸突的再生和功能恢復[30]。KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)，脊痛消膠囊治療神經根型頸椎病的靶向信號通路主要有AGE-RAGE 信號通路、TNF 信號通路、IL-17 信號通路和MAPK 信號通路等。AGEs 是葡萄糖或者果糖等其他糖類對蛋白質、核酸等大分子進行翻譯后非酶修飾得到的異質分子，在各年齡相關性疾病中，AGEs 與受體RAGEs結合，可促進氧化應激從而加強炎癥反應[31]。MAPK/ERK 信號通路在周圍神經損傷修復過程中發(fā)揮著重要作用，研究顯示，周圍神經損傷后，神經元和軸突中的MAPK/ERK1 通路激活，且ERK 磷酸化水平隨時間變化而不同[32]。免疫反應是神經根型頸椎病根性痛發(fā)生的原因之一[33]，白介素17（IL-17）是由輔助性T細胞17 分泌的一種促炎因子，介導炎癥反應和自身免疫性疾病的發(fā)生，周圍神經損傷后，TH17 數(shù)量顯著增加，釋放IL-17 促進機械性疼痛超敏反應的發(fā)生[34]。

綜上，本研究基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術預測脊痛消膠囊治療神經根型頸椎病的分子機制，結果表明，脊痛消膠囊中包括-谷甾醇、槲皮素、山柰酚和豆甾醇在內的多種活性成分可以穩(wěn)定結合AKT1、TNF、JUN和MAPK等作用靶點，通過TNF信號通路、MAPK信號通路、IL-17 信號通路和AGE-RAGE 信號通路調控氧化應激和炎癥反應等生物學過程發(fā)揮治療神經根型頸椎病的作用。但本研究也存在一定的局限性，只研究了分子對接對網(wǎng)絡藥理學結果的驗證，應進一步研究體內、外試驗，使試驗結果更具有科學性和準確性，為脊痛消膠囊的臨床應用提供理論參考依據(jù)。