楊超強 張虎林 汪小敏 王亮 王宜燦

【摘 要】 椎間盤退變是一種以髓核細胞凋亡減少、細胞外基質降解加速為主要病理特征，常伴隨慢性腰痛或下肢神經根性疼痛等臨床表現的脊柱疾病。隨著再生醫(yī)學的發(fā)展及椎間盤退變機制的不斷研究，間充質干細胞來源外泌體作為一種用于細胞間通訊的活性生物物質，已被證實在椎間盤再生中具有治療潛力。其可抑制炎癥反應和調節(jié)免疫系統(tǒng)，促進髓核細胞增殖和再生，提高體外細胞外基質的生成，具有逆轉或者中止椎間盤退變的潛能。綜述間充質干細胞來源外泌體的生物學特性和功能及其在椎間盤退變治療中的作用及機制，以期為后續(xù)研究和臨床應用提供指導。

【關鍵詞】 椎間盤退變；間充質干細胞；外泌體；下腰痛；機制；研究進展；綜述

下腰痛（low back pain，LBP）是一種非常普遍的脊柱疾病，也是世界范圍內導致殘疾的主要原因。據統(tǒng)計，特定時間內，一般人群中LBP的平均患病率約為18%，1年患病率約為38%［1］。隨著我國老年人口的增多和現代生活方式的變化，LBP發(fā)病率呈低齡化趨勢。椎間盤退變（intervertebral disc degeneration，IDD）是LBP廣泛認可的因素之一。導致IDD的原因尚不清楚，但有學者認為，年齡、異常機械應力、創(chuàng)傷、營養(yǎng)缺乏和遺傳等因素可能涉及其中［2］。IDD由于代謝失衡，細胞外基質（ECM）成分的變化、髓核細胞的丟失、過度氧化應激和炎癥反應導致椎間盤結構惡化，軟骨終板內的微孔鈣化，使氣體和營養(yǎng)物交換遭受損害［3］。目前，保守及手術治療效果欠佳，不能延緩或逆轉其退變進程，因此需要新的治療方案直接解決IDD的原因，保留或恢復椎間盤結構和機械功能。

由于目前治療IDD的局限性，越來越多的研究致力于退行性椎間盤再生，主要集中于生物活性分子注射、細胞治療、組織工程和基因治療等領域，其中干細胞治療被廣泛關注［4-5］。干細胞分泌的外泌體在再生醫(yī)學中發(fā)揮了重要作用，通過維持內源性干細胞、抑制凋亡和調節(jié)免疫反應等方面治療IDD［6］。外泌體也可以分化為髓核樣細胞，并補充機體減少的髓核細胞，延緩IDD進展。本文綜述間充質干細胞來源外泌體（mesenchymal stem cell-derived exosomes，MSC-Exos）在IDD治療方面的研究進展，并為臨床工作提供指導。

1 MSC-Exos的生物學特性及功能

隨著組織工程和再生醫(yī)學的發(fā)展，外泌體作為細胞間通訊的活性生物物質，其促進組織再生的能力取得了長足進展。MSC-Exos是研究最廣泛的外泌體來源之一，其優(yōu)點是細胞來源豐富，易于得到，親本細胞來源局限小，生物安全性高［7］。MSC-Exos是一種直徑為50～200 nm的膜性扁平狀雙層納米級膜狀囊泡，源自多泡內核小體，可通過離心、超濾、尺寸排除色譜等方法分離提?。?］。MSC-Exos鑒定的重點是形狀、大小和標記蛋白，可通過多種技術實現。MSC-Exos可直接從血漿、精液、尿液等體液獲得，并可以有效地運輸蛋白和RNA等生物活性物質，在細胞間通訊、信號轉導和代謝調節(jié)中發(fā)揮著重要作用［9］。

MSC-Exos是細胞分泌出的一種小囊泡，包含核酸、蛋白質、脂類等多種成分［10］。其中，脂類對外泌體的穩(wěn)定性和運輸過程中成分的保護起重要作用。MSC-Exos中包含多種蛋白質，這些蛋白質可能參與MSC-Exos的形成和細胞間通訊。此外，MSC-Exos中還含有大量的核酸，包括mRNA、miRNA等，這些核酸可以通過調節(jié)靶細胞基因轉錄影響細胞功能。MSC-Exos作為一種細胞間通訊的信使，能夠被靶細胞通過多種方式攝取，從而影響靶細胞的功能，參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。

2 MSC-Exos對椎間盤變性的調控機制

MSC-Exos作為促進椎間盤修復的潛在細胞外囊泡，其潛在機制可能是負責維持內源性干細胞，通過促進髓核細胞的增殖和維持ECM穩(wěn)態(tài)，向受損組織輸送免疫調節(jié)介質，保護細胞免受凋亡、減輕氧化應激和炎癥反應等，進而發(fā)揮延緩IDD的作用。

2.1 參與ECM的產生與降解 在IDD過程中，ECM的合成代謝紊亂，表現為髓核細胞和纖維內環(huán)細胞合成的Ⅱ型膠原蛋白減少，Ⅰ型膠原蛋白合成增加。此外，大量的細胞內炎癥因子如白細胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在椎間盤細胞外釋放，導致ECM中基質金屬蛋白酶（MMPs）與血小板反應蛋白解整合素金屬肽酶（ADAMTS）的高表達，這兩種酶作為髓核細胞變性的標志蛋白，均能破壞ECM。MSC-Exos在促進椎間盤再生的治療效果中發(fā)揮著重要作用。MSC-Exos可以增強神經元前體細胞（NPCs）中ECM重建表達，抑制MMPs的表達，促進髓核細胞的增殖和維持ECM穩(wěn)態(tài)。LU等［11］發(fā)現，MSC-Exos干預后，MMP-1和MMP-3的表達顯著降低，導致退變髓核細胞中ECM的表達顯著增加。QI等［12］發(fā)現，MSC-Exos可以通過抑制p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）磷酸化減少ECM降解。IDD與ECM中的硫酸軟骨素密切相關，而硫酸軟骨素合酶是髓核細胞中ECM合成的關鍵酶之一。蔣長青等［13］發(fā)現，MSC-Exos中富含的miRNA-199/miRNA-16/miRNA-195可與IL/TNF的NF-κB通路結合，減少IL/TNF的合成，促進硫酸軟骨素合酶表達，進而促進ECM合成。周榮耀等［14］發(fā)現，MSC-Exos可以通過增加基質金屬蛋白酶組織抑制因子-1的表達減少ECM的降解。綜上所述，筆者進一步深入研究認為，作為椎間盤的主要成分，MMPs和ADAMTS是降解膠原蛋白和蛋白聚糖的主要酶，它們通過聯合作用降低ECM含量并導致IDD。因此，維持ECM的合成/降解平衡對于延緩IDD極為重要，這意味著NPCs中膠原蛋白、蛋白聚糖、MMPs和ADAMTS的表達保持在正常水平至關重要。

2.2 促進抗炎反應 根據研究，炎性小體通過增加IL-1β、TNF-α等炎癥因子的表達，誘導MMPs和ADAMTS的產生，參與IDD的病理過程。而外泌體能顯著抑制凋亡NPCs的炎癥反應和炎癥體的形成，可誘導存活細胞微環(huán)境的恢復，減少對細胞內環(huán)境的干擾［15］。MSC-Exos可降低H2O2誘導的一氧化氮合酶和IL-6等炎癥因子的表達，表明外泌體可減輕炎癥反應［16］。MSC-Exos已被證明通過調節(jié)NF-κB通路下調炎癥反應，通過傳遞靶向混合系激酶3的miR-142-3p減少IL-1β誘導的炎癥細胞因子分泌和MAPK信號通路激活［17］。XIA等［18］研究退行性髓核和正常髓核，發(fā)現退行性椎間盤中差異表達的150個蛋白與炎癥反應增強密切相關，由此表明，干細胞衍生的外泌體可以通過調控其相關蛋白內容物減輕椎間盤的炎癥反應，減少ECM的降解。WANG等［19］研究發(fā)現，嚙齒類動物腦疝模型中的髓核細胞產生含有miR-223的外泌體，該外泌體已被證明通過調節(jié)NF-κB通路下調炎癥反應。YUAN等［20］研究發(fā)現，MSC-Exos攜帶AntagomiR-4450，可以治療小鼠的椎間盤退化。該研究證實，抑制miR-4450可上調鋅指蛋白（ZNF121），從而減輕炎癥、凋亡和椎間盤細胞損傷。以上研究均表明，外泌體可能通過參與抑制炎癥反應進而發(fā)揮延緩或逆轉IDD的作用。綜上所述，筆者認為，炎癥作為IDD的標志之一，一直伴隨著促炎細胞因子的釋放，被認為是導致椎間盤源性疼痛的關鍵因素。炎癥細胞因子的相互作用和異常表達可引起炎癥并加速IDD。此外，炎性細胞因子還可以加速細胞衰老、細胞凋亡、激活ECM降解蛋白的表達并抑制ECM結構分子的表達，以增強退化過程。相信隨著MSC-Exos的深入研究，MSC-Exos通過參與抑制炎癥反應進而發(fā)揮延緩或逆轉IDD的作用將十分凸顯。

2.3 抑制髓核細胞凋亡 IDD主要因為炎癥反應、內質網應激等不利因素導致的NPCs凋亡減少進而引起ECM降解。CHENG等［21］的一項研究用人骨髓間充質干細胞和成纖維細胞來源的外泌體治療TNF-α誘導的凋亡NPCs，骨髓間充質干細胞組細胞凋亡率明顯低于其他組。GUO等［22］通過觀察內質網應激通路相關分子葡萄糖調節(jié)蛋白78（GRP78）及C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應元件結合轉錄因子同源蛋白（CHOP）在退變椎間盤內NPCs的表達及其與NPCs凋亡的關系，發(fā)現經過MSC-Exos誘導后的NPCs可以明顯抑制內質網相關通路和凋亡標志物的表達；表明MSC-Exos可以通過降低內質網應激關鍵分子CHOP的水平，進而抑制內質網應激介導的細胞凋亡。在大鼠模型中，通過椎間盤內注射MSC-Exos發(fā)現，由MSC-Exos衍生而來的miR-21可以抑制磷酸酶和張力素同源物，激活PI3K-AKT通路，從而緩解髓核細胞凋亡和椎間盤變性［23］。ZHU等［24］研究發(fā)現，MSC-Exos傳輸的miR-532-5p可以靶向促進RASSF5基因敲除以減少NPCs凋亡。研究表明，AGEs在髓核組織中積累，可以通過激活UPR誘導內質網應激促進髓核細胞凋亡，而MSC-Exos可以通過激活AKT和ERK信號通路減輕AGEs誘導的內質網應激反應以降低髓核細胞的凋亡率［25］。筆者認為，正常的凋亡可以維持內部環(huán)境的穩(wěn)定性，這是由基因控制的自主程序性細胞死亡，而高凋亡率和衰老導致NPCs減少，意味著過度凋亡可降低椎間盤組織中NPCs的密度，破壞椎間盤的結構和功能，并導致IDD。研究證實，MSC-Exos通過外源性和內源性途徑均參與抑制NPCs凋亡過程，因此，減少NPCs凋亡將延緩甚至逆轉IDD進程。

2.4 通過miRNA調控椎間盤組織修復 外泌體可以改變椎間盤中許多miRNA的自我表達水平，特別是一些重要的miRNA分子，作為外泌體處理組織損傷和修復的有效調節(jié)因子，它們可以參與調節(jié)細胞凋亡和炎癥反應。當NPCs受到影響時，不僅外泌體自身攜帶的miRNA可以抑制細胞凋亡，還可以通過外泌體運載特異性miRNA使其成為具有特定效應的載體。ZHANG等［26］研究脂多糖誘導的NPCs凋亡，發(fā)現MSC-Exos衍生物miR?410可以直接與NPCs中的炎性小體（NLRP3）mRNA結合，從而降低NLRP3表達，抑制半胱氨酸蛋白酶（Caspase?1）和細胞焦亡蛋白（Gasdermin D）的表達，以發(fā)揮明顯的抑制NPCs凋亡作用。龔東亮等［27］觀察外泌體的形態(tài)，比較分析血紅素氧合酶-1（HO-1）蛋白在IDD中的表達陽性率，以及miR-21、HO-1和Bach1在大白兔椎間盤組織中的表達，并通過造模處理、分泌物提取、免疫組化染色、Rt-PCR檢測、HE染色，及流式細胞術觀察大白兔椎間盤組織的形態(tài)學變化，觀察大白兔退行性髓核細胞的凋亡能力。結果表明，MSC-Exos分泌調節(jié)miR-21，抑制Bach1，從而促進HO-1機制修復椎間盤疾病的能力，進而促進退變組織細胞凋亡。徐辰［28］使用高通量檢測和生物信息學分析發(fā)現，間充質干細胞衍生的外泌體可以顯著改善髓核細胞轉錄后調節(jié)因子的表達，這意味著轉錄后調節(jié)因子如miRNA等與外泌體促進IDD中ECM合成密切相關。利用高通量miRNA分析MSC-Exos，結合生物信息學預測技術，發(fā)現了一批具有CHSY抑制作用的NF-κB靶向miRNA，并通過適當的實驗進行了驗證?？傊P者進一步深入研究認為，MSC-Exos可能通過其所含miRNAs參與調節(jié)基因表達和細胞功能，以實現椎間盤的修復和轉化，miRNAs的表達譜與髓核細胞的增殖、凋亡、炎癥反應，以及ECM重塑等密切相關，這意味著它在調節(jié)組織再生方面具有良好的應用前景。

3 MSC-Exos治療椎間盤的體內研究

大量研究表明，MSC-Exos在體內治療IDD有效，并取得了不錯的結果。XIE等［29］通過叔丁基過氧化氫（TBHP）誘導的氧化應激細胞模型和IDD大鼠模型研究MSC-Exos對終板軟骨細胞（EPCs）的作用發(fā)現，MSC-Exos可抑制EPCs的細胞凋亡和鈣化。ZHOU等［30］研究體內缺氧微環(huán)境下MSC-Exos是否對保護IDD表現出更有益的作用；采用尾部IDD大鼠模型研究發(fā)現，MSC-Exos

可能通過TLR4途徑調節(jié)人髓細胞核細胞基質的增殖和合成。筆者認為，MSC-Exos可能通過改善體內和體外合成代謝和分解代謝之間的穩(wěn)態(tài)失衡緩解IDD，為IDD提供了新的治療靶點。XIA等［18］采用兔IDD模型研究外泌體對IDD的治療效果，結果表明，MSC-Exos通過抑制炎癥介質和NLRP3炎癥小體活化，在病理性髓核細胞中起抗炎作用。由此可以推斷，NLRP3炎癥小體是IDD治療的有效靶點，注射外泌體可能是一種有前途的治療策略。LUO等［31］通過體內注射軟骨終板干細胞修飾的水凝膠到大鼠軟骨終板附近后，軟骨終板干細胞衍生的外泌體通過Sphk2/AKT途徑平衡自噬和衰老，抑制IDD。筆者認為，本研究為IDD治療提供了一種新穎有效的非侵入性手術治療策略，使用可注射的ECM凝膠并持續(xù)釋放功能性外泌體以延緩IDD進程?？傊?，這些研究表明，MSC-Exos通過增加ECM的產生，減少NPCs的凋亡，提高相關細胞存活率，平衡細胞自噬和衰老，調節(jié)免疫微環(huán)境。這些結果證實了體外研究的結果，為IDD提供了一種新的再生治療方法。

4 小結與展望

椎間盤是體內最大的無血管組織，生理環(huán)境復雜，高壓、高通透性、低pH、低營養(yǎng)、低氧的微環(huán)境不利于髓核細胞的增殖。在退行性椎間盤中，復雜的炎癥環(huán)境、細胞數量減少和纖維化可能影響體內和體外結果。此外，IDD是一個涉及多種因素的病理過程，其確切機制尚未確定。因此，針對特定原因選擇合適的外泌體非常重要。多項研究表明，外泌體參與并減輕IDD的多種病理生理過程，MSC-Exos調節(jié)髓核細胞的功能，主要通過細胞間通訊及其內容物的表觀遺傳修飾，從而使活性髓核細胞數量恢復。此外，外泌體還參與促進ECM合成、抑制ECM降解及細胞凋亡、抗炎反應等作用。同時，外泌體應用于IDD治療仍存在許多問題，例如，外泌體提取分離、靶向轉移、藥物劑量、療效評價，以及其相關產品的細胞源、類型、制備工藝等方面差異較大，而治療機制和體內活性等相較傳統(tǒng)藥物更加復雜。因此，需要進一步深入研究外泌體的復雜調控機制，優(yōu)化培養(yǎng)和移植條件，并進行更多的臨床前試驗驗證外泌體的安全性。隨著對椎間盤及外泌體研究的深入，相信IDD治療中外泌體的研究應用前景會進一步擴大。

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收稿日期：2023-01-27；修回日期：2023-03-08