賈文杰,馬璐琳,段 青,杜文文,王祥寧,李 想,崔光芬

( 云南省農業(yè)科學院花卉研究所/國家觀賞園藝工程技術研究中心,昆明 650205)

【研究意義】百合屬于百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium),是多年生草本球根花卉,因其花色艷麗、花型美觀、芳香宜人,既能作盆花、切花,又可應用在園林庭院中,是目前國際市場上最為流行的鮮切花種類之一[1]。百合鮮切花主要作為室內觀賞用,但其花粉污染給人們造成很大困擾,目前一般都采用人工去雄進行處理,不僅過程繁瑣,還浪費大量人力物力,因此雄性不育無花粉百合的培育一直是百合育種的重點方向[2]。【前人研究進展】ATP合成酶(ATPase)是生物體細胞內能量代謝中非常關鍵的酶,其活性和上游基因表達量對 ATP含量有直接影響,進而影響植物的育性。例如對蔥的雄性不育性研究發(fā)現(xiàn),不育系花蕾中ATPase的活性階段性降低導致不育[3]。對甜菜研究表明,在不育系的營養(yǎng)生長過程中,由于 ATPase活性發(fā)生改變,從而導致它產生能量虧缺現(xiàn)象,這是導致甜菜雄性不育系產生的一個主要因素[4]。Dieterich等[5]研究發(fā)現(xiàn),在植物線粒體中可能存在某個基因干擾ATPase的合成,導致植物在花粉形成過程中能量不足,形成雄性不育現(xiàn)象。魏磊等[6]研究發(fā)現(xiàn),在紫稻中存在ATPase基因轉錄本RNA編輯導致不能翻譯成正常的多肽,從而影響紫稻的育性。在玉米、水稻、大豆、小麥等的研究中也發(fā)現(xiàn),ATPase家族基因中的atp6和atp9基因對植物雄性不育的發(fā)生也有重要影響[7]。前人研究發(fā)現(xiàn),ATPase活性變化,轉錄本RNA編輯,ATPase受到干擾,ATPase基因重組或表達量高低等因素都有可能導致植物雄性不育發(fā)生。且ATPase家族基因導致雄性不育主要集中在對atp6和atp9基因的研究。【本研究切入點】雖然ATPase導致的雄性不育在許多植物中很早就被廣泛發(fā)現(xiàn)[8],但目前在百合等觀賞園藝植物中還鮮有相關報道。本研究從百合可育系與不育系的轉錄本中發(fā)現(xiàn)1個顯著上調的ATPase家族基因,經基因克隆后,進行生物信息學分析,推測ATPase家族基因與百合雄性不育的關系。【擬解決的關鍵問題】通過轉錄組數(shù)據,克隆百合ATPase基因,并借助相關的生物信息學軟件,對該基因序列進行同源比對,并對其所編碼的蛋白做進一步分析與功能預測,為研究百合ATPase基因導致的雄性不育以及該基因編碼的相應蛋白質功能及性質提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以東方百合可育系與不育系為試驗材料,該材料種植于云南省農業(yè)科學院花卉研究所百合育種基地。根據百合花苞大小判斷[9],分別采集花粉母細胞時期可育系與不育系子房、花瓣、葉片、花柱、花絲、花藥進行試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 百合各器官總RNA提取和cDNA反轉錄 利用改良的CTAB方法[10]提取百合可育系與不育系花粉母細胞時期的子房、花瓣、葉片、花柱、花絲、花藥的總RNA,再按照iScriptTMgDNA Clear cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書冰浴配制去gDNA體系16 μL,使RNA使用量最大,具體過程為25 ℃孵育5 min,75 ℃孵育5 min,最后去除gDNA。同時冰上配制反轉錄體系20 μL,具體過程為25 ℃孵育5 min,46 ℃孵育20 min,95 ℃變性1 min,冰上冷卻后立即用于qRT-PCR檢測。將檢測得到的cDNA置于-20 ℃冰箱內保存待用。

1.2.2 百合ATPase3基因實時熒光定量PCR表達分析 分別提取百合可育系與不育系花粉母細胞時期的子房、花瓣、葉片、花柱、花絲、花藥的總RNA,反轉錄成cDNA,進行qRT-PCR分析百合ATPase3基因在百合不同部位中的表達情況。設計引物百合ATPase3-qF、ATPase3-qR,參照bimake的2×SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒的操作說明書進行熒光定量PCR分析。配制qRT-PCR反應體系20 μL:SYBR Green qPCR Master Mix (2×)10 μL,上游、下游引物各1 μL,cDNA 1 μL,無菌超純水7 μL。反應程序為95 ℃預變性2 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,40個循環(huán)。制作溶解曲線:95 ℃15 s,60 ℃60 s,95 ℃15 s。每樣品設3個重復。以actin基因為內參,對百合ATPase3基因在百合可育系與不育系花藥發(fā)育關鍵時期不同部位的表達進行熒光定量分析。相對表達量按2-ΔΔCt進行計算,方差分析采用軟件SPSS中的One-way ANOVA進行,樣品間顯著性(P<0.05)采用軟件Turkey test進行分析,作圖使用軟件Origin 2018。

1.2.3 百合ATPase3基因全長序列克隆 根據百合可育系與不育系花粉母細胞時期轉錄組測序結果,挑選表達差異大、數(shù)據庫功能注釋為擬南芥質膜ATPase3基因,設計2對引物(CTG0755-3-YZF1、CTG0755-3-YZR1和CTG0755-3-YZF2、CTG0755-3-YZR1)分別在百合可育系花藥中驗證百合ATPase3基因。驗證后,進行3’和5’ Race擴增。設計引物(CTG0755-3-F1、CTG0755-3-F2)進行3’Race實驗,CTG0755-3-F1與試劑盒中的Outer引物進行1stPCR 擴增,CTG0755-3-F2與試劑盒中的Inner引物進行2ndPCR 擴增。設計引物CTG0755-3-F01、CTG0755-3-YZR1,并根據試劑盒說明進行5’Race,在5’和3’末端已知序列設計包括完整ORF 框的特異引物,以百合可育系花粉母細胞時期花藥總RNA 的反轉錄產物為模板,然后進行PCR 擴增。對目的條帶進行回收純化與克隆載體連接后測序。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.4 生物信息分析 利用在線分析軟件對百合ATPase3基因進行相關生物信息學分析,軟件名稱、網址以及用途如表2所示。對所克隆的基因編碼蛋白在NCBI數(shù)據庫中進行BLASTP分析,并與擬南芥ATPase序列進行同源比較分析。

表2 軟件的名稱及用途Table 2 Software name and usage

2 結果與分析

2.1 百合ATPase3基因熒光定量PCR

如圖1～2所示,百合ATPase3基因的擴增和溶解曲線良好。但在百合不同部位的基因表達水平完全不同(圖3),在百合可育系中,百合ATPase3基因在花器官中表達量較高,其中在子房中表達量最高,平均相對值達到1.25;而在葉片中表達量極低,平均相對值為0.05。在不育系中,除花藥外,其他花器官中百合ATPase3基因表達量也較高,葉片的表達量同樣相對較低。在不育系的花藥中百合ATPase3基因相對表達量僅為0.02,而在可育系中,該值為0.14,約為不育系中的7倍。

圖1 百合ATPase3基因擴增Fig.1 Amplification curve of ATPase3 gene

圖2 百合ATPase3基因溶解曲線Fig.3 Dissolution curve of ATPase3 gene

2.2 百合ATPase3基因全長克隆

根據ATPase3基因在百合可育系與不育系中不同部位的熒光定量PCR結果可以判定,該基因與百合雄性不育具有相關性。本研究根據轉錄組獲得的序列,設計相關引物驗證已知序列,擴增電泳結果如圖4所示,回收3號泳道約300 bp條帶進行測序,與轉錄組測序結果一致,已知序列驗證成功。同時通過3’和5’Race成功克隆并獲得百合ATPase3基因全長序列的目的條帶(圖5),NCBI Conserved Domain保守結構域網站分析[11-14]顯示,百合ATPase3基因編碼的蛋白氨基酸區(qū)間含有1個典型的保守ATPase3結構域,證實百合ATPase3基因編碼的蛋白屬于ATPase家族成員蛋白(圖6)。

M:DL2000 DNA Marker;1、2:CTG0755-3-YZF1/YZR1 1st 產物、負對照;3、4:CTG0755-3-YZF2/YZR1 2nd 產物、負對照。M:DL2000 DNA Marker;1,2:CTG0755-3-YZF1/YZR1 1st product, negative control;3,4:CTG0755-3-YZF2/YZR1 2nd product, negative control.圖4 百合ATPase3基因花藥驗證Fig.4 Validation of ATPase3 gene in Lilium anthers

1:百合ATPase3基因克隆產物。1:ATPase3 gene cloning results.圖5 百合ATPase3基因克隆Fig.5 ATPase3 gene cloning

圖6 百合ATPase3基因編碼蛋白質的保守域Fig.6 Conserved domain of ATPase3 gene encoded protein

2.3 百合ATPase3基因編碼蛋白的理化性質預測

Prot Param預測該蛋白質分子質量約為12.14 KD,理論等電點(pl)為7.71,分子式為C544H871N141O160S6,總原子數(shù)為1722;氨基酸序列由19種氨基酸組成,其中異亮氨酸(Ile)含量最為豐富,占總氨基酸含量的13.8%;組氨酸(His)含量和谷氨酰胺(Gln)含量均最低,分別占總氨基酸含量的1.8%;帶正電荷殘基(Arg+Lys)的總數(shù)為13,帶負電荷殘基(Asp+Glu)的總數(shù)為12,其不穩(wěn)定指數(shù)為37.97,屬于穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)為98.44,總平均親水性(Grand verage of hydropathicity)為0.138。

2.4 百合ATPase3基因編碼蛋白的親、疏水性預測

利用ExPASy系統(tǒng)中的Prot Scale在線軟件分析百合ATPase3基因編碼蛋白的親、疏水性,正值代表疏水性,負值代表親水性。結果如圖7所示,百合ATPase3基因編碼的氨基酸中有較多區(qū)位點在0刻度線以上,其中最大的位點是73號位點,疏水值為2.544;最小的位點是21號位點,親水值為-1.878,說明其疏水氨基酸的數(shù)目多于親水性氨基酸,因此推測該蛋白是穩(wěn)定的疏水性蛋白。

圖7 百合ATPase3蛋白的疏水性預測Fig.7 Hydrophobicity prediction of ATPase3 protein

2.5 百合ATPase3基因編碼蛋白的跨膜區(qū)及亞細胞定位預測

結果(圖8)顯示,該蛋白存在跨膜螺旋,預期的跨膜螺旋的氨基酸數(shù)量為3.36105,該蛋白的前60個氨基酸中預期的跨膜螺旋的氨基酸數(shù)量為0.14799,N-端位于細胞質側膜的總概率為0.19371。從圖9可以看出,預測整個蛋白為膜內蛋白和跨膜蛋白的總概率為0.2,為膜外蛋白的概率為0.8,故該蛋白存在跨膜結構。

圖8 Predictprotein在線預測百合ATPase3蛋白的跨膜區(qū)Fig.8 Prediction of the transmembrane structure of ATPase3 protein using Predictprotein

圖9 TMHMM Server v.2.0在線預測百合ATPase3蛋白的跨膜區(qū)Fig.9 Prediction of the transmembrane structure of ATPase3 protein using TMHMM Server v.2.0

在線軟件WoLF PSORT預測百合ATPase3蛋白的亞細胞定位結果顯示,百合ATPase3蛋白定位于亞細胞的分值分別為細胞核(Nuclear)2;細胞質(Cytoplasm)4;葉綠體(Chloroplast)6,質膜(Plasma membrane)1,說明作為ATPase,主要在細胞質與細胞器中發(fā)揮作用。

2.6 百合ATPase3基因編碼蛋白二級預測

結果表明,該蛋白包含3種二級結構:64個氨基酸形成α-螺旋(Alpha helix),占比58.72%;19個氨基酸形成延伸鏈(Extended strand),占比17.43%;26個氨基酸形成隨機卷曲(Random coil),占比23.85%;該蛋白的主要結構為α-螺旋(圖10)。

2.7 百合ATPase3基因編碼蛋白三級結構預測

通過把氨基酸序列輸入到Swiss-Model程序中,對百合ATPase3基因所編碼蛋白的三級結構進行預測(圖11),該蛋白主要以α-螺旋為主,3種模式的預測都符合二級結構預測結果。

圖11 百合ATPase3蛋白的三級結構預測Fig.11 Predicted tertiary structure of ATPase3 in Lilium

2.8 百合ATPase3同源比較分析

通過百合ATPase3與擬南芥ATPase比較,該蛋白與擬南芥質膜ATPase3同源性最為接近,聚為一類,與擬南芥H[+]ATPase1,H[+]ATPase2,H[+]ATPase3,H[+]ATPase8同源性也較為接近。同時與質膜Ca2+轉運ATPase也有一定的同源性,推測屬于質膜離子轉運蛋白(圖12)。

圖12 百合ATPase3與擬南芥ATPase同源性比較分析Fig.12 Comparative analysis of homology between Lilium ATPase3 and Arabidopsis ATPase

同時將百合ATPase3蛋白序列在NCBI數(shù)據庫中進行BLASTP,選取比對結果中一致性最高的其它物種ATPase蛋白序列進行進化樹分析(圖13)。結果顯示,百合ATPase3蛋白與甘藍(Brassicaoleraceavar.)的親緣性較近,與洋薊(Cynaracardunculusvar.scolymus)的親緣性較遠。

圖13 ATPase3蛋白的系統(tǒng)進化樹分析Fig.13 Phylogenetic analysis of ATPase3 protein

3 討 論

3.1 ATPase家族基因與植物雄性不育的關系

作為植物生長發(fā)育過程中不可缺少的關鍵酶之一,ATPase基因的功能和表達差異直接影響到植物能量的供應。在植物生殖生長過程中需要消耗大量能量,因此 ATPase活性,轉錄本RNA編輯,ATPase受到干擾,ATPase基因重組,ATPase基因表達量高低等因素很可能影響到植物花器官的形成,從而導致雄性不育。目前已經有較多研究表明 ATPase是植物發(fā)生雄性不育的原因之一[7]。 在蔥和甜菜的研究中表明, ATPase是生物體細胞內能量代謝中非常關鍵的酶,其活性及上游基因表達量高低對蔥和甜菜ATP含量進行直接影響,從而影響到植物的育性[3-4]。魏磊等[6]研究發(fā)現(xiàn),在紫稻中ATPase基因轉錄本RNA編輯影響紫稻的育性。Singh等[15]認為,ATPase基因上游一個類似tRNA因子因其加工過程不同,造成ATP6基因表達部分差異。Handa等[16]發(fā)現(xiàn),重組發(fā)生在不育胞質線粒體DNA在靠近ATP6基因位點的地方,該區(qū)域形成了一個新的可編碼105個氨基酸的orf 224,在育性恢復過程中,這段基因轉錄受抑制,這可能導致ATPase基因表達的差異,致使蕓苔發(fā)生胞質雄性不育。本研究通過百合可育系與不育系花粉母細胞期不同部位的熒光定量PCR發(fā)現(xiàn),ATPase3基因表達的高低影響百合的育性,這與蕓苔胞質雄性不育的研究相同,許多學者的研究均發(fā)現(xiàn)蕓苔胞質雄性不育系和可育系的差異表現(xiàn)在ATPase基因的調控水平上[17]。同時本研究通過保守序列同源分析,發(fā)現(xiàn)百合ATPase3與擬南芥質膜ATPase3同源性最為接近,也與擬南芥H[+]ATPase1,H[+]ATPase2,H[+]ATPase3,H[+]ATPase8較為接近。有研究表明質膜 H[+]ATPase對植物的生長發(fā)育至關重要,它是植物體內提供能量的重要離子轉運蛋白[18]。同時大量研究也表明,H[+]ATPase作為質膜上的關鍵蛋白,不僅會調節(jié)植物的生理功能,在植物適應干旱、重金屬、鹽、溫度、營養(yǎng)缺陷等非生物脅迫時也能發(fā)揮巨大作用[19-21]。最新研究還表明,質膜 H[+]ATPase對植物花粉發(fā)育和花粉管萌發(fā)起著重要作用[22]。在本研究中百合不育系ATPase3基因在花粉母細胞期的花藥中顯著下調,推測導致花粉質膜離子轉運蛋白數(shù)量與活性降低,從而影響百合花粉的發(fā)育。

3.2 ATPase基因生物信息學預測分析在植物中的應用

目前ATPase基因的生物信息學預測分析已在許多植物中應用,并為實驗驗證提供方向與理論基礎,張云鶴等[23]和熊勇等[24]分別對甘蔗ATPase基因與藥用植物黃花蒿ATPase基因進行了電子克隆和生物信息學分析,張靜等[25]進行了高粱ATPaseE亞基基因的克隆及其抗逆功能研究,利用電子克隆和實驗方法相結合,將為 ATPase的研究提供更豐富的方法及材料。本研究獲得百合ATPase3基因,并對其進行生物學信息分析,這些分析說明該預測蛋白具有典型ATPase特征,且預測其為疏水性蛋白,存在跨膜結構,亞細胞定位與質膜離子轉運蛋白特性較為一致,推測其在百合中主要作為提供能量的離子轉運蛋白發(fā)揮作用,它的表達下調,導致百合的雄性不育。

4 結 論

本研究驗證ATPase3基因與百合雄性不育相關,并從百合中成功克隆得到ATPase3基因。通過其編碼的蛋白生物信息學分析表明,該蛋白含有1個典型的保守ATPase3結構域,屬于ATPase家族基因。蛋白相對分子量約為12.14 KD,理論等電點為7.71,為疏水性蛋白,存在跨膜結構。且大多分布在質膜、葉綠體、細胞質中,二級結構預測結果表明該蛋白的α-螺旋占比較高,蛋白穩(wěn)定,這與三級結構預測結果相符合。對該基因的克隆和生物信息學分析,為百合ATPase3基因編碼的相應蛋白質功能及性質的進一步探索提供理論基礎,同時也為應用該基因進行百合無花粉分子育種提出了一定的現(xiàn)實依據。