龔麗莎 向芷萱 王照 魯敏 安華明

摘要：【目的】CDPKs是植物中廣泛存在的Ca2+感受器，鑒定刺梨（Rosa roxburghii Tratt.）CDPK基因家族成員，并探索其對不同供鈣水平的表達響應。【方法】采用生物信息學方法鑒定并分析RrCDPK基因家族，通過轉錄組測序及實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）分析其組織表達特異性及在不同供鈣水平下的表達響應。【結果】從刺梨基因組中共鑒定出16 個具絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和EF-hand 結構域的CDPK基因（命名為RrCDPK1～16），結構分析顯示蛋白長度在393～561 aa 之間，分子質量在44.02～62.98 ku 之間，平均等電點6.05；家族基因結構差別較大，外顯子數(shù)量為2～10 個，包括6 個保守基序；亞細胞定位預測RrCDPKs在細胞核和多種細胞器均有定位，主要定位于細胞質；進化分析可分為4 個亞族，且與草莓的親緣關系最近，其次是蘋果，較遠為擬南芥和水稻。啟動子順式作用元件分析表明，RrCDPKs大多含光響應元件、多種激素響應元件及脅迫響應元件等。不同器官及果實發(fā)育時期的轉錄組數(shù)據顯示RrCDPKs 具有時空表達特異性。RrCDPKs 對供鈣水平的響應表明，相比無鈣處理，0.5 mmol·L-1鈣水平下RrCDPK1/2/4/8 表達顯著上調，2 mmol·L-1鈣水平下RrCDPK2/4/9/10/12 表達顯著上調；RrCDPKs在葉和根中對供鈣水平及處理時間的表達響應也不盡相同?！窘Y論】共鑒定出16 個RrCDPK基因，在刺梨中的表達具時空特異性，且在應對不同供鈣水平時發(fā)揮的作用不盡相同。研究結果可為深入揭示刺梨CDPK基因家族的功能及其對外界鈣水平的響應機制奠定基礎。

關鍵詞：刺梨；鈣依賴性蛋白激酶；供鈣水平

中圖分類號：S661.9 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）04-0639-14

鈣離子（Ca2+）作為第二信使，參與植物體內許多信號轉導途徑[1]。各種生物和非生物脅迫在內的外部刺激均會導致胞質內的游離Ca2+濃度發(fā)生改變，而被鈣結合蛋白或鈣信號傳感器識別，從而導致下游表達事件的發(fā)生[2-3]。鈣依賴性蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases，CDPKs/CPKs）作為植物中主要的Ca2+感受器之一[4]，可不依賴于鈣調素而經EF-hand 直接與Ca2+結合，感受Ca2+濃度變化后，蛋白激酶活性恢復，將Ca2+信號轉導為磷酸化級聯(lián)反應，這使得CDPK 具有Ca2+傳感器和應答器的雙重功能而被廣泛研究[5-7]。

CDPKs/CPKs是植物和一些原生生物特有的一類絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）型蛋白激酶，以其獨特的結構而聞名[8]，具有N 端可變域、Ser/Thr 蛋白激酶域、自抑制連接域和C 端具有EF-hand 結構的類鈣調素調控域這4 個典型的結構域[9]。目前已在多種植物中鑒定出CDPK基因，且不同物種中CDPK基因數(shù)量差異較大，如模式植物擬南芥[Arabidopsisthaliana（L.）Heynh.]中有34 個[10]，水稻（Oryza sativaL.）中有31 個[11-12]，對萼獼猴桃（Actinidia valvataDunn.）[13]、玉米（Zea mays L.）[14]、番茄（Solanum lycopersicumL.）[15]、黃瓜（Cucumis sativus L.）[16]、天藍苜蓿（Medicago lupulina L.）[17]中分別有63、40、29、17、10 個。CDPK廣泛分布于植物體中，在植物生長發(fā)育和形態(tài)建成、生物及非生物脅迫應對中發(fā)揮著重要作用，且此過程也離不開Ca2+的調控[9]。如黃玉婷[18]發(fā)現(xiàn)外源Ca2+處理能使CDPK基因大幅上調表達而提高茶樹低溫耐受力；CDPK 與Ca2+結合后活性被激發(fā)，從而調控玉米熱激蛋白的表達來提高耐性[19]；GsCPK16 可通過響應溫度和光刺激而被提高的細胞溶質Ca2+水平激活，從而調節(jié)龍膽花的重新開放[20]。

刺梨（Rosa roxburghii Tratt.）屬薔薇科植物，是西南地區(qū)的特色樹種之一，在土壤交換性鈣含量（w）463～4526 mg · kg- 1 的貴州喀斯特地區(qū)生長良好[21]。目前，刺梨全基因組測序已完成，但關于刺梨CDPK基因家族的分析及其對供鈣水平的響應尚未見報道。本研究基于全基因組水平通過生物信息學方法，鑒定和分析刺梨CDPK基因家族特征和系統(tǒng)進化關系、啟動子順式作用元件，分析該家族的時空表達特性，并研究刺梨CDPK基因家族成員對不同供鈣水平的響應，為后續(xù)探明CDPK家族在刺梨中對外界鈣環(huán)境的響應機制提供相關信息。

1 材料和方法

1.1 材料

本試驗于2021 年4 月在貴州大學農學院刺梨資源圃中選取長勢基本一致的刺梨貴農5 號（R. roxburghiiTratt.‘Guinong 5）扦插苗，先用自來水沖洗除去根部泥土，再用蒸餾水培養(yǎng)，而后使用1/8 改良的Hoagland and Aron 完全營養(yǎng)液進行預培養(yǎng)，每3 d更換1 次營養(yǎng)液，將水培刺梨苗置于人工氣候室內培養(yǎng)。用去離子水將預培養(yǎng)2 個月刺梨扦插苗的根和葉沖洗干凈后饑餓24 h，轉入以下3 種不同供鈣水平的營養(yǎng)液中。經文獻查找及一系列預試驗篩選，最終試驗設置3個Ca2+濃度梯度：0、0.5、2 mmol·L-1，分別配制成無鈣、低濃度鈣及高濃度鈣的營養(yǎng)液，并在培養(yǎng)0、1、7 d 后取其水培根和葉，經液氮處理后保存于-80 ℃?zhèn)溆?。各處理? 次生物學重復。在保持其他營養(yǎng)元素濃度不變的條件下，去掉營養(yǎng)液中所有含鈣成分，由醋酸鈣供鈣，并用40 mg · L- 1NH4NO3 補齊氮素差異。試驗中所用營養(yǎng)液均用0.1 mol·L-1 NaOH和H2SO4調整pH 值為6.5，培養(yǎng)溫度20 ℃。

1.2 方法

1.2.1 刺梨CDPK基因家族成員的鑒定以及染色體定位、蛋白質理化性質和亞細胞定位分析?從NCBI數(shù)據庫（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）下載刺梨基因組文件，在Tair 數(shù)據庫（https：//www.arabidopsis.org/）下載擬南芥CDPK 家族的蛋白序列，運用TBtoolsv1.098696 進行本地Blast 比對（E-value ＜ 1×10-5），取bit score > 100 的結果，隨后將得到的序列在NCBI中進行Protein Blast，結合SMART（http：//smart.embl- heidelberg.de/）及Pfam 數(shù)據庫（https：//pfam.xfam.org/），以CDPK 蛋白典型結構域Ser/Thr 蛋白激酶區(qū)（Pfam 數(shù)據庫ID：PF00069）以及EF-手型結構區(qū)（PF13499）進行篩選，刪除重復值及不含上述結構域的序列，進而得到刺梨CDPK基因家族的成員。在刺梨基因組注釋信息GFF 文件中提取出RrCDPK基因染色體位置信息，并利用TBtools軟件[22]繪圖。根據RrCDPK在染色體上的排列順序，依次對其命名。利用在線工具ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）對RrCDPK蛋白的分子質量、等電點等進行分析。利用WoLF PSORT 網站（https：//wolfpsort.hgc.jp）預測RrCDPK蛋白的亞細胞定位信息。

1.2.2 系統(tǒng)進化樹的構建及基因結構、保守基序和保守結構域分析?從Swiss- Prot（https：//www.uniprot.org/）及NCBI 數(shù)據庫下載水稻CDPK家族蛋白文件[11-12]，從Tair 數(shù)據庫下載擬南芥CDPK家族蛋白文件[10]；從GDR數(shù)據庫（https：//www.rosaceae.org）下載蘋果和草莓蛋白序列，依據上述方法得到蘋果及草莓的CDPK家族蛋白文件。使用MEGA7 軟件對水稻、擬南芥、蘋果、草莓及刺梨的CDPK家族進行Muscle 多序列比對，采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統(tǒng)進化樹，bootstrap 值設置為1000。使用iTOL在線工具（https：//itol.embl.de）進行美化。使用MEME 在線工具（https：//meme- suite.org/meme/index.html）預測其蛋白序列的保守基序；通過NCBI-CDD進行RrCDPK家族保守結構域信息分析；根據RrCDPK家族GFF文件分析內含子-外顯子結構；最終使用TBtools進行可視化。

1.2.3 啟動子順式作用元件分析?利用TBtools工具從刺梨基因組中提取出RrCDPK 編碼序列的啟動子上游2000 bp序列，使用在線數(shù)據庫plantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預測其順式作用元件。

1.2.4 刺梨不同組織及不同果實發(fā)育時期的轉錄組分析?從刺梨轉錄組數(shù)據[23-24]中提取出RrCDPK 基因家族在刺梨不同組織及果實發(fā)育時期的表達數(shù)據，采用TBtools軟件繪制熱圖并進行聚類分析。1.2.5 qRT- PCR 分析使用Primer blast（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer blast）設計qRTPCR引物，由生工生物工程股份有限公司（上海）合成（表1）。取不同供鈣水平處理的刺梨苗葉和根，用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit 總RNA提取試劑盒（大連寶生物工程有限公司）提取總RNA，純化的RNA 用TaKaRa RNA PCR KitVer.2.1 試劑盒（大連寶生物工程有限公司）合成cDNA。使用ABI ViiA7 熒光定量PCR儀（杭州博日科技有限公司）進行PCR反應，反應體系為20 μL：2 μLcDNA、各0.8 μL 上下游引物、6 μL 滅菌水、10 μLTB Green Premix ExTaq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（2×）（大連寶生物工程有限公司）和0.4 μL ROX ReferenceDye Ⅱ，以UBQ為內參基因校正表達量[24]。采用2?ΔΔCT法[25]分析數(shù)據。所測基因表達量為其相對表達水平，以RrCDPK 測定值/UBQ測定值表示，每個數(shù)據3 次重復，并取其平均值。1.2.6 數(shù)據處理各處理設置3 次生物學重復、3 次技術重復。使用SPSS 26 軟件進行方差分析，用Duncan 法進行差異顯著性分析。使用WPS進行數(shù)據處理并作圖。

2 結果與分析

2.1 刺梨CDPK 基因家族成員的鑒定及基本特征分析

通過與34 個AtCDPK 基因的蛋白序列進行比對及保守結構域篩選，共鑒定出16 個RrCDPK基因家族成員，并基于其染色體定位（圖1），依次命名為RrCDPK1～16。16 個RrCDPK基因不均等地分布在刺梨的6 條染色體上，4 號染色體沒有成員定位，而1號和7 號染色體上數(shù)量最多，為4 個。RrCDPKs 為親水性蛋白，基因長度在1496（RrCDPK6）～5524（RrCDPK14）bp 之間，編碼蛋白質長度在393（RrCDPK6）～561（RrCDPK16）aa，蛋白分子質量介于44.02（RrCDPK6）～62.98（RrCDPK16）ku 之間，各成員的蛋白長度及分子質量差異較小；除RrCDPK5/8 為堿性蛋白外，其余成員的蛋白等電點都小于7，為酸性蛋白；RrCDPK1/4/11/12/14/15 屬于不穩(wěn)定蛋白，其他RrCDPK 成員均為穩(wěn)定蛋白（表2）。亞細胞定位預測結果（表3）顯示，RrCDPKs 在細胞核、細胞骨架、細胞膜和多種細胞器中均有定位，主要定位在細胞質中。

2.2 系統(tǒng)進化及結構特征分析

為研究刺梨CDPK蛋白家族的進化關系，以擬南芥、水稻、草莓和蘋果的CDPK蛋白序列為參考進行系統(tǒng)進化樹的構建，其中草莓及蘋果的CDPK家族是通過與RrCDPK 家族同樣的鑒定方式，分別得到36 和34 個成員。聚類結果顯示，RrCDPK家族可分為4 個亞家族（圖2）。亞家族Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中均有5個RrCDPK 成員，分別為RrCDPK6/10/11/14/15、RrCDPK1/3/4/7/12、RrCDPK2/8/9/13/16，而亞家族Ⅳ中僅包括1 個RrCDPK5 成員。進一步觀察可知，與刺梨CDPK家族親緣關系最近的是草莓，其次是蘋果，較遠的是擬南芥和水稻。

為了更直觀地了解刺梨CDPK基因家族成員的結構特征，分析了刺梨該家族的基因結構、保守基序和保守結構域（圖3），結果表明，同一亞家族的成員基因結構較為相似，外顯子數(shù)量為2～10 個，其中RrCDPK6 最少（2 個），RrCDPK5 最多（10 個）。刺梨CDPK家族成員都含有2 個高度保守的結構域[Pkinase（即Ser/Thr 蛋白激酶）和EF-hand 結構域]，以及6 個保守基序（motif），且親緣關系越近的成員，結構域及基序的數(shù)量和排列也越相似。

2.3 啟動子順式作用元件分析

基因啟動子區(qū)域的順式作用元件影響基因的表達模式。為了解RrCDPK基因家族成員的啟動子序列功能，對啟動子上游2000 bp 序列進行預測，結果如圖4 所示。RrCDPKs上游均具有大量的基本起始元件CAAT-box 和TATA-box，功能分別為啟動子和增強子元件、核心啟動子元件，符合真核生物特點。除RrCDPK16 啟動子不含光響應元件外，其余成員啟動子都含有或多或少的光響應元件，表明在光響應中發(fā)揮著重要作用。生長素（auxin，IAA）、赤霉素（gibberellin，GA）、水楊酸（salicylic acid，SA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）以及茉莉酸甲酯（methyljasmonate，MeJA）5 種激素響應元件在RrCDPKs 啟動子區(qū)普遍存在但又有差異，僅RrCDPK1/2/3/8/9/11/12 啟動子區(qū)有生長素響應元件，而RrCDPK2/3/4/6/7/8/14、6/11/16、10/13 啟動子區(qū)分別不存在水楊酸、脫落酸及赤霉素響應元件。RrCDPKs 還含有4種脅迫應答元件：防御和壓力脅迫、低溫脅迫、厭氧誘導及缺氧特異性誘導的應答元件。尤為突出的是，僅RrCDPK6/13 啟動子無厭氧誘導應答元件，RrCDPK1 啟動子具有缺氧特異性誘導有關的類增強子元件。RrCDPKs還含有轉錄因子結合位點：干旱誘導有關（不含RrCDPK1/6/8/10/16）、參與黃酮類生物合成基因調控（RrCDPK1/11）、光響應（RrCDPK1/4/9/15/16）的MYB結合位點。此外，RrCDPKs含有多種與植物生長發(fā)育相關的應答元件，其中光敏色素下調表達、種子特異性調節(jié)、參與胚乳表達的應答元件分別為RrCDPK7、RrCDPK3、RrCDPK3/4啟動子所特有。匯總可知，RrCDPK15 啟動子含有的順式作用元件種類及數(shù)目均相對較多，暗示較其他成員可能參與更多的生長發(fā)育過程。

2.4RrCDPKs的時空表達特點

為了解刺梨CDPK基因家族成員的時空表達特點，繪制了RrCDPKs在刺梨不同組織（莖、葉、花、30 d的果實）和果實不同發(fā)育時期（花后30、60、90 d）的表達模式熱圖。由圖5-A可知，RrCDPKs 在刺梨不同組織中有明顯的表達差異：RrCDPK2/6/16 在花中高表達，RrCDPK3/5/10/13 在莖中高表達，RrCDPK11/12 在果中高表達，RrCDPK4/8/9/15 在葉中高表達，RrCDPK1/7/14 在所測組織中的表達量均不高。由圖5-B 可知，RrCDPK1/10/12/14 在果實發(fā)育前期表達量最高，中后期表達下調；僅RrCDPK7 在果實發(fā)育中期表達量最高；RrCDPK2/8/11/15 的表達隨果實的發(fā)育而不斷上調，以至在后期表達最高；RrCDPK3/4/5/13/16 在果實發(fā)育前期和果實膨大期的表達量都較高；僅RrCDPK6/9 除在果實發(fā)育中期表達下調，其余兩個時期表達量都稍高。

以上結果表明，刺梨RrCDPK 基因的表達具有時空表達特異性，在不同組織器官和刺梨果實不同發(fā)育時期發(fā)揮著重要的作用。

2.5RrCDPKs對不同供鈣水平的響應

筆者在本試驗中探索了所有刺梨RrCDPK基因家族對供鈣水平的響應，結果如圖6所示，以0 mmol·L-1鈣處理為對照，發(fā)現(xiàn)供鈣后，少數(shù)RrCDPKs 表現(xiàn)出明顯的上調效應：0.5 mmol·L-1鈣水平下，培養(yǎng)1 d后，葉中2 個基因（RrCDPK4/8）表達量顯著提高（p＜0.05），培養(yǎng)7 d 后，根中2 個基因（RrCDPK1/2）表達量顯著提高；2 mmol·L-1鈣水平下，培養(yǎng)1 d 后，葉中3 個基因（RrCDPK4/10/12）、根中RrCDPK9 表達量顯著提高，培養(yǎng)7 d 后，葉中RrCDPK9、根中RrCDPK2 表達量顯著提高。表明這些基因在應對不同供鈣水平時發(fā)揮了重要作用。此外，RrCDPKs對鈣水平的響應隨著培養(yǎng)時間延長而逐漸發(fā)生變化，如隨著培養(yǎng)時間延長，RrCDPK3 在葉中的上調表達效應增強，而RrCDPK5/7 在葉中的上調表達效應減弱，RrCDPK13/15/16 在根中的上調表達效應增強，而RrCDPK6/10/11/12/14 在根中的上調效應減弱，說明在不同階段響應鈣水平的RrCDPKs 基因不同；且比較各基因在2 種組織中的相對表達量可知，RrCDPKs 在葉和根中對鈣水平的敏感性不同，特別是RrCDPK6/16 在葉中低表達，與圖5-A 的表達模式吻合。

3 討論

鈣依賴性蛋白激酶（CDPKs）作為植物中廣泛存在的一類絲氨酸/蘇氨酸型蛋白激酶，具有Ca2+傳感器和應答器的雙重功能，可調節(jié)植物生長發(fā)育并誘導對環(huán)境脅迫的保護性反應[5-6]。其由多基因家族編碼，首次被Hetherington 等[26]發(fā)現(xiàn)于豌豆（Pisumsativum）中，迄今已在多種植物中被鑒定。筆者在本研究中通過生物信息學方法，在刺梨基因組中鑒定出16 個RrCDPKs 成員。本研究中亞細胞定位預測，發(fā)現(xiàn)RrCDPKs 表現(xiàn)出多樣化亞細胞分布，包括細胞質、細胞核、細胞骨架、細胞膜和多種細胞器，與Harper 等[27]的研究一致。此外，有證據表明一些CDPK基因可以改變位置以響應壓力，如在冰植物（Mesembryanthemum crystallinum）葉中表達的Mc-CPK1 的異構體顯示出從質膜到細胞核定位的明顯轉變，以應對鹽脅迫或脫水脅迫[28]。本研究顯示RrCDPKs的內含子數(shù)目較多，除RrCDPK6 僅1 個內含子外，其他成員均含5個內含子以上。趙娟等[29]發(fā)現(xiàn)，更多內含子的存在可能會通過可變剪接和外顯子重排而增加CDPK基因的功能多樣性。因此推測亞細胞分布的多樣性及較多的內含子數(shù)目會使RrCDPKs功能增多。CDPK有4 個典型的結構域，保守的激酶結構域是Ser/Thr蛋白激酶的典型特征[30]。鈣傳感器主要依賴于Ca2+與EF-hand 基序的結合，該基序高度保守，且蛋白質中EF-hand基序對的存在能夠增強對鈣的穩(wěn)定性和親和力[31]。本研究表明RrCDPKs都含有2個高度保守的結構域：Pkinase（即Ser/Thr蛋白激酶）和EF-hand 結構域，以及6 個保守基序，且RrCDPKs的結構域和基序在組成及排列順序上基本一致，這表明RrCDPKs在進化上相對保守。

本研究的系統(tǒng)進化分析顯示RrCDPKs 與眾多植物[10-17]一樣可歸為4 個亞家族，表明物種之間仍存在一定共性。其中亞家族Ⅳ僅包括1 個成員RrCDPK5，與其他植物Ⅳ亞族中成員數(shù)量少的特征一致，如28 個薄殼山核桃和25 個山核桃CDPKs中Ⅳ亞族均僅2 個[29]。靳燕等[16]發(fā)現(xiàn)，CDPK最早存在于衣藻中，隨著基因組的擴張，逐步出現(xiàn)于裸子植物、被子植物中，衣藻的2 個CDPK基因都位于Ⅳ亞族，Ⅳ亞族的CDPKs內含子個數(shù)明顯多于其他族，是最早擴張出的。因此，可通過內含子與外顯子的分布情況來分析CDPK基因進化的先后順序。本研究中Ⅳ亞族的外顯子數(shù)最多，與前人研究結果[16]一致，推測為進化最早的RrCDPK 基因。茶樹CsCDPK17 與AtCDPK17 的同源關系最近，能夠不同程度地響應低溫、干旱、滲透脅迫[32]，而本試驗中RrCDPK1 和AtCDPK17 也同屬于一個分支，且RrCDPK1 啟動子含有低溫響應元件和缺氧特異性誘導有關的類增強子元件，說明RrCDPK1 可能參與低溫響應。CDPK家族是植物有效響應和增強對非生物和生物脅迫的抵抗力的基本組成部分之一[33]。據報道，二穗短柄草中CDPK14 基因參與了植物的抗旱反應[34]。Li等[35]研究發(fā)現(xiàn)，ShCDPK家族成員在冷、干旱脅迫下的表達變化顯著，用VIGS 技術（病毒誘導的基因沉默）使ShCDPK6 和ShCDPK26 基因沉默的植物對寒冷和干旱脅迫的抗逆性降低，筆者推測可能是因為其啟動子中存在大量與防御和干旱脅迫相關的順式作用元件。刺梨CDPK家族成員是否參與調控植物對抗生物和非生物脅迫尚未可知。因此，筆者在本研究中分析了RrCDPKs啟動子的順式作用元件，發(fā)現(xiàn)RrCDPKs 含有防御和壓力脅迫、低溫脅迫、厭氧誘導及缺氧特異性誘導的應答元件，這表明刺梨CDPK可能響應逆境脅迫。此外，還發(fā)現(xiàn)激素響應元件在RrCDPKs 中普遍存在，特別是脫落酸及赤霉素。有研究表明，AtCPK10 通過ABA和Ca2+信號通路參與氣孔運動的調節(jié)，可能在植物響應干旱脅迫中發(fā)揮重要作用[36]。Li 等[37]研究表明，CDPKs 參與了多種激素的串擾，并且同源基因參與了甘薯及其兩個二倍體近緣種的不同激素通路。因此，RrCDPKs也可能通過激素信號途徑和Ca2+信號通路以響應環(huán)境脅迫。

CDPKs 廣泛存在于各種植物組織中。本研究中利用轉錄組數(shù)據分析了RrCDPKs 在刺梨不同組織（莖、葉、花、30 d 的果實）和果實不同發(fā)育時期（花后30、60、90 d）的表達模式，發(fā)現(xiàn)在刺梨的莖、葉、花、不同發(fā)育時期的果實中都可檢測到RrCDPKs的表達，且各有不同，表明其成員不同程度地參與刺梨營養(yǎng)生長及生殖生長。Frattini 等[38]研究發(fā)現(xiàn)水稻OsCDPK2 在葉片對光的響應中起作用，OsCDPK2蛋白在暴露于光的綠葉中幾乎檢測不到，但轉移到黑暗時水平急劇上升。本試驗中RrCDPK1/4 基因的啟動子都包含光響應元件和光響應的MYB結合位點，且都與OsCDPK2 位于Ⅱ亞族，RrCDPK1 在葉中表達量不高，RrCDPK4 在葉中高表達，因此，RrCDPK1/4 可能協(xié)同參與應對外界的光變化。Martins 等[39]近幾年研究發(fā)現(xiàn)鈣對類黃酮的產生有顯著影響，能促進槲皮素類黃酮醇的含量增加；外源鈣處理的花生中類黃酮含量增加[40]。RrCDPK11 啟動子包含參與黃酮類生物合成基因調控的MYB結合位點，且在果實發(fā)育后期高表達，與類黃酮化合物的積累趨勢[41]一致。因此，筆者推測RrCDPK11 參與了刺梨調控類黃酮化合物的合成，且其機制可能與Ca2+信號有關。

大量研究表明，CDPK 通過EF-hand 結構感知Ca2+濃度的變化，解除自我抑制，激活激酶結構域，進而傳遞信息調節(jié)植物的生理變化，廣泛參與植物的生長發(fā)育和形態(tài)建成[7，30]。由于EF-hand 基序數(shù)量和氨基酸序列的變化，CDPK對Ca2+的親和力可能不同[42]。而本研究經結構域分析，發(fā)現(xiàn)RrCDPKs 所含EF-hand 結構域數(shù)目相差無幾。因此，筆者進一步研究了刺梨CDPKs對鈣離子的響應，與楊婳若等[43]處理相似，但經過前期試驗摸索發(fā)現(xiàn)實生苗比扦插苗耐受更高濃度的hoagland 營養(yǎng)液和鈣水平，因此本試驗所選供鈣水平適宜于后續(xù)試驗及分析。同樣，取樣時間的選擇也至關重要，本試驗參考前人研究[18，44-45]發(fā)現(xiàn)響應金屬離子的文獻中取樣時間有長有短，短期的多數(shù)為1 d，長期的多數(shù)為7 d。本試驗結果發(fā)現(xiàn)RrCDPKs 對鈣的響應隨著培養(yǎng)時間延長而逐漸發(fā)生變化，表明RrCDPKs對長期和短期的鈣處理的響應機制不同，這與張習敏[17]的研究討論一致，也進一步驗證了取樣時間的合理性。本研究以0 mmol·L-1鈣處理為對照，發(fā)現(xiàn)供鈣后，少數(shù)RrCDPKs表現(xiàn)出明顯的上調效應，分析可知，葉中RrCDPK4/8、根中RrCDPK1/2，葉中RrCDPK4/9/10/12、根中RrCDPK2/9 分別在0.5、2 mmol·L-1鈣水平下表現(xiàn)出顯著的上調表達響應，表明這些基因在應對不同供鈣水平時發(fā)揮了重要作用。周衛(wèi)等[46]研究發(fā)現(xiàn)植物主要通過根系吸收鈣，通過葉片的蒸騰拉力將鈣運輸至地上部提供營養(yǎng)。本研究結果表明，刺梨RrCDPKs 家族可響應外界缺鈣脅迫和鈣濃度變化，可能通過誘導植株對鈣吸收及運輸以維持植株正常的生理功能，但其具體機制還有待研究。進一步分析可知，RrCDPKs 在葉和根中對鈣水平的敏感性不同，如RrCDPK6/16 在葉中低表達，與其組織表達模式相吻合，這一定程度上說明RrCDPKs基因表達屬于器官依賴型，與其他物種的研究結論一致[17]。也有研究總結，盡管目前所有被發(fā)現(xiàn)的CDPK都含有與Ca2+結合的EF-hand 結構域，但并不是每個CDPK的激酶活性都完全受Ca2+調控。如，擬南芥中至少有6 個成員（CPK7/8/10/13/25/30）的激酶活性基本上不受Ca2+調控，研究發(fā)現(xiàn)在沒有Ca2+存在時，它們就已有較高的激酶活性；CPK32 的活性部分受Ca2+調控[47]。由本研究可知刺梨RrCDPK1/2 基因對缺鈣的敏感性不如其他成員，尤其RrCDPK1 與擬南芥CPK7/8 同屬于一個進化分支，推測其激酶活性基本不受Ca2+調控。因此，這些鑒定的刺梨鈣依賴性蛋白激酶在響應不同供鈣水平時發(fā)揮的作用不盡相同，為后續(xù)探明刺梨對外界鈣環(huán)境的響應機制提供了相關信息。

4 結論

在刺梨全基因組中，共鑒定出16 個刺梨RrCDPK家族成員，所有成員均具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和EF-hand 結構域。通過構建系統(tǒng)進化樹，獲得4 個亞家族，亞族內成員間具有高度保守性，而各亞族成員間的序列和結構特征存在一定差異，進一步發(fā)現(xiàn)與刺梨CDPK家族親緣關系最近的是草莓，其次是蘋果，較遠的為擬南芥和水稻。各基因成員啟動子順式作用元件預測它們大多含有光響應元件、多種激素響應元件及脅迫響應元件等。不同器官及果實發(fā)育時期的轉錄組數(shù)據顯示RrCDPKs 具有時空表達特異性。RrCDPKs 對不同供鈣水平的表達響應試驗表明，以0 mmol·L-1無鈣處理為對照，0.5 mmol·L- 1鈣水平下RrCDPK1/2/4/8 表達顯著上調，2 mmol·L-1鈣水平下RrCDPK2/4/9/10/12 表達顯著上調；RrCDPKs在葉和根中對供鈣水平及處理時間的表達響應也不同。研究結果為后續(xù)探明CDPK家族在刺梨對外界鈣環(huán)境的響應機制提供了相關信息。

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