高書芬 蘇 彬 李玉明 胡金朋

子癇前期是女性妊娠期特有的疾病,也是圍生兒及孕產(chǎn)婦發(fā)生率與病死率的主要原因之一,其危險(xiǎn)因素主要包括子宮胎盤功能障礙、自身免疫性疾病、葡萄胎、營(yíng)養(yǎng)缺乏等[1]。而子癇前期對(duì)胎盤的影響會(huì)導(dǎo)致醫(yī)源性早產(chǎn)、死產(chǎn)、羊水過少、宮內(nèi)生長(zhǎng)受限等;同時(shí),子癇前期也會(huì)造成母體慢性高血壓、缺血性心臟病、肝腎衰竭等,也是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦死亡的主要原因,僅次于出血[2]。研究顯示,子癇前期可能與滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲性功能障礙具有相關(guān)性[3]。而長(zhǎng)鏈非編碼 RNA(long noncoding RNA,lncRNA) 是位于胞核或胞質(zhì)中大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA,研究顯示,lncRNA與滋養(yǎng)細(xì)胞的功能具有重要的相關(guān)性[4]。子癇前期患者與正常妊娠患者比較,其胎盤中存在大量的差異性lncRNA,上調(diào)的lncRNA大約有15646個(gè),下調(diào)的lncRNA大約有13178個(gè),提示子癇前期可能與lncRNA具有相關(guān)性[5]。本研究通過前期先進(jìn)行l(wèi)ncRNA 高通量測(cè)序檢測(cè),篩選出兩組患者中l(wèi)ncRNA差異表達(dá)最大的為lncRNA,并擬進(jìn)一步分析該差異lncRNA在滋養(yǎng)層細(xì)胞細(xì)胞功能中調(diào)控的分子機(jī)制,從而探討其調(diào)控子癇前期的分子機(jī)制。

資料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料:選取2018年1～6月收治的子癇前期患者與健康產(chǎn)婦(各15例患者),設(shè)為子癇前期組與健康對(duì)照組。子癇前期組納入標(biāo)準(zhǔn):①孕產(chǎn)婦自然受孕且為單胎妊娠;②24h尿蛋白>0.3g或隨機(jī)尿蛋白>1+;③妊娠 20 周后收縮壓≥140mmHg和(或)舒張壓≥90mmHg;④無蛋白尿,但新發(fā)高血壓伴以下任一情況:肝功能損害、腎功能不全、視覺異常或神經(jīng)系統(tǒng)異常、血小板減少癥、肺水腫。健康對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn):妊娠過程正常,胎兒發(fā)育正常,且無其他合并癥或并發(fā)癥。排除標(biāo)準(zhǔn):①非自然受孕或多胎妊娠;②胎膜早破;③胎兒發(fā)育畸形或或羊水過多;④合并其他疾病;⑤胎盤位置或形態(tài)異常;⑥產(chǎn)后3個(gè)月患者依然高血壓。本研究經(jīng)筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審批通過(倫理學(xué)審批號(hào):武人倫2017003)。

每組產(chǎn)婦中各隨機(jī)選取9例患者胎盤組織進(jìn)行高通量測(cè)序檢測(cè),篩選出表達(dá)差異最大的lncRNA ENST00000492363用于進(jìn)一步的臨床研究。其他實(shí)驗(yàn)材料還包括JEG-3細(xì)胞和HTR-8/Svneo細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)北納生物科技有限公司;lncRNA ENST00000492363表達(dá)載體和空載購(gòu)自中國(guó)中洪博元生物技術(shù)有限公司。

2.引物設(shè)計(jì)即熒光定量PCR檢測(cè):剖宮產(chǎn)取出胎盤樣本后,進(jìn)行清洗,并在30min內(nèi)保存保存至-80℃冰箱中。通過數(shù)據(jù)庫(kù)獲得如下基因序列(表1),通用生物系統(tǒng)有限公司合成引物。熒光定量PCR檢測(cè):提取胎盤RNA組織后,利用紫外分光光度儀分別在A260和A280下分別進(jìn)行計(jì)算數(shù)據(jù),并計(jì)算RNA純度及濃度:RNA濃度=A260×4(ng/μl),RNA純度=A260/280(均在1.8～2.1范圍內(nèi))。進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄后,最后進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。

表1 基因序列及退火溫度

3.構(gòu)建lncRNA ENST00000492363過表達(dá)載體:①構(gòu)建載體:查找基因序列后引入酶切位點(diǎn)(EcoRⅠ:GAATTC;BamHⅠ:GGATCC),合成目的基因片段后連接于pcDNA3.1(+)載體;②質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α,菌液擴(kuò)大培養(yǎng);③去內(nèi)毒素大提質(zhì)粒;④質(zhì)粒酶切驗(yàn)證;⑤JEG-3細(xì)胞和HTR-8細(xì)胞傳代;⑥載體轉(zhuǎn)染:轉(zhuǎn)染后,將JEG3和HTR-8培養(yǎng)細(xì)胞系,各分為3組:過表達(dá)ENST00000492363組(ENST00000492363組)、空白表達(dá)組(NC組)和正常組(control組)。

4.PCR檢測(cè)各組JEG3、HTR-8細(xì)胞中ENST00000492363的表達(dá)水平:收集培養(yǎng)皿中的細(xì)胞,提取RNA后,測(cè)定RNA純度及濃度:分別在A280、A260下測(cè)定數(shù)據(jù),并計(jì)算RNA純度、濃度:RNA純度=A260/280(均在1.8～2.1范圍),RNA濃度=A260×4(ng/μl)。最后RNA反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光定量PCR。

5.CCK-8檢測(cè)各組JEG3、HTR-8細(xì)胞增殖水平:把轉(zhuǎn)染以后JEG3、HTR-8細(xì)胞進(jìn)行孵育后,最后通過酶標(biāo)儀(450nm波長(zhǎng)處)檢測(cè)每孔細(xì)胞的吸光度值(A)。

6.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組JEG3、HTR-8細(xì)胞凋亡水平:各組均分別收集HTR-8、JEG3細(xì)胞(1～3)×106個(gè),加入PBS離心后洗2遍,用Binding buffer將細(xì)胞重懸,再加入PI-PE以及Annenxin V-FITC,混勻后孵育10min,再加入Binding buffer,混勻后通過流式儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行凋亡檢測(cè)。

7.劃線實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組JEG3、HTR-8細(xì)胞的遷移能力:使用10μl槍頭對(duì)每孔劃痕,PBS清洗3次后更換為無血清培養(yǎng)基,先對(duì)每孔的劃痕拍照,培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后再次進(jìn)行拍照。分別測(cè)量0h及48h的劃痕寬度,計(jì)算細(xì)胞的遷移速率[(0h劃痕寬度-48h劃痕寬度)/48h]。

8.Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組JEG3、HTR-8細(xì)胞侵襲能力:將轉(zhuǎn)染細(xì)胞離心,用培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸并計(jì)數(shù),每個(gè)小室細(xì)胞數(shù)為3×104個(gè);在下室內(nèi)加入完全培養(yǎng)基,上室細(xì)胞與培養(yǎng)基體積共約為300μl;48h后加入結(jié)晶紫染液,靜置后擦去內(nèi)室細(xì)胞拍照,最后洗脫后對(duì)小室染色水平進(jìn)行檢測(cè)。

9.Western blot法檢測(cè)各組JEG3、HTR-8細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達(dá)水平:提取各組細(xì)胞的蛋白:加入細(xì)胞裂解液放置20min,將細(xì)胞刮到一側(cè)后吸入EP管內(nèi),離心后的上清液中加入緩沖液,沸水煮5min測(cè)定各組蛋白濃度:將BSA標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)蛋白樣品分別加入不同管,分別再加入工作液BCA,混勻后孵育30min,通過全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品BSA及不同樣品的吸光度值,最后計(jì)算樣品內(nèi)蛋白濃度。

10.各組蛋白電泳至曝光:把架子置入電泳液中,拔去齒梳后加入蛋白樣品及marker;加入電泳液浸沒膠板后開始電泳;剪好PVDF膜裁,甲醇激活;切好含有內(nèi)參或目的條帶的膠;按順序依次將海綿-濾紙-膠-膜-濾紙-海綿放好,并進(jìn)行轉(zhuǎn)膜;使用脫脂牛奶封閉液封閉1h;加入一抗后過夜孵育;洗膜3次后加入二抗,孵育2h;洗膜3次后用發(fā)光液浸濕PVDF膜,最后顯影成像。

結(jié) 果

1.正常妊娠和臨床子癇前期患者胎盤組織的ENST00000492363表達(dá):與健康對(duì)照組比較,子癇前期組的胎盤組織中ENST00000492363的表達(dá)顯著降低(P<0.05),詳見圖1。

圖1 PCR檢測(cè)胎盤組織中l(wèi)ncRNA ENST00000492363的表達(dá)結(jié)果

2.滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR-8及JEG3中l(wèi)ncRNA ENST00000492363過表達(dá)水平:PCR檢測(cè)ENST00000492363表達(dá)與過表達(dá)結(jié)果如圖2所示。HTR-8細(xì)胞中,Cq(GAPDH)減去Cq(ENST00000492363)平均值為-17.61;JEG3細(xì)胞中,Cq(GAPDH)減去Cq(ENST00000492363)平均值為-12.67;因此,JEG3細(xì)胞中ENST00000492363的本底表達(dá)是HTR-8中的30.69倍。JEG3和HTR-8細(xì)胞中ENST00000492363表達(dá)載體的表達(dá)情況均良好。

圖2 PCR檢測(cè)ENST00000492363在JEG3、HTR-8細(xì)胞中表達(dá)及過表達(dá)結(jié)果A.ENST00000492363在JEG3細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果;B.ENST00000492363在HTR-8細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果。與control組比較,*P<0.05;與NC組比較,#P<0.05

3.ENST00000492363過表達(dá)對(duì)JEG3或者HTR-8細(xì)胞生長(zhǎng)的影響:CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示,ENST00000492363組過表達(dá)的細(xì)胞增殖水平顯著低于NC組及control組,表明ENST0000049236顯著抑制細(xì)胞增殖水平(圖3)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,ENST00000492363組過表達(dá)的細(xì)胞凋亡率顯著高于NC組及control組,表明ENST0000049236促進(jìn)細(xì)胞凋亡(圖4)。

圖3 各組細(xì)胞48h增殖水平CCK-8檢測(cè)結(jié)果A.各組JEG3細(xì)胞48h增殖水平CCK-8檢測(cè)結(jié)果比較;B.各組HTR-8細(xì)胞48h增殖水平CCK-8檢測(cè)結(jié)果比較。與control組比較,*P<0.05;與NC組比較,#P<0.05

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組JEG3、HTR-8細(xì)胞凋亡水平的結(jié)果A.各組JEG3細(xì)胞凋亡率的比較;B.各組HTR-8細(xì)胞凋亡率的比較。與control組比較,*P<0.05

4.JEG3、HTR-8細(xì)胞中過表達(dá)ENST00000492363對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響:劃線實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示,過表達(dá)ENST00000492363組的劃線痕跡愈合速度顯著低于NC組及control組,表明過表達(dá)ENST00000492363顯著抑制了細(xì)胞遷移能力(圖5)。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示,過表達(dá)ENST00000492363顯著抑制了細(xì)胞侵襲能力(圖6)。

圖5 劃線實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力的結(jié)果A.JEG3細(xì)胞遷移能力比較;B. HTR-8細(xì)胞遷移能力比較。與control組比較,*P<0.05;與NC組比較,#P<0.05

圖6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲能力的結(jié)果A.JEG3細(xì)胞A值的比較;B.HTR-8細(xì)胞A值的比較。與control組比較,*P<0.05;與NC組比較,#P<0.05

5.JEG3或HTR-8細(xì)胞中過表達(dá)ENST00000492363對(duì)E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達(dá)水平的影響:Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示,ENST00000492363過表達(dá)可抑制了細(xì)胞中Vimentin、N-cadherin的表達(dá),并促進(jìn)細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)(圖7)。

圖7 Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中蛋白質(zhì)E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達(dá)水平的結(jié)果A.JEG3細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達(dá)水平的比較結(jié)果;B.HTR-8細(xì)胞中蛋白質(zhì)E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達(dá)水平的比較結(jié)果。與control組比較,*P<0.05;與NC組比較,#P<0.05

討 論

子癇前期是妊娠相關(guān)的多系統(tǒng)疾病之一,是新生兒、胎兒及孕產(chǎn)婦病死率及發(fā)生率的主要原因之一,但其具體機(jī)制還不十分清楚[6]。每年子癇前期分別約占圍生兒及孕產(chǎn)婦死亡的10%、15%[7]。研究顯示,胚胎植入早期的滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡與增殖保持相對(duì)平衡,對(duì)子宮動(dòng)脈重塑具有重要作用,可促進(jìn)血管擴(kuò)張、降低血流阻力,從而有利于血流供應(yīng)并維持正常的侵襲與遷移能力[8]。而子癇前期患者的胎盤出現(xiàn)滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡增加、增殖能力減弱及侵襲性降低,最終引起子宮螺旋動(dòng)脈重塑的異常及胎盤著床淺[9]。因此,滋養(yǎng)層細(xì)胞的異?？赡芘c子癇前期患者的發(fā)病具有相關(guān)性。

近年來研究顯示,lncRNA對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞的功能具有直接的影響。PE患者與正常妊娠的胎盤組織內(nèi)有大量表達(dá)差異的lncRNA,表明lncRNA與子癇前期可能具有一定的相關(guān)性,如子癇前期患者胎盤RPAIN表達(dá)上調(diào)后可通過對(duì)C1q的調(diào)節(jié)而促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡,并抑制其侵襲性,而促進(jìn)子癇前期的發(fā)病[10,11]。而lncRNA PRNCR1表達(dá)上調(diào)則通過對(duì)絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)節(jié),而影響滋養(yǎng)層細(xì)胞的功能[12]。lncRNA STOX2-IT3表達(dá)表達(dá)上調(diào)則通過對(duì)STOX2的表達(dá)調(diào)節(jié),而對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞的分化于侵襲水平產(chǎn)生抑制作用[13]。lncRNA LINC01410高表達(dá)可通過上調(diào)Fas表達(dá),而促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲、增殖[14]。

lncRNA Linc00261高表達(dá)會(huì)通過抑制miR-558表達(dá),間接抑制其對(duì)TIMP金屬肽酶抑制劑4的調(diào)控表達(dá),進(jìn)而降低細(xì)胞的遷移、侵襲[15]。lncRNA uc003fir高表達(dá)則會(huì)與microRNA相互作用,且通過對(duì)CCL5直接調(diào)節(jié)而募集白細(xì)胞釋放的促炎細(xì)胞因子與單核細(xì)胞,進(jìn)而降低滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入子宮肌層[16]。lncRNA SNHG5低表達(dá)則會(huì)減低其對(duì)miR-26a-5p/N-鈣黏蛋白信號(hào)通路的作用,從而抑制細(xì)胞的侵襲、遷移、增殖[17]。lncRNA TUG1低表達(dá)則會(huì)影響MMP2、MCL1、VEGFA的表達(dá),并通過抑制RND3與促進(jìn)Ezh2表達(dá)而抑制螺旋動(dòng)脈重塑,促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡,而減低細(xì)胞的侵襲、遷移、增殖[18]。

本研究通過發(fā)現(xiàn)子癇前期患者的臨床胎盤組織內(nèi)ENST00000492363表達(dá)低于正常胎盤組織,滋養(yǎng)層細(xì)胞系JEG3和HTR-8被用于進(jìn)一步研究。PCR檢測(cè)結(jié)果表明,ENST00000492363在HTR-8細(xì)胞中的本底明顯低于JEG3細(xì)胞。而ENST00000492363過表達(dá)后,HTR-8 與JEG3細(xì)胞凋亡率顯著上升、且細(xì)胞增殖抑制,細(xì)胞的侵襲及遷移能力均顯著下降。另外有研究顯示,上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞的分化、轉(zhuǎn)移具有關(guān)鍵性的作用。本研究通過對(duì)HTR-8 與JEG3細(xì)胞內(nèi)的EMT的標(biāo)志性基因Vimentin、N-cadherin、E-cadherin蛋白質(zhì)的表達(dá)檢測(cè),結(jié)果顯示滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR-8、JEG3中ENST00000492363過表達(dá),會(huì)顯著上調(diào)蛋白質(zhì)E-cadherin的表達(dá),并抑制蛋白質(zhì)Vimentin、N-cadherin的表達(dá),表明ENST00000492363對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞EMT具有顯著的抑制作用,這也進(jìn)一步驗(yàn)證了ENST00000492363對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲、遷移能力的抑制作用。

本研究中ENST00000492363對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖的抑制作用及凋亡的促進(jìn)作用,可能與ENST00000492363對(duì)CASP10基因表達(dá)的促進(jìn)作用相關(guān),進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)caspase-10表達(dá)上升,促進(jìn)細(xì)胞凋亡上升,這也可能是細(xì)胞中EMT被抑制的原因之一。

綜上所述,基因CASP10表達(dá)的lncRNA ENST00000492363對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞有顯著的調(diào)控作用,會(huì)顯著抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲及遷移能力,并抑制上皮-間充質(zhì)的轉(zhuǎn)化過程,同時(shí)可顯著抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。