鄭海生 藍(lán)育青 徐家窈 陳海燕 鐘興武

[1 中山大學(xué)中山眼科中心海南眼科醫(yī)院(海南省眼科醫(yī)院,海南省眼科學(xué)重點實驗室)眼科,海南省海口市 570311;2 中山大學(xué)附屬孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院眼科,廣東省廣州市 510120]

在眼底新生血管性疾病中,視網(wǎng)膜缺氧可導(dǎo)致各種細(xì)胞因子釋放,其中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)被認(rèn)為是與新生血管聯(lián)系最緊密的一個因子。無論是在體內(nèi)還是體外實驗中,視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞缺氧均可誘導(dǎo)VEGF表達(dá),從而促進(jìn)眼內(nèi)血管新生[1]。因此,尋找一種能有效抑制眼底新生血管性疾病患者視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖和VEGF表達(dá),且毒副作用較少的方法尤為重要。姜黃素具有多種療效[2-4],其在防治眼底新生血管性病變中可以發(fā)揮抗新生血管生成的藥理作用。目前有關(guān)姜黃素的藥物代謝動力學(xué)及其在癌癥治療方面的研究較多[5-6],但關(guān)于姜黃素對人視網(wǎng)膜色素上皮(human retinal pigment epithelium,hRPE)細(xì)胞的作用研究仍較少。本研究探討姜黃素對體外培養(yǎng)的hRPE細(xì)胞增殖及VEGF表達(dá)的影響,為尋找一種安全有效的防治眼底新生血管性疾病的藥物提供初步的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器設(shè)備

1.1.1 主要試劑:姜黃素(Sigma-Aldrich Lab &Production Materials公司,批號:SHBL0796),胎牛血清(Biological Industries公司,批號:2033119),波形蛋白單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司,批號:M00235),TRIzol試劑盒(TaKaRa公司,批號:AJ91799A),實時熒光半定量PCR試劑盒(TaKaRa公司,批號:RR019A),DMEM-F12培養(yǎng)基(Gibco公司,批號: 61100087)。hRPE細(xì)胞由中山大學(xué)附屬眼科中心醫(yī)院提供,選第3～6代細(xì)胞用于實驗。

1.1.2 主要儀器設(shè)備:光學(xué)倒置顯微鏡(Leica公司,型號:MPS-30)、Axioplan 2 imaging熒光顯微鏡(Zeiss公司)、流式細(xì)胞儀(Becton,Dickinson and Company,型號:FACSCalibur)、Wellscan MK3酶標(biāo)儀(Labsystems公司)、GeneAmp 2700型PCR儀(SYNGENE公司)、恒壓恒流電泳儀(Bio-Rad公司,型號:PowerPac通用型)、GeneGenius型凝膠成像儀(SYNGENE公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 CCK-8法檢測姜黃素對hRPE細(xì)胞增殖的影響:取處于對數(shù)生長期的hRPE細(xì)胞,用含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基制備密度為2 500個/mL的細(xì)胞懸液,將細(xì)胞懸液(100 μL/孔)接種于96孔培養(yǎng)板中,再將96孔培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;待細(xì)胞貼壁生長至單層后棄掉培養(yǎng)液,各濃度組分別在每孔中加入100 μL含終濃度為5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL姜黃素的DMEM-F12培養(yǎng)基,同時設(shè)置空白對照組(加入等量培養(yǎng)液),再將96孔培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d后,棄掉培養(yǎng)液,向每孔中加入100 μL含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基及10 μL CCK-8,繼續(xù)放入37℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 h。采用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的各孔吸光度(OD)值,計算細(xì)胞增殖抑制率,并繪制時間-劑量效應(yīng)曲線。增殖抑制率=(空白對照組OD值-實驗組OD值)/空白對照組OD值×100%。每組設(shè)4個復(fù)孔,實驗重復(fù)3次。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測姜黃素對hRPE細(xì)胞周期時相的影響:取處于對數(shù)生長期的hRPE細(xì)胞,以5×105個/mL的密度接種于25 mL培養(yǎng)瓶中,每瓶5 mL,24 h后加入5 mL含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基,繼續(xù)放入37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,然后吸出DMEM-F12培養(yǎng)液,各濃度組再加入5 mL含終濃度為5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL姜黃素的DMEM-F12培養(yǎng)液作用24 h,設(shè)置空白對照組并加入等量培養(yǎng)液,收集貼壁細(xì)胞,采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布情況。每組實驗重復(fù)3次。

1.2.3 實時熒光半定量PCR檢測姜黃素對hRPE細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)水平的影響:(1)細(xì)胞分組和處理。取處于對數(shù)生長期的hRPE細(xì)胞,以5×105個/mL接種于六孔板中,每孔2 mL,將其分為對照組和姜黃素組。對照組細(xì)胞僅加入2 mL DMEM-F12培養(yǎng)液,姜黃素組加入用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋的終濃度為10 μg/mL的姜黃素,每組設(shè)4個復(fù)孔,放入37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。(2)PCR引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。VEGF上游引物序列為5′-GACAAGAAAATCCCTGTGGGC-3′,下游引物序列為5′-AACGCGAGTCTGTGTTTTTGC-3′,擴增片段理論長度為102 bp;內(nèi)參β-actin上游引物序列為5′-CTCAAGTTGGGGGACAAAAA-3′,下游引物序列為5′-GATGAGATTGGCATGGCTTT-3′,擴增片段理論長度為 428 bp。(3)實時熒光半定量PCR。采用TRIzol試劑盒提取各組細(xì)胞的總RNA,將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板,按實時熒光半定量PCR試劑盒說明書步驟擴增目的基因。反應(yīng)體系為10×PCR Buffer Ⅱ 5 μL,dNTP Mixture(10 mmol/L)2 μL,上下游引物各0.5 μL,TaKaRa Ex TaqTMHS(5 U/μL)0.5 μL,cDNA模板 4.5 μL,加RNase Free dH2O至50 μL。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min;共進(jìn)行33個循環(huán),末次循環(huán)后72 ℃延伸8 min。(4)PCR擴增產(chǎn)物電泳。取4 μL PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,檢測其完整性;攝像后利用凝膠圖像掃描分析軟件分析電泳結(jié)果,測定電泳條帶的光密度值。以VEGF的PCR產(chǎn)物含量與β-actin的PCR產(chǎn)物含量的比值來表示VEGF mRNA相對表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示,多組間比較采用方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度姜黃素對hRPE細(xì)胞增殖的影響 各濃度姜黃素(濃度≥5 μg/mL)對hRPE細(xì)胞均有抑制作用(均P<0.05),且隨著藥物濃度的增大、作用時間的延長,其抑制率呈升高趨勢,整體呈現(xiàn)劑量和時間依賴性。見表1。

表1 不同濃度姜黃素對hRPE細(xì)胞增殖的影響(x±s)

組別n培養(yǎng)4 dOD值(x±s)抑制率(%)培養(yǎng)5 dOD值(x±s)抑制率(%)培養(yǎng)6 dOD值(x±s)抑制率(%)5 μg/mL姜黃素組30.554±0.010a64.00.602±0.015a62.70.591±0.022a63.610 μg/mL姜黃素組30.510±0.014ab66.90.564±0.023ab65.10.518±0.016ab68.120 μg/mL姜黃素組30.114±0.009abc92.60.096±0.016abc94.10.036±0.012abc97.840 μg/mL姜黃素組30.103±0.012abcd93.30.089±0.012abcd94.50.030±0.008abcd98.2空白對照組31.542±0.009—1.612±0.015—1.621±0.013— F值8 562.2044 188.6535 653.264P值<0.001<0.001<0.001

2.2 不同濃度姜黃素對hRPE細(xì)胞周期時相的影響 各濃度姜黃素組的G0/G1期細(xì)胞比例均大于空白對照組,S期細(xì)胞比例和G2/M期細(xì)胞比例均小于空白對照組(均P<0.05)。見表2。

表2 各組hRPE細(xì)胞周期 時相分布情況的比較(x±s,%)

2.3 姜黃素對hRPE細(xì)胞VEGF mRNA相對表達(dá)水平的影響 因20 μg/mL和40 μg/mL姜黃素對細(xì)胞增殖的抑制作用太強,而5 μg/mL姜黃素的抑制性偏弱,所以選擇10 μg/mL姜黃素進(jìn)行該實驗。結(jié)果顯示,姜黃素組hRPE細(xì)胞VEGF mRNA相對表達(dá)水平低于對照組(P<0.05),見表3。

表3 兩組hRPE細(xì)胞VEGF mRNA 相對表達(dá)水平的比較(x±s)

3 討 論

姜黃素是一種藥理作用廣泛的傳統(tǒng)中藥,其藥源廣,價格低廉,無明顯毒副作用,目前美國食品藥品監(jiān)督管理局將其作為21世紀(jì)抗癌新藥[7],并且已有學(xué)者研究姜黃素的藥物代謝動力學(xué)及其治療癌癥的生物有效劑量[8-9]。而姜黃素在眼科疾病中應(yīng)用的研究主要集中于其抗新生血管生成的作用,多項研究顯示,姜黃素可能在翼狀胬肉、角膜堿燒傷和糖尿病視網(wǎng)膜病變等疾病的治療中發(fā)揮重要作用[10-12]。龔凌等[13]發(fā)現(xiàn)姜黃素可明顯抑制人胚胎視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示,各濃度姜黃素(濃度≥5 μg/mL)對hRPE細(xì)胞均有抑制作用(均P<0.05),且隨著藥物濃度的增大、作用時間的延長,其抑制率呈升高趨勢,整體呈現(xiàn)劑量和時間依賴性。本研究結(jié)果還顯示,各濃度姜黃素組的G0/G1期細(xì)胞比例均大于空白對照組,S期細(xì)胞比例和G2/M期細(xì)胞比例均小于空白對照組(均P<0.05)。這說明姜黃素可以將hRPE細(xì)胞周期阻滯于S期,即進(jìn)入細(xì)胞增殖期的hRPE細(xì)胞比例降低,這可能是姜黃素抑制hRPE細(xì)胞增殖的重要原因之一[14]。李松霖等[15]的研究結(jié)果顯示,姜黃素作用于Lewis肺癌細(xì)胞24 h 后,Lewis肺癌細(xì)胞的凋亡率升高至7.43%,且姜黃素可以將Lewis肺癌細(xì)胞周期阻滯于S期。這與本研究結(jié)果相似。

視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞在視網(wǎng)膜新生血管性疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮非常重要的作用,在缺氧的環(huán)境下視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞可誘導(dǎo)VEGF表達(dá),而VEGF在視網(wǎng)膜新生血管病變中起著非常重要的作用。Vasquez等[16]發(fā)現(xiàn)姜黃素既能抑制缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞VEGF表達(dá)上調(diào),又能抑制脈絡(luò)膜血管細(xì)胞的血管生成;Mrudula等[10]發(fā)現(xiàn),姜黃素可以抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜VEGF的表達(dá),從而抑制眼底新生血管生成。因此我們提出假設(shè):姜黃素可通過抑制hRPE細(xì)胞分泌VEGF,從而起到抑制眼底新生血管增生的作用。本研究通過實時熒光半定量PCR檢測姜黃素對hRPE細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)水平的影響,對姜黃素防治眼底新生血管性疾病的分子機制進(jìn)行初步探索。結(jié)果顯示,姜黃素組hRPE細(xì)胞VEGF mRNA相對表達(dá)水平低于對照組(P<0.05),說明姜黃素能下調(diào)hRPE細(xì)胞VEGF mRNA的表達(dá),與上述研究結(jié)果基本一致。然而姜黃素在下調(diào)hRPE細(xì)胞VEGF mRNA相對表達(dá)水平的同時,是否也能下調(diào)其蛋白表達(dá)水平尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述,姜黃素可以將hRPE細(xì)胞周期阻滯于S期,從而抑制hRPE細(xì)胞的增殖,還可以降低hRPE細(xì)胞的VEGF mRNA表達(dá)水平。這為進(jìn)一步的體內(nèi)實驗提供了研究基礎(chǔ),為姜黃素防治眼底新生血管性疾病的新藥研發(fā)提供了初步的理論依據(jù)。