王加中 曹 罡 劉 陽 陳 碩

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院普通外科,陜西省西安市 710061)

近年來,甲狀腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1-2],其發(fā)病機(jī)制備受關(guān)注,其中基因表達(dá)差異在甲狀腺腫瘤發(fā)病中具有重要作用[3]。β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶7(β-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 7,B3GNT7)是β-3-N乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶家族成員之一,β-3-N乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶參與腫瘤免疫應(yīng)答過程,與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[4-6]。目前有關(guān)B3GNT7基因在甲狀腺癌發(fā)病機(jī)制中的作用研究較少。因此,本文通過生物信息學(xué)方法探討B(tài)3GNT7基因在甲狀腺癌組織與癌旁組織中的表達(dá)差異,并分析其對甲狀腺癌組織免疫細(xì)胞浸潤的影響,為甲狀腺癌發(fā)病機(jī)制的研究提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 B3GNT7在甲狀腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況 在腫瘤免疫評(píng)估資源(Tumor Immune Estimation Resource,TIMER)數(shù)據(jù)庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)的Diff Exp模塊中輸入B3GNT7基因,檢索B3GNT7基因在各類癌組織及其配對的癌旁組織中的表達(dá)情況;在GEPIA2數(shù)據(jù)庫(http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)中檢索并分析B3GNT7基因在甲狀腺癌患者癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況。

1.2 B3GNT7基因在不同臨床特征、病理分期的甲狀腺癌患者癌組織中的表達(dá)情況 在UALCAN數(shù)據(jù)庫(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)的TCGA模塊中輸入B3GNT7基因,分析不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、病理類型、種族的甲狀腺癌患者癌組織中B3GNT7基因的表達(dá)情況;在GEPIA2數(shù)據(jù)庫的Single Gene Analysis模塊中輸入B3GNT7基因,分析不同病理分期的甲狀腺癌患者癌組織中B3GNT7基因的表達(dá)情況。

1.3 B3GNT7基因與甲狀腺癌免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性分析 在TIMER數(shù)據(jù)庫的Survival模塊Gene Symbols項(xiàng)目中輸入B3GNT7基因,腫瘤類型選擇甲狀腺癌,臨床特征選擇年齡、性別、病理類型、腫瘤純度,免疫細(xì)胞選擇B淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞,采用多因素COX風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析B3GNT7基因表達(dá)水平對甲狀腺癌患者預(yù)后的影響;在TIMER數(shù)據(jù)庫Gene模塊Gene Symbols項(xiàng)目中輸入B3GNT7基因,腫瘤類型選擇甲狀腺癌,免疫細(xì)胞選擇B淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞,采用Spearman相關(guān)性模型分析B3GNT7基因表達(dá)水平與免疫細(xì)胞浸潤豐度的相關(guān)性;在TIMER數(shù)據(jù)庫SCNA模塊中分析B3GNT7基因拷貝數(shù)變異與免疫細(xì)胞浸潤豐度的關(guān)系;在TIMER數(shù)據(jù)庫Correlation模塊中分析B3GNT7基因表達(dá)水平與免疫細(xì)胞標(biāo)志物、免疫檢查點(diǎn)基因、不同類型T淋巴細(xì)胞的基因標(biāo)志物表達(dá)水平的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用TIMER、UALCAN、GEPIA2數(shù)據(jù)庫在線數(shù)據(jù)集提供的統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行分析,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 B3GNT7基因在多種腫瘤組織及其配對的癌旁組織中的表達(dá)水平 TIMER數(shù)據(jù)庫信息顯示,相較于配對癌旁組織,B3GNT7基因在膽管癌、甲狀腺癌、子宮內(nèi)膜癌癌組織中呈高表達(dá),在結(jié)腸癌、腎嫌色細(xì)胞癌、腎透明細(xì)胞癌、肝細(xì)胞肝癌、肺腺癌、肺鱗癌、前列腺癌、直腸腺癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌癌組織中呈低表達(dá)(均P<0.05),而在膀胱尿路上皮癌、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、卵巢癌等癌組織中的表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),見圖1。GEPIA2數(shù)據(jù)庫信息顯示,甲狀腺癌患者癌組織中的B3GNT7基因表達(dá)水平高于癌旁組織(P<0.05),見圖2。

圖1 B3GNT7基因在多種癌組織及其配對的癌旁組織中的表達(dá)水平

圖2 B3GNT7基因在甲狀腺癌患者癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平

2.2 B3GNT7基因在不同臨床特征、病理分期的甲狀腺癌患者癌組織中的表達(dá)水平 不同病理分期的甲狀腺癌患者癌組織中的B3GNT7基因表達(dá)水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.026),不同病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、種族的甲狀腺癌患者癌組織中的B3GNT7基因表達(dá)水平比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.506、0.0805、0.367),見圖3。

圖3 B3GNT7基因在不同臨床特征、病理類型的甲狀腺癌患者癌組織中的表達(dá)差異

2.3 B3GNT7基因與免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性分析

2.3.1 B3GNT7基因表達(dá)水平、免疫細(xì)胞表達(dá)水平與甲狀腺癌患者預(yù)后的關(guān)系:多因素COX回歸分析結(jié)果顯示,CD8+T淋巴細(xì)胞、B3GNT7基因表達(dá)水平是甲狀腺癌患者預(yù)后的影響因素(均P<0.05),見圖4。

圖4 免疫細(xì)胞表達(dá)水平、B3GNT7基因表達(dá)水平與甲狀腺癌患者預(yù)后關(guān)系的多因素COX回歸分析

2.3.2 B3GNT7基因表達(dá)水平與免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性:Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示,B3GNT7基因表達(dá)水平與B淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤豐度有關(guān)(均P<0.05),而與腫瘤純度無明顯相關(guān)性(P>0.05),見圖5。B3GNT7基因拷貝數(shù)變異影響B(tài)淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的浸潤豐度,見圖6。

圖5 Spearman相關(guān)性分析圖

圖6 B3GNT7基因拷貝數(shù)變異對免疫細(xì)胞浸潤豐度的影響

2.3.3 B3GNT7基因表達(dá)水平與免疫細(xì)胞標(biāo)志物和T淋巴細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)水平的相關(guān)性分析:Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示,B3GNT7基因表達(dá)水平與CD3D、CD3E、CD2、CD8A、CD8B、CD86、集落刺激因子1受體(colony-stimulating factor 1 receptor,CSF1R)、CD68、干擾素調(diào)節(jié)因子5(interferon regulatory factor 5,IRF5)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶(prostaglandin endoperoxide synthase 2,PTGS2)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶2(inducible nitric oxide synthase 2,iNOS2)、CD163、V-set和免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域4(V-set and immunoglobulin domain containing 4,VSIG4)、癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞附著分子8(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 8,CEACAM8)、整聯(lián)蛋白αM(integrin alpha M,ITGAM)、C-C基序趨化因子受體(C-C motif chemokine receptor,CCR)7、人類白細(xì)胞抗原DPB1(human leukocyte antigen DPB1,HLA-DPB1)的表達(dá)水平均有關(guān)(均P<0.05),見表1。B3GNT7基因表達(dá)水平與T淋巴細(xì)胞標(biāo)志物如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)4、STAT1、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、堿性/螺旋-環(huán)-螺旋蛋白基因(basic helix-loop-helix,bHLH)E40、CD4、人叉頭框蛋白P3(forkhead box P3,FOXP3)、白細(xì)胞介素2受體α(interleukin 2 receptor alpha,IL2RA)、 CCR8、腫瘤壞死因子受體超家族成員9(TNF receptor superfamily member 9,TNFRSF9)、CCR7、L-選擇素(selectin L,SELL)、粒溶酶K(granzyme K,GZMK)、CD69、白細(xì)胞介素7受體(interleukin 7 receptor,IL7R)、甲肝病毒細(xì)胞受體2(hepatitis A virus cellular receptor 2,HAVCR2)的表達(dá)水平均有關(guān)(均P<0.05),見表2。

表1 B3GNT7基因表達(dá)水平與免疫 細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)水平的相關(guān)性分析

表2 B3GNT7基因表達(dá)水平與T淋巴 細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)水平的相關(guān)性分析

2.3.4 B3GNT7基因表達(dá)水平與免疫檢查點(diǎn)基因表達(dá)水平的相關(guān)性分析:Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示,B3GNT7基因的表達(dá)水平面與細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4,CTLA4)的表達(dá)水平密切相關(guān)(P=0.037),與CD274、細(xì)胞程序性死亡蛋白1(programmed cell death protein 1,PDCD1)的表達(dá)水平無明顯相關(guān)性(P=0.418、0.557),見圖7。

圖7 B3GNT7基因與免疫檢查點(diǎn)基因相關(guān)性

3 討 論

近年來,甲狀腺癌發(fā)病率居高不下,乳頭狀癌是其主要的病理類型[7],以手術(shù)為主的綜合治療對甲狀腺乳頭狀癌的效果較好,但對甲狀腺髓樣癌、未分化癌的治療效果欠佳[8]。目前已知多種基因參與甲狀腺癌的發(fā)生與發(fā)展,但其具體機(jī)制仍未完全明確,基因表達(dá)差異、腫瘤微環(huán)境等因素均可能參與甲狀腺癌的發(fā)病過程[9-11]。腫瘤組織由腫瘤細(xì)胞及周圍的微環(huán)境構(gòu)成,腫瘤微環(huán)境包括各種類型的細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì),其中免疫細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中的關(guān)鍵細(xì)胞[12]。腫瘤細(xì)胞可通過調(diào)控基因表達(dá)或者分泌細(xì)胞免疫抑制因子等機(jī)制,影響免疫應(yīng)答信號(hào)通路,發(fā)生腫瘤免疫逃逸,使腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞無法發(fā)揮其抗腫瘤作用[13-15]。腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的浸潤程度是腫瘤發(fā)病機(jī)制研究的熱點(diǎn),各種免疫細(xì)胞及基因檢測方法的發(fā)展使得腫瘤免疫研究進(jìn)入大數(shù)據(jù)時(shí)代,多個(gè)數(shù)據(jù)庫中的基因數(shù)據(jù)集及生物信息分析軟件成為基于生物信息學(xué)方法分析腫瘤發(fā)生與發(fā)展的重要研究手段[16-17]。

B3GNT7是糖基轉(zhuǎn)移酶β-3-N乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶家族8個(gè)亞族成員之一,定位于19q13.2,由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成,其主要功能是催化還原糖蛋白末端N-乙酰半乳糖胺與絲氨酸或蘇氨酸形成的α-糖苷鍵,在人體多種組織中均有表達(dá),有學(xué)者發(fā)現(xiàn)B3GNT7基因與結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[18]。本研究結(jié)果顯示,B3GNT7基因在膽管癌、甲狀腺癌、子宮內(nèi)膜癌等患者的癌組織中呈高表達(dá),且B3GNT7基因表達(dá)與甲狀腺癌患者的病理分期密切相關(guān),在甲狀腺癌發(fā)病機(jī)制中可能起重要作用。本研究的COX回歸模型分析結(jié)果顯示,CD8+T淋巴細(xì)胞、B3GNT7基因表達(dá)水平是甲狀腺癌患者預(yù)后的影響因素(均P<0.05),相關(guān)性分析結(jié)果顯示B3GNT7基因表達(dá)水平與B淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤豐度相關(guān),且與多種免疫細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)水平密切相關(guān),而且B3GNT7基因拷貝數(shù)的變異亦明顯影響CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的浸潤豐度,這表明甲狀腺癌細(xì)胞中B3GNT7基因可能通過某些信號(hào)途徑影響腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的浸潤,引起腫瘤免疫逃逸。研究表明,B3GNT7蛋白可催化還原細(xì)胞表面糖蛋白,通過改變腫瘤細(xì)胞表面特異性糖鏈結(jié)構(gòu),逃避免疫細(xì)胞識(shí)別[19],這可能是B3GNT7基因與腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤豐度密切相關(guān)的原因。

CTLA4是免疫球蛋白超家族的成員,通過與抗原呈遞細(xì)胞上的B7-1結(jié)合,向T淋巴細(xì)胞傳遞免疫抑制信號(hào),與橋本氏甲狀腺炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等多種自身免疫疾病的發(fā)病相關(guān)[20-21]。CTLA4的阻斷抗體伊匹單抗用于黑色素瘤的治療已取得較好的效果,是一種潛在的免疫治療手段[22]。本研究結(jié)果顯示,B3GNT7基因表達(dá)水平與CTLA4表達(dá)水平密切相關(guān),而與CD274、PDCD1表達(dá)水平無明顯相關(guān),這提示CTLA4的阻斷抗體具有成為甲狀腺癌患者免疫治療方式的潛在價(jià)值,而PD1/PDL1免疫療法可能對甲狀腺癌患者的治療效果有限。

綜上所述,本研究通過生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)B3GNT7基因在甲狀腺癌組織中呈高表達(dá),其表達(dá)水平與甲狀腺癌患者的病理分期密切相關(guān),B3GNT7基因與甲狀腺癌組織中B淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的浸潤豐度相關(guān),且與CTLA4表達(dá)密切相關(guān),但其參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞浸潤的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索。