盧 鑫 尹碩鑫 江水玉 李清梅 覃靖燊 張 濤 陳遠(yuǎn)能

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,廣西南寧市 530000;2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院消化內(nèi)科,廣西南寧市 530011)

胃癌是全球第五大常見癌癥,也是第三大常見癌癥死亡原因[1]。世界衛(wèi)生組織2020年發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示,在中國癌癥患者中,胃癌的總患病率和病死率均排名第三[2]。胃癌早期患者癥狀不明顯,多數(shù)患者確診時已是中晚期,給其家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)[3]。中醫(yī)認(rèn)為,胃癌是由于飲食勞傷、情志內(nèi)傷、瘀血內(nèi)阻、熱毒內(nèi)蘊等多種因素綜合作用而發(fā)病,病位在胃,病理因素主要有痰、瘀、毒。扶正培本是中醫(yī)治病的基本原則。對于腫瘤患者,扶正培本是指通過扶助補益與調(diào)節(jié)腫瘤患者的陰陽氣血,改善腫瘤患者“虛證”狀態(tài),從而達(dá)到防治腫瘤的目的[4]。人參享有“百草之王,百藥之長”的美譽,在我國用藥頻率高[5],治療的病種范圍廣,是我國珍貴的中藥之一。人參為大補元氣、扶正補益之藥,對胃癌晚期患者大有裨益。有研究顯示,人參含有的人參皂苷等化合物對胃癌細(xì)胞的增殖有抑制作用[6-7]。還有研究顯示,人參皂苷Rh2聯(lián)合阿霉素能夠提高人胃癌阿霉素耐藥性細(xì)胞SGC7901的化療敏感性,可通過阻滯細(xì)胞周期、促進細(xì)胞凋亡,進而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[8]。但人參防治胃癌的機制可能是多成分通過多靶點、多通路調(diào)控細(xì)胞周期、促進細(xì)胞凋亡。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法結(jié)合分子對接技術(shù)探討人參治療胃癌的作用機制,以期為傳統(tǒng)中藥人參在胃癌治療中的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 人參有效化學(xué)成分及其相應(yīng)作用靶點的篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP;http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索“人參”的化學(xué)成分,并設(shè)置藥物相似性(drug-likeness,DL)≥0.18、口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥15%為有效化學(xué)成分的篩選標(biāo)準(zhǔn)。將符合條件的有效化學(xué)成分輸入TCMSP,得到有效化學(xué)成分的相應(yīng)作用靶點,剔除尚未明確相應(yīng)作用靶點的有效化學(xué)成分。將限定物種設(shè)置為人類[9],再利用UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)將靶點名稱轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)基因名,根據(jù)對應(yīng)靶點數(shù)目由多到少、OB由高到低、DL由高到低將有效化學(xué)成分進行綜合排序,以排名前5的有效化學(xué)成分作為人參主要有效化學(xué)成分。

1.2 胃癌相關(guān)靶點的篩選 以“gastric cancer”“gastric carcinoma”為關(guān)鍵詞,分別在GeneCards?數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com/)、OMIM?數(shù)據(jù)庫(https://www.omim.org/)檢索胃癌相關(guān)靶點,檢索時間為建庫至2021年10月,以Relevance score>9為標(biāo)準(zhǔn)對GeneCards?數(shù)據(jù)庫檢索到的靶點進行進一步篩選,再將3個數(shù)據(jù)庫得到的靶點導(dǎo)入Microsoft Excel表格中進行格式調(diào)整、標(biāo)準(zhǔn)基因名轉(zhuǎn)換等標(biāo)準(zhǔn)化處理,刪除重復(fù)的靶點,獲得胃癌相關(guān)靶點,利用UniProt數(shù)據(jù)庫將靶點名稱轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)基因名。

1.3 “人參-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將人參的有效化學(xué)成分及其相應(yīng)作用靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2(https://cytoscape.org/download.html)中,并利用Network Analyzer插件的Merge功能繪制成“人參-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)。運用Venny 2.1.0軟件(http://www.bioinformatics.com.cn/)繪制韋恩圖,從而獲取人參有效化學(xué)成分作用靶點、胃癌相關(guān)靶點的共有靶點(即交集靶點)。

1.4 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將交集靶點上傳至STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/),將置信度設(shè)置為>0.400,獲取蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò),并保存為TSV格式文件。將該PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2進行可視化處理及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析,根據(jù)介數(shù)中心性(betweenness centrality,BC)、接近中心性(closeness centrality,CC)、度值等拓?fù)鋮?shù)篩選核心靶點,根據(jù)篩選結(jié)果構(gòu)建核心靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 功能富集分析與通路富集分析 為進一步探究人參治療胃癌所涉及的生物過程、分子功能、細(xì)胞組分及信號通路,將交集靶點上傳至Metascape平臺(http://metascape.org/),限定物種設(shè)置為人類[9],進行基因本體論(Gene Ontology,GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析。根據(jù)Benjamini-Hochberg校正法,設(shè)定P<0.01,根據(jù)-lgP值由大到小對富集分析結(jié)果進行排序,篩選出排名前20的生物過程、細(xì)胞組分、分子功能和信號通路。同時將人參有效化學(xué)成分、交集靶點、KEGG通路富集分析數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2進行可視化處理,繪制“人參成分-交集靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 分子對接 在TCMSP數(shù)據(jù)庫下載人參的主要有效化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)并保存為MOL2格式;參考文獻[10-13],選取與胃癌相關(guān)性較高的核心靶點,在PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)下載這些核心靶點的RCSB PDB格式數(shù)據(jù)文件;借助AutoDock Tools軟件對主要有效化學(xué)成分和上述核心靶點的結(jié)構(gòu)進行去水、加氫、計算電荷等處理,然后對兩者進行分子對接分析。當(dāng)結(jié)合能<0 kcal/mol時,配體即可自發(fā)與受體結(jié)合,當(dāng)結(jié)合能<-4.0 kcal/mol時,說明受體與配體結(jié)合良好。

2 結(jié) 果

2.1 人參有效化學(xué)成分及其相應(yīng)作用靶點的篩選結(jié)果 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫初步獲取人參的化學(xué)成分共190個,以DL≥0.18、OB≥15%為標(biāo)準(zhǔn)篩選得到人參的有效化學(xué)成分58個,剔除未找到相應(yīng)作用靶點的化學(xué)成分后獲得人參有效化學(xué)成分共24個,根據(jù)靶點數(shù)目由多到少、OB由高到低、DL由高到低進行綜合排序后得到的主要有效化學(xué)成分為人參皂苷Rh2、人參皂苷Rh4、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇,基本信息見表1。應(yīng)用UniProt數(shù)據(jù)庫將上述24個有效化學(xué)成分對應(yīng)的279個靶點轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)基因名,剔除不符合條件的靶點,最終得到作用靶點117個。將人參有效化學(xué)成分及相應(yīng)作用靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化處理,得到“人參-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖,該網(wǎng)絡(luò)由302條邊、142個節(jié)點組成,見圖1。

表1 人參有效化學(xué)成分基本信息表

圖1 “人參-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)

2.2 胃癌相關(guān)靶點的篩選結(jié)果 在GeneCards?數(shù)據(jù)庫中獲得胃癌相關(guān)靶點1 523個、在DRUGBANK數(shù)據(jù)庫中獲得胃癌相關(guān)靶點75個、在OMIM?數(shù)據(jù)庫中獲得胃癌相關(guān)靶點498個,將3個數(shù)據(jù)庫獲得的相關(guān)靶點去重后合并,共獲得胃癌相關(guān)靶點1 921個。將1 921個胃癌相關(guān)靶點與117個人參有效化學(xué)成分的作用靶點取交集,共獲得60個交集靶點,即人參治療胃癌的相關(guān)靶點。見圖2。

圖2 人參有效化學(xué)成分作用靶點與胃癌相關(guān)靶點的韋恩圖

2.3 人參治療胃癌相關(guān)靶點的PPI網(wǎng)絡(luò) 利用STRING 11.0及Cytoscape 3.7.2構(gòu)建人參治療胃癌相關(guān)靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)(見圖3),此網(wǎng)絡(luò)由591條邊、60個節(jié)點構(gòu)成,節(jié)點平均BC值為0.662,平均CC值為0.692,平均度值為19.7,根據(jù)BC值、CC值和度值篩選得出21個核心靶點,包括Jun B原癌基因(Jun B proto-oncogene JUN)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)1、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1(signal transducer and activator of transcription,STAT1)、基質(zhì)金屬蛋白酶9、Caspase-3、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β、過氧化物酶體增殖物激活受體、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)8等,見表2。構(gòu)建核心靶點的PPI網(wǎng)絡(luò),該網(wǎng)絡(luò)由187條邊、21個節(jié)點組成,見圖4。

圖3 人參治療胃癌相關(guān)靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

表2 拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果

圖4 核心靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 交集靶點的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果 將60個交集靶點上傳至Matescape平臺進行GO功能富集分析(P<0.01),得到1 211個生物過程、32種細(xì)胞組分、88種分子功能,以-lgP值排名前20的條目建立氣泡圖,見圖5。其中,生物過程條目以凋亡信號通路、活性氧的代謝過程、對脂多糖的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、上皮細(xì)胞遷移等為主;細(xì)胞組分條目以薄膜筏、膜微區(qū)、等離子膜筏、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、細(xì)胞外基質(zhì)、外部封裝結(jié)構(gòu)等為主;分子功能條目以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚化活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性、激酶結(jié)合等為主。

將60個交集靶點上傳至Matescape平臺進行KEGG通路富集分析(P<0.01),得到247條信號通路,-lgP值排名前20的主要信號通路包括癌癥相關(guān)通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、乙型肝炎、IL-17信號通路、TNF信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/AKT信號通路、MAPK信號通路等,見表3和圖5。將人參有效化學(xué)成分、交集靶點、KEGG通路富集分析數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件處理得到“人參成分-交集靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖,見圖6。

表3 交集靶點的KEGG通路富集分析(排名前20)

圖5 交集靶點的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果

圖6 人參成分-交集靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 分子對接結(jié)果 將人參5個主要有效化學(xué)成分,即人參皂苷Rh2、人參皂苷Rh4、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇,分別與核心靶點AKT1、JUN、TNF、PTGS2、Caspase-3、MAPK8進行分子對接驗證。結(jié)果表明,人參皂苷Rh2、人參皂苷Rh4、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇均能與AKT1、JUN、TNF結(jié)合,其中人參皂苷Rh2、人參皂苷Rh4、β-谷甾醇、豆甾醇與AKT1結(jié)合良好,人參皂苷Rh4、山柰酚、β-谷甾醇與JUN結(jié)合良好,人參皂苷Rh4、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇與TNF結(jié)合良好,但上述化合物均與PTGS2、Caspase-3、MAPK8未能完成分子對接,結(jié)合性較差,見表4和圖7。

表4 分子對接結(jié)果

圖7 部分分子對接模式圖

3 討 論

人參作為大補元氣的圣藥,在臨床上被廣泛應(yīng)用于各種疾病的治療,特別是胃癌等腫瘤的晚期治療。人參含有揮發(fā)油類、皂苷、蒽醌、黃酮、脂肪酸、游離氨基酸、微量元素等成分[14],其中人參皂苷不僅可以抑制癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移,還可以通過促進細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)自噬,在多種癌癥(如胃癌、乳腺癌、腦癌、肝癌和肺癌)中表現(xiàn)出抗癌和抗轉(zhuǎn)移的特性[15]。研究顯示,人參皂苷在胃癌的防治中發(fā)揮了重要作用[5-7]。因此,挖掘人參防治胃癌的作用機制對其藥用價值的研究具有重要意義。

本研究通過TCMSP篩選得到人參的主要有效化學(xué)成分有人參皂苷Rh2、人參皂苷Rh4、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇等。其中,人參皂苷Rh2為人參皂苷類中抗腫瘤功效最好的單體成分[16],其具有抗過敏、調(diào)節(jié)免疫、改善心肌缺血、抗抑郁、抗腫瘤、提高化療敏感性等多種功效[8,17]。研究表明,人參皂苷Rh4可以誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡,從而發(fā)揮抗腫瘤作用[18]。山柰酚是一種具有良好藥理活性的植物黃酮類化合物。研究發(fā)現(xiàn),山柰酚通過上調(diào)miR-181a表達(dá)和抑制MAPK/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號通路、PI3K信號通路,可以抑制人胃癌細(xì)胞SNU-216的增殖,促進細(xì)胞自噬[19]。研究顯示,β-谷甾醇不僅可促進人外周血單個核細(xì)胞的增殖,并增強人外周血單個核細(xì)胞對胃癌細(xì)胞SGC-7901的殺傷活性,還能抑制胃癌細(xì)胞增殖并促進其凋亡,其抗癌機制可能與β-谷甾醇通過抑制PI3K/AKT/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,MTOR)信號通路從而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬有關(guān)[20-21]。豆甾醇已被證實在多種腫瘤細(xì)胞中具有潛在的抗癌活性,豆甾醇可通過抑制AKT/MTOR信號通路來誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡和保護性自噬[22]。這些研究證明人參的主要有效化學(xué)成分在防治胃癌中具有重要作用。

本研究從GeneCards?、DRUGBANK、OMIM?數(shù)據(jù)庫獲取胃癌相關(guān)靶點,進一步篩選得到人參治療胃癌的核心靶點,包括AKT1、JUN、TNF、PTGS2、Caspase-3、MAPK8等。AKT1是AKT的亞型之一,參與細(xì)胞增殖、血管生成、調(diào)節(jié)代謝等多種過程,推測AKT1作為AKT同源基因也可能與胃癌相關(guān)。Wang等[23]發(fā)現(xiàn),JUN、AKT1等基因在關(guān)木通誘導(dǎo)胃癌的發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用。研究顯示,腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白是腫瘤促進劑,可以促進幽門螺桿菌的致癌性,誘發(fā)胃癌發(fā)生[24]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞通過釋放IL-6和TNF-α等炎性因子,誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡蛋白配體1的表達(dá),進而促進胃癌細(xì)胞的增殖[10]。這些研究表明AKT1、JUN、TNF在胃癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。

GO功能富集分析結(jié)果顯示,人參治療胃癌的相關(guān)靶點主要涉及細(xì)胞薄膜筏、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、細(xì)胞外基質(zhì)等細(xì)胞組分,以及蛋白質(zhì)同源二聚化活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性等分子功能,這些靶點可通過細(xì)胞凋亡、活性氧的代謝過程、對脂多糖的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、上皮細(xì)胞遷移等生物過程來發(fā)揮治療胃癌的作用。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,人參治療胃癌涉及的主要信號通路包括癌癥相關(guān)通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、乙型肝炎、TNF信號通路、PI3K/AKT信號通路、MAPK信號通路等。研究顯示,人參皂苷通過激活活性氧介導(dǎo)的MAPK信號通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生周期阻滯、凋亡和自噬,從而有效地抑制胃癌細(xì)胞的生長[25]。另有研究表明,人參抗胃癌的作用可能是通過調(diào)控表皮生長因子受體、MAPK1、MAPK3和IL-6等相關(guān)信號通路來實現(xiàn)[26]。人參皂苷還可通過阻斷PI3K/AKT信號通路來抑制鈣調(diào)蛋白的表達(dá),進而促進胃癌細(xì)胞BGC-823的凋亡[27]。這些研究均證實人參治療胃癌與PI3K/AKT信號通路密切相關(guān),且與MAPK信號通路也可能存在一定的關(guān)聯(lián),這與KEGG富集分析結(jié)果一致。分子對接結(jié)果表明,人參的大部分主要有效化學(xué)成分與胃癌核心靶點AKT1、JUN、TNF有較好的結(jié)合性,說明AKT1、JUN、TNF可能是人參治療胃癌的重要靶點。

綜上所述,人參治療胃癌是一個涉及多成分、多靶點、多通路、多環(huán)節(jié)的復(fù)雜過程,其主要有效化學(xué)成分人參皂苷Rh2、人參皂苷Rh4、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇通過作用于AKT1、JUN、TNF等核心靶點,主要在薄膜筏、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、細(xì)胞外基質(zhì)中參與細(xì)胞凋亡、活性氧的代謝過程、炎癥反應(yīng)等進程,作用于PI3K/AKT信號通路、TNF信號通路、MAPK信號通路等關(guān)鍵信號通路,從而發(fā)揮治療胃癌的作用。這一結(jié)論可為進一步挖掘人參的有效化學(xué)成分及其作用靶點并開展實驗研究奠定了基礎(chǔ),也為從人參中提取有效化學(xué)成分治療胃癌提供了參考依據(jù)。