陳怡晴, 周 蕾

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科, 江蘇南京 210029)

糖尿病的發(fā)病率逐年上升, 已成為全球十大死亡原因之一. 糖尿病不僅是引發(fā)腦卒中、冠心病等心血管疾病的獨(dú)立危險因素, 還能夠直接引起心肌損傷, 誘發(fā)糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM). DCM 獨(dú)立于高血壓、冠心病, 是一種由糖代謝紊亂導(dǎo)致的心臟結(jié)構(gòu)和功能障礙為特征的心肌病變. DCM 在高血糖、高血脂刺激下引發(fā)心肌細(xì)胞凋亡、心臟成纖維細(xì)胞增殖和膠原沉積, 從而造成心室病理性重構(gòu)、心臟收縮及舒張功能障礙等, 最終導(dǎo)致心力衰竭[1].

迄今有關(guān)糖尿病患者DCM 的確切發(fā)病機(jī)制尚不完全明確, 傳統(tǒng)西藥對DCM 尚無特效藥物, 多以降低血糖、降血脂、促胰島素分泌來改善心功能, 存在一定的副作用和局限性. 與此同時, 中醫(yī)藥治療DCM 的研究備受關(guān)注, 其中虎杖(Polygonum cuspidatum) 具有多種有效活性成分, 包括白藜蘆醇、虎杖苷和大黃素等[2], 能夠改善DCM 的心肌損傷, 但其具體作用機(jī)制仍有待深入研究.

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)利用生物信息學(xué)和數(shù)據(jù)庫平臺系統(tǒng)地將藥物、疾病和靶點(diǎn)聯(lián)系起來, 通過“藥物-靶點(diǎn)-途徑-疾病” 網(wǎng)絡(luò), 探究藥物與疾病靶點(diǎn)間的作用關(guān)系, 為中藥的多成分、多靶點(diǎn)、多通路研究提供參考依據(jù). 因此, 如果能基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對虎杖的有效活性成分進(jìn)行進(jìn)一步的研究, 分析和預(yù)測作用靶點(diǎn), 有望闡明虎杖在DCM 治療中的潛在機(jī)制, 為臨床中藥防治DCM 提供新的思路和理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 虎杖化學(xué)成分和靶點(diǎn)篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP)——http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php[3], 以口服生物利用度(oral bioactivity, OB)≥30%, 類藥性(drug likenesss, DL)≥0.18 作為篩選條件收集虎杖的主要活性成分, 同時納入已有明確報道的具有治療DCM 功效的虎杖活性成分(白藜蘆醇[4-7]、原兒茶酸[8]、虎杖苷[9-10]、齊墩果酸[11]和大黃素[12]). 使用PubChem 數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)[13]檢索獲得虎杖活性成分的簡化分子線性輸入規(guī)范(simplified molecular input line entry system, SMILES) 結(jié)構(gòu), 并將其導(dǎo)入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(http://www. SwissTargetPrediction.ch/)[14]預(yù)測其潛在的作用靶點(diǎn). 將結(jié)果取并集去重后得到虎杖所有可能的作用靶點(diǎn).

1.2 虎杖治療DCM 作用靶點(diǎn)篩選

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(http://www.genecards.org)[15]和在線人類孟德爾遺傳(online Mendelian inheritance in man, OMIM) 數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)[16]中輸入關(guān)鍵詞“diabetic cardiomyopathy”進(jìn)行檢索,將結(jié)果取并集去重后獲得DCM 相關(guān)的疾病靶點(diǎn). 將其與篩選出的虎杖活性成分輸入Venny 2.1.0 在線作圖軟件(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html) 繪制Venn 圖, 獲得虎杖活性成分與DCM 的交集靶點(diǎn).

1.3 虎杖-有效成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將虎杖活性成分、預(yù)測靶點(diǎn)以及虎杖活性成分與DCM 的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件(https:// cytoscape.org/), 構(gòu)建虎杖-有效成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò). 網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)分別代表藥物、有效成分、靶點(diǎn); 節(jié)點(diǎn)之間的連線代表兩兩節(jié)點(diǎn)之間存在相互作用.

1.4 蛋白相互作用(protein-protein interaction, PPI) 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選得到的虎杖活性成分與DCM 的交集靶標(biāo)蛋白導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(https://stringdb.org/)[17], 設(shè)置種類為“Homo sapiens”, 設(shè)置置信度為“Highest confidence”(0.900), 隱藏離散靶點(diǎn), 繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖, 將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件中進(jìn)行可視化, 獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn).

1.5 基因本體論(gene ontology, GO) 富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and gnomes, KEGG) 富集分析

利用注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(the database for annotation, visualization and integrated discovery, DAVID) 在線分析工具(https://david.ncifcrf.gov)[18]對虎杖活性成分與DCM 的交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析, 并將得到的數(shù)據(jù)分析導(dǎo)入微生信在線繪圖網(wǎng)站(http://bioinformatics.com.cn/) 繪制氣泡圖.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 虎杖活性成分及其靶點(diǎn)信息

為了獲得虎杖的有效活性成分, 本實(shí)驗(yàn)利用TCMSP, 以O(shè)B ≥30% 和DL ≥0.18 為篩選參數(shù), 共收集到了9 個滿足條件的虎杖有效活性成分, 并結(jié)合已報道的與DCM 相關(guān)的虎杖活性成分, 綜合篩選確定了15 個虎杖的有效化合物(見表1). 將得到的化合物輸入PubChem數(shù)據(jù)庫獲得其SMILES 結(jié)構(gòu), 再將SMILES 結(jié)構(gòu)輸入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫得到預(yù)測靶點(diǎn)772 個, 其中化合物(+)-catechin 未預(yù)測到靶點(diǎn), 刪除重復(fù)值后共得到359 個虎杖的有效作用靶點(diǎn).

表1 虎杖活性成分信息Table 1 Information on the active constituents of Polygonum cuspidatum

2.2 虎杖活性成分與DCM 交集靶點(diǎn)的獲取

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫以及OMIM 數(shù)據(jù)庫中輸入關(guān)鍵詞“diabetic cardiomyopathy”, 尋找DCM 的疾病靶點(diǎn). 將兩個數(shù)據(jù)庫得到的預(yù)測靶點(diǎn)匯總并去除重復(fù)值后, 共獲得DCM 可能的疾病靶點(diǎn)5 042 個. 隨后使用Venny 2.1.0 在線作圖軟件將DCM 的靶點(diǎn)與虎杖活性成分靶點(diǎn)取交集, 得到虎杖治療DCM 的潛在靶點(diǎn)214 個(見圖1).

圖1 虎杖活性成分與DCM 交集靶點(diǎn)的Venn 圖Fig.1 Venn diagram of the intersection targets bewteen DCM and the active constituents of Polygonum cuspidatum

2.3 虎杖-有效成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將虎杖活性成分、預(yù)測靶點(diǎn)以及虎杖活性成分與DCM 的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入CytoScape 3.9.1軟件, 去除孤立的節(jié)點(diǎn)后獲得“藥物-活性成分-靶標(biāo)” 網(wǎng)絡(luò)(見圖2). 由圖可知: 圍繞藥物虎杖呈環(huán)形排列的節(jié)點(diǎn)是虎杖的主要活性成分, 下方矩形排列的節(jié)點(diǎn)代表作用靶點(diǎn); 顏色越深、圖形越大, 代表存在的相互作用越多.

圖2 虎杖-有效成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Network of Polygonum cuspidatum-active constituents-intersection targets

2.4 虎杖治療DCM 作用靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將虎杖活性成分與DCM 的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò), 設(shè)置置信度大于0.900, 并隱藏孤立的蛋白. 將結(jié)果文件導(dǎo)入CytoScape 3.9.1 軟件, 使用內(nèi)置插件Analyze Network 計(jì)算度值, 并選擇度值大于平均值的靶點(diǎn)作為連接PPI 網(wǎng)絡(luò)中其他節(jié)點(diǎn)的樞紐.繪制虎杖活性成分與DCM 交集靶點(diǎn)的可視化PPI 網(wǎng)絡(luò)圖(見圖3). 由圖可知: 度值越大的節(jié)點(diǎn)顏色越深、形狀越大、涉及的生物功能越多, 其中SRC(度值37)、HSP90AA1(度值34)、MAPK3(度值30)、HRAS(度值29)、PIK3CA(度值28)、Akt1(度值25) 等靶點(diǎn)在PPI 網(wǎng)絡(luò)中的連接節(jié)點(diǎn)數(shù)遠(yuǎn)高于其他靶點(diǎn), 可能是虎杖治療DCM 的核心作用靶點(diǎn).

圖3 虎杖活性成分與DCM 交集靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network of the intersection targets between the active constituents of Polygonum cuspidatum and DCM

2.5 虎杖活性成分和DCM 交集靶點(diǎn)的GO 和KEGG 富集分析

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫對虎杖活性成分與DCM 的交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析, 設(shè)置P < 0.05, 并選取排名前10 的通路繪制氣泡圖(見圖4). GO 富集分析從生物學(xué)過程(biological process, BP)、分子功能(molecular function, MF)、細(xì)胞組成(cellular component,CC) 3 個方面對虎杖治療DCM 的作用靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化描述, 以探究交集靶點(diǎn)富集的生物學(xué)功能、途徑以及細(xì)胞定位. 生物學(xué)過程主要包括: 對藥物的反應(yīng)、對異種刺激的反應(yīng)、蛋白質(zhì)磷酸化、MAP 激酶活性的正向調(diào)控、蛋白質(zhì)自磷酸化、肽基酪氨酸磷酸化、凋亡過程的負(fù)向調(diào)控、衰老、缺氧反應(yīng)、MAPK 級聯(lián)的正向調(diào)控等. 分子功能主要包括: 酶結(jié)合、RNA 聚合酶II 轉(zhuǎn)錄因子活性、配體激活的序列特異性DNA 結(jié)合、蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、ATP 結(jié)合、同蛋白結(jié)合、蛋白激酶活性、類固醇結(jié)合、血紅素結(jié)合、鋅離子結(jié)合等. 細(xì)胞組成主要包括: 質(zhì)膜、膜筏、神經(jīng)元細(xì)胞體、細(xì)胞質(zhì)、受體復(fù)合物、質(zhì)膜整體組分、胞漿、大分子復(fù)合物、膜、線粒體等.

圖4 虎杖活性成分與DCM 交集靶點(diǎn)的GO 氣泡圖Fig.4 GO bubble map of the intersection targets between the active constituents of Polygonum cuspidatum and DCM

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫對虎杖活性成分與DCM 的214 個交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 富集分析.設(shè)置Count ＞3, 篩選得到162 個結(jié)果, 選取前20 條通路繪制氣泡圖(見圖5). 由圖可見: 虎杖活性成分靶點(diǎn)主要富集在脂質(zhì)和動脈粥樣硬化通路、糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE 信號通路、IL-17 信號通路、HIF-1 信號通路、胰島素抵抗通路、PI3K-Akt 信號通路、凋亡通路等信號通路. 這一發(fā)現(xiàn)提示, 虎杖活性成分可能通過參與調(diào)控脂質(zhì)代謝、胰島素抵抗、抑制心肌細(xì)胞凋亡等實(shí)現(xiàn)改善糖尿病患者心臟功能的作用.

圖5 虎杖活性成分與DCM 交集靶點(diǎn)的KEGG 氣泡圖Fig.5 KEGG bubble map of the intersection targets between the active constituents of Polygonum cuspidatum and DCM

3 討 論

虎杖作為傳統(tǒng)中藥, 含有多種化學(xué)活性成分. 已有研究表明, 虎杖提取物可用于調(diào)節(jié)血糖和脂質(zhì)代謝[19]. 虎杖成分復(fù)雜, 具有多靶點(diǎn)、多通路作用的特點(diǎn), 導(dǎo)致其存在作用靶點(diǎn)不清楚,作用機(jī)制不明確的問題. 本實(shí)驗(yàn)利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法深入探究了虎杖治療DCM 的活性成分和潛在靶點(diǎn), 構(gòu)建了藥物與疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò), 從整體層面研究了中藥作用于疾病的分子機(jī)制,為虎杖治療DCM 的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)和研究思路.

本實(shí)驗(yàn)通過數(shù)據(jù)庫平臺和已有文獻(xiàn)挖掘出了15 個可能作用于DCM 的虎杖有效活性成分, 包括6,8-二羥基-7-甲氧基-雙苯吡酮、囊毒堿、鴨腳樹葉醛堿、大黃素甲醚雙葡萄糖苷、大黃酸、蘆薈大黃素8-葡萄糖甙、β-谷甾醇、(+)-兒茶素、木犀草素、槲皮素、白藜蘆醇、原兒茶酸、虎杖苷、齊墩果酸、大黃素. 木犀草素可以通過抑制NF-κB、激活Nrf2、提高心肌組織活力和錳超氧化物歧化酶活性來降低心肌炎癥和氧化應(yīng)激, 從而緩解糖尿病引起的心功能障礙[20-22]. 槲皮素可以減少DCM 的炎癥作用和甘油磷脂代謝失調(diào)來改善心功能障礙和心肌纖維化[23]. 白藜蘆醇通過激活SIRT1 和使PGC-1α 去乙?；瘉砀纳铺悄虿』颊吒咛钦T導(dǎo)的心臟氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙[24]. 原兒茶酸可以減少DCM 大鼠促炎細(xì)胞因子分泌, 恢復(fù)心肌功能[8]. 虎杖苷通過上調(diào)SIRT3、增加自噬通量、改善線粒體生物能來減輕糖尿病小鼠的心功能障礙[9]. 大黃素可以誘導(dǎo)心肌Akt 和GSK-3β 磷酸化水平增加, 對DCM 具有保護(hù)作用[12].這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的準(zhǔn)確性和可靠性.

本實(shí)驗(yàn)通過SMILES 結(jié)構(gòu)預(yù)測獲得了359 個潛在靶點(diǎn), 其中214 個靶點(diǎn)為虎杖活性成分與DCM 的交集靶點(diǎn). 構(gòu)建了虎杖有效活性成分和DCM 交集靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析, 其中SRC、HSP90AA1、MAPK3、HRAS、PIK3CA、Akt1 等靶點(diǎn)在PPI 網(wǎng)絡(luò)中的相互作用關(guān)系數(shù)遠(yuǎn)高于平均, 是虎杖治療DCM 的關(guān)鍵作用靶點(diǎn), 其中PIK3CA 可能通過調(diào)節(jié)PI3K-Akt 信號通路在DCM 中發(fā)揮心臟保護(hù)調(diào)節(jié)因子的作用[25]. 根據(jù)KEGG 氣泡圖可知, 交集靶點(diǎn)主要集中在脂質(zhì)和動脈粥樣硬化通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路、IL-17 信號通路、HIF-1 信號通路、胰島素抵抗通路、PI3K-Akt 信號通路、凋亡通路等.已有研究已證實(shí), DCM 與糖代謝紊亂密切相關(guān), 高糖血癥的同時伴隨著胰島素抵抗, 易發(fā)生氧化應(yīng)激, 產(chǎn)生較多糖基化產(chǎn)物, 導(dǎo)致心肌纖維化和心肌細(xì)胞凋亡增加[1,26]. IL-17 的增加會導(dǎo)致糖尿病小鼠心臟炎癥和心肌纖維化增加, 抑制IL-17 可以改善纖維化相關(guān)的DCM 心臟功能[27]. HIF-1 參與葡萄糖利用和血管生成, 有助于糖尿病心臟保護(hù)[28]. 此外激活PI3K-Akt信號通路對心肌細(xì)胞凋亡具有抑制作用, 可以促進(jìn)心肌存活、改善DCM 心功能障礙[29]. 由此可見, 虎杖活性成分可能通過參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、調(diào)控胰島素抵抗、減輕炎癥反應(yīng)和心肌細(xì)胞凋亡來達(dá)到緩解DCM 的作用.

綜上所述, 本實(shí)驗(yàn)通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法, 基于數(shù)據(jù)庫平臺挖掘虎杖治療DCM 的有效活性成分及潛在靶點(diǎn), 系統(tǒng)研究了多成分、多靶點(diǎn)、多通路間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)互相合作關(guān)系, 為虎杖治療DCM 的潛在分子機(jī)制提供了研究方向, 也為探究其后續(xù)臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ).