索朗桑姆,何 萍,簡 閱,劉盼盼,徐雨婷,陳誠欣,祿亞洲,蘭小中,張二豪

(西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院,西藏 林芝 860000)

【研究意義】甘青青蘭(DracocephalumtanguticumMaxim) 又稱唐古特青蘭,為唇形科多年生草本植物,主要分布于藏東南、青海東部、甘肅南部和四川西部等海拔1900～4600 m的高原[1]。甘青青蘭味甘、性寒,具有止咳化痰、清熱解毒和胃舒肝的功效[2],是藏醫(yī)藥中常用臨床藥材。研究表明,甘青青蘭含有豐富的酚酸類、黃酮苷和黃酮類等活性物質(zhì),其中以胡麻甙6″-乙酯、迷迭香酸和綠原酸為主要活性成分,這些成分已被證明具有抗氧化、抗病毒、抗心腦缺氧、抗炎和保肝等多種藥理作用[3-7]。植物內(nèi)生菌是一類棲息于健康植物體內(nèi)且又不會引起植物病害的微生物類群[8]。研究表明,植物根際土壤及內(nèi)生細菌在植物生長發(fā)育、抗逆性、生物合成及病蟲害防治中扮演著重要角色[9-10]。同時,植物內(nèi)生菌還具有轉(zhuǎn)運和產(chǎn)生與宿主植物相同或相似次生代謝產(chǎn)物的能力,如生物堿類、萜類、酮類和醌類等活性物質(zhì)[11-13]。因此,揭示甘青青蘭不同組織和根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)組成,對甘青青蘭中益生微生物資源的開發(fā)和利用、野生藥用植物資源的保護具有重要意義。【前人研究進展】植物組織類型、植物品系、氣候類型、土壤理化因子等因素會影響植物內(nèi)生菌和根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成[14-16],而藥用植物品質(zhì)與植物內(nèi)生菌和根際土壤微生物息息相關(guān)[17-18]。劉瑩等[19]從三七植物組織中分離出一株具有產(chǎn)皂苷能力的腸桿菌屬細菌,張玉潔等[20]從三七植物組織中分離出眾多具有抗根腐病病原菌能力的內(nèi)生真菌,Zhao等[21]從石斛蘭屬植物中分離的內(nèi)生真菌鏈霉菌具有產(chǎn)新骨架聚酮類化合物(Chartspiroton)的能力,宋發(fā)軍等[22]從重樓中分離出4株具有促生功能的內(nèi)生細菌,印度梨狀芽孢桿菌和圓褐固氮菌能促進藥用植物黃花蒿中青蒿素的合成[23]?？梢?內(nèi)生菌在植物生長發(fā)育、抗病蟲害和提升藥材品質(zhì)等方面具有積極作用?！颈狙芯壳腥朦c】目前,有關(guān)甘青青蘭的研究主要集中在生理生長特性和活性成分等方面,而甘青青蘭根際及內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)組成的研究尚未見報道,因此,系統(tǒng)全面地分析藥用植物根際及內(nèi)生微生物群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性對后期基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究具有重要意義。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究基于高通量測序技術(shù)對西藏甘青青蘭根際土壤和不同組織內(nèi)生細菌的群落結(jié)構(gòu)組成特征進行研究,旨在更加全面、準確地反應(yīng)甘青青蘭根際和內(nèi)生細菌物種組成和多樣性,為后期應(yīng)用研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

植物樣品及根際土壤采自西藏昌都市洛隆縣(30°45′18.8″ N, 95°53′36.7″ E),該地海拔3922 m,年均降水量423.7 mm,年平均溫度5.5 ℃,屬高原溫帶半干旱氣候。根據(jù)隨機取樣原則,隨機選取9株新鮮健康、無病蟲害、長勢一致的甘青青蘭植株,裝入無菌袋中,每組3個重復(fù),低溫保存并帶回實驗室,24 h內(nèi)處理。采用“抖根法”收集根際土壤,并過直徑2 mm的過濾篩除去殘枝落葉,自然風(fēng)干后4 ℃保存?zhèn)溆?。甘青青蘭葉部樣品(DtL)標記為DtL1、DtL2、DtL3;莖部樣品(DtS)標記為DtS1、DtS2、DtS3;根部樣品(DtR)標記為DtR1、DtR2、DtR3;根際土壤樣品(DtRS)標記為DtRS1、DtRS2、DtRS3。

1.2 樣品前處理

將采集的甘青青蘭植物先用流動的自來水沖洗,然后用75%乙醇浸泡2 min,無菌ddH2O沖洗3次,再用3%次氯酸鈉浸泡3 min,最后用無菌ddH2O沖洗3次[24],將消毒后的植物組織置于無菌PE管中,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 總DNA提取

根據(jù)DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Germantown, MD, USA)試劑盒操作說明抽提甘青青蘭組織和根際土壤細菌總DNA,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量,DNA濃度和純度利用紫外分光光度計NanoDrop ND-2000進行檢測。

1.4 16S rRNA基因序列擴增及測序

以樣品總DNA為模板,利用799F (5′-AACMG GATTAGATACCCKG-3′)和1193R(5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′)對細菌16S rRNA基因V5～V7區(qū)進行PCR擴增。擴增體系:10×PCR緩沖液 2 μL,5 mmol/L dNTPs 1 μL,引物799F和1193R各1 μL,DNA模板1 μL,rTaq酶0.2 μL,補ddH2O至20 μL。反應(yīng)程序: 94 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,循環(huán)35次; 72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,純化回收PCR擴增產(chǎn)物并送至上海派森諾科技股份有限公司進行測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

Illumina MiSeq測序所得的原始數(shù)據(jù)經(jīng)拼接、質(zhì)控和過濾后,在97%相似水平下,利用軟件Uparse(7.0.1090)進行OTU(Operational taxonomic units)聚類分析;采用RDP classifier(2.11)貝葉斯算法將97%相似水平的OTU代表序列與細菌SILVA (138)數(shù)據(jù)庫比對,進行分類學(xué)分析;利用MOTHUR(1.30.2)和QIIME(Version 1.9.1)軟件進行α(alpha)多樣性和β(beta)多樣性分析;用R語言(3.3.1)工具進行統(tǒng)計和作圖;用 PICRUSt 軟件包對測序結(jié)果進行功能預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘青青蘭不同組織和根際土壤細菌序列及alpha多樣性

從表1可知,DtL、DtS、DtR和DtRS分別獲得45 784、45 407、47 492和42 381條序列,經(jīng)質(zhì)控、過濾后分別獲得34 694、33 787、23 317和16 733條有效序列,平均長度376 bp。在97%相似水平下,OTU聚類分析結(jié)果表明,DtL、DtS、DtR和DtRS所產(chǎn)生的OTUs數(shù)分別為1703、1872、1341和1384。

表1 甘青青蘭不同組織及根際土壤的OTUs及相關(guān)序列指數(shù)Table 1 OTUs and related sequence indexes in different tissues and rhizosphere soil of D. tanguticum

從圖1可知,DtS中豐富度指數(shù)顯著高于DtR和DtRS(P<0.05),但與DtL相比無顯著差異,DtR中豐富度指數(shù)最低。均勻度指數(shù)分析結(jié)果表明,DtS和DtRS均勻度指數(shù)最高,且均顯著高于DtR(P<0.05),但與DtL相比無顯著差異。多樣性分析結(jié)果表明DtS多樣性指數(shù)最高,其次是DtRS和DtL,DtR多樣性指數(shù)最低。

A, B, C和D分別代表Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)、Shannoneven指數(shù)和Simpson指數(shù),*表示P<0.05, **表示P<0.01, ***表示 P<0.001。A, B, C and D represent Chao, Shannon, Shannoneven and Simpson indexe analysis, respectively. * represents P<0.05, ** represent P<0.01, and *** represent P<0.001.圖1 甘青青蘭不同組織及根際土壤alpha多樣性指數(shù)Fig.1 Alpha diversity indexes in different tissues and rhizosphere soil of D. tanguticum

從圖2可知,隨著測序深度增加,各樣本OTU數(shù)量增幅變緩,稀釋曲線逐步趨于平坦,各樣本的測序覆蓋度在98.1%～99.4%,說明此次測序結(jié)果可真實反映甘青青蘭不同組織和根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的組成。4個樣品共獲得2351個OTUs,DtL、DtS、DtR和DtRS共同擁有892個OTUs,特有的OTUs分別為138、101、253和76個,說明不同樣品間細菌群落結(jié)構(gòu)組成差異較大。

圖2 甘青青蘭不同組織和根際土壤細菌OTUs分布Fig.2 OTUs distribution of bacterial community detected in different tissues and rhizosphere soil of D. tanguticum

2.2 甘青青蘭不同組織和根際土壤細菌種群歸類

從表2可知,不同樣品所得的2351個OTUs分屬29門、76綱、191目、319科和570屬,其中DtL中內(nèi)生細菌歸屬27門、70綱、168目、279科和460屬,DtS中內(nèi)生細菌歸屬29門、73綱、167目、277科和489屬,DtR中內(nèi)生細菌歸屬23門、57綱、128目、210科和361屬,DtRS中細菌歸屬24門、56綱、127目、197科和351屬。甘青青蘭不同組織和根際土壤所測得的細菌在各分類等級上的數(shù)量明顯不同。在屬分類水平上,DtS中內(nèi)生細菌種類最多,其次是DtL和DtR,DtRS中細菌種類數(shù)最少,這與甘青青蘭不同組織和根際土壤細菌的OTUs結(jié)果(表1)基本一致。

表2 甘青青蘭不同組織和根際土壤細菌學(xué)分類階層總數(shù)Table 2 Total numbers of bacterial taxa detected in different tissues and rhizosphere soil of D. tanguticum

2.3 甘青青蘭不同組織和根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)組成

從圖3可知,甘青青蘭DtL、DtS和DtRS中,占比大于1%的優(yōu)勢細菌門為4個,分別為放線菌門(Actinobacteriota)、變形菌門 (Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和綠彎菌門(Chloroflexi),而DtR占比大于1%的優(yōu)勢細菌門為3個,分別為放線菌門(69.48%)、變形菌門 (21.36%)和綠彎菌門(4.58%)。DtL中優(yōu)勢細菌門依次是放線菌門(68.25%)、變形菌門 (13.25%)、厚壁菌門(8.87%)和綠彎菌門(4.35%);DtS中優(yōu)勢細菌門依次是放線菌門(63.99%)、變形菌門 (17.17%)、厚壁菌門(7.86%)和綠彎菌門(5.16%);DtRS中優(yōu)勢細菌門依次是放線菌門(67.36%)、變形菌門 (16.82%)、綠彎菌門(5.89%)和厚壁菌門(3.61%) 。以上結(jié)果表明,除DtR樣品外,其他樣品中的優(yōu)勢細菌門類型相同,但其相對豐度存在差異。

圖3 甘青青蘭不同組織和根際土壤細菌優(yōu)勢細菌門組成Fig.3 Dominant bacterial phyla in different tissues and rhizosphere soil of D. tanguticum

從圖4可知,DtL中內(nèi)生細菌相對豐度大于1%的屬有6個,其中能夠準確分類的屬有4個,分別為芽孢桿菌屬(Bacillus,6.96%)、土壤紅桿菌屬(Solirubrobacter,6.46%)、Gaiella屬(5.61%)和假諾卡氏菌屬(Pseudonocardia,4.10%);DtS中相對豐度大于1%的屬有6個,其中能夠準確分類的屬有4個,分別為芽孢桿菌屬(5.87%)、土壤紅桿菌屬(5.85%)、假諾卡氏菌屬(5.03%)和Gaiella屬(4.33%);DtR中相對豐度大于1%的屬有6個,其中能夠準確分類的屬有4個,分別為土壤紅桿菌屬(11.78%)、游動放線菌屬(Actinoplanes,5.56%)、Gaiella屬(3.20%)和假諾卡氏菌屬(1.74%);DtRS中相對豐度大于1%的屬有7個,其中能夠準確分類的屬有5個,分別為土壤紅桿菌屬(8.24%)、Gaiella屬(4.33%)、假諾卡氏菌屬(3.16%)、芽孢桿菌屬(2.54%)和游動放線菌屬(1.28%)。說明,DtL和DtS樣品的優(yōu)勢內(nèi)生細菌屬類型相同,但相對豐度差異較大,而DtR、DtRS與DtL和DtS樣品間的優(yōu)勢細菌屬類型不同,因此,不同樣品間既存在共性又存在差異。

圖4 甘青青蘭不同組織和根際土壤細菌優(yōu)勢細菌屬組成Fig.4 Dominant bacterial genera in different tissues and rhizosphere soil of D. tanguticum

2.4 甘青青蘭不同組織和根際土壤細菌層級聚類

從圖5-A可知,主成分分析1(PC1)和主成分分析2(PC2)對樣品的差異貢獻率分別為51.02%和26.01%,合計77.03%,能夠較好地區(qū)分甘青青蘭不同組織和根際土壤樣品,是差異的主要來源,說明甘青青蘭不同組織和根際土壤樣品間細菌群落結(jié)構(gòu)組成存在差異?；诜羌訖?quán)組平均法(Unweighted pair group method with arithmetic mean,UPGMA)構(gòu)建的樣本層聚類分析結(jié)果如圖5-B所示,甘青青蘭不同組織和根際土壤樣品主要分為2個類群,DtL和DtS聚為一類,而DtR和DtRS聚為一類。說明DtL和DtS樣品的細菌群落結(jié)構(gòu)組成相似,而DtR和DtRS樣品的細菌群落結(jié)構(gòu)組成相似。

圖5 甘青青蘭不同組織及根際土壤細菌主成分分析(A)和UPGMA聚類分析(B)Fig.5 Principal component analysis (A) and UPGMA cluster analysis (B) in different tissues and rhizosphere soil of D. tanguticum

2.5 甘青青蘭不同組織和根際土壤細菌功能基因預(yù)測

由圖6可知,在第一等級功能層上,所有樣品細菌功能基因均注釋到6類生物代謝通路上,其中代謝(Metabolism)為主要組成成分,且DtL和DtS樣品中參與各種生物代謝通路的細菌相對豐度均明顯高于DtR和DtRS樣品。第二等級KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes)代謝通路豐度分析結(jié)果如表3所示,樣品中細菌群落的代謝功能主要集中在膜轉(zhuǎn)運(Membrane transport)、氨基酸代謝(Amino acid metabolism)、碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism)、外源性化合物生物降解和代謝(Xenobiotics biodegradation and metabolism)、能量代謝(Energy metabolism)和脂類代謝(Lipid metabolism)等通路,且DtL和DtS樣品中參與各種功能活動的內(nèi)生細菌物種相對豐度最高,其次是DtR,而DtRS樣品中參與調(diào)控各種代謝的細菌物種相對豐度最低。

圖6 甘青青蘭不同組織和根際土壤細菌PICRUSt功能基因預(yù)測Fig.6 PICRUSt functional gene prediction of bacterial community in different tissues and rhizosphere soil of D. tanguticum

表3 甘青青蘭不同組織和根際土壤細菌群落KEGG 代謝通路豐度 Table 3 KEGG metabolic pathway abundance of bacterial community among different tissues and rhizosphere soil of D. tanguticum

3 討 論

甘青青蘭作為一種藏醫(yī)藥常用藏藥材,具有治療關(guān)節(jié)炎、胃炎、肝炎和抗癌等功效,被廣泛用于藏藥制劑[2]。植物內(nèi)生菌和根際土壤細菌在植物生長發(fā)育、抗逆境和生理代謝等方面扮演著重要角色[9-10],研究表明,內(nèi)生菌具有獨自或幫助宿主產(chǎn)生與宿主相同或相似的藥用活性成分的功能[25],而植物組織類型、植物品系、氣候類型等因素影響植物內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)組成[14-16],不同組織中的內(nèi)生菌具有一定的差異性和專一性。對鐵皮石斛不同部位內(nèi)生細菌群落組成分析表明,鐵皮石斛葉部內(nèi)生細菌多樣性最高,其次是莖和根[26];顧美英等[27]研究表明,黑果枸杞根部內(nèi)生細菌多樣性最高,其次是花、果實、莖和葉部;安超等[28]研究發(fā)現(xiàn),竹根七根、莖和根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)組成存在較大差異;李秋樺等[29]分析三七不同部位內(nèi)生細菌多樣性時發(fā)現(xiàn),根部的內(nèi)生細菌豐富度最高,其次是莖和葉,與本研究結(jié)果相似,甘青青蘭不同組織和根際土壤測得的細菌在各分類等級上的數(shù)量明顯不同,DtS中內(nèi)生細菌種類最多,其次是DtL和DtR。此外,DtS中的細菌多樣性指數(shù)最高,其次是DtL,DtR多樣性指數(shù)最低,呈現(xiàn)明顯的組織差異性。研究表明,根際土壤微生物數(shù)量受土壤類型影響[30],此次采集的甘青青蘭根際土壤均為沙土,這可能是導(dǎo)致DtRS中細菌種類數(shù)最少的原因。

放線菌門和變形菌門是植物內(nèi)生菌和根際土壤最普遍的菌門[31],與本研究結(jié)果一致,放線菌門和變形菌門是甘青青蘭不同組織和根際土壤相對豐度最高的優(yōu)勢類群,說明甘青青蘭的生境適合放線菌門和變形菌門的生存與繁殖。變形菌門具有固氮、害蟲防治、土壤修復(fù)和污染物降解等功能[32],且有助于提高用植物的產(chǎn)量和質(zhì)量[33];放線菌作為一類重要的生防微生物,能夠產(chǎn)生大量的、種類繁多的抗生素[34],因此,放線菌門和變形菌門的大量富集可能與甘青青蘭藥用活性成分的合成有關(guān)。

植物內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)組成與植物種類、組織類型、環(huán)境和氣候等因素密切相關(guān)。研究表明,黑果枸杞葉部的優(yōu)勢細菌屬是紅球菌屬 (Rhodococcus) 和慢生根瘤菌屬 (Bradyrhizobium),莖部是沙雷氏菌屬(Serratia)和假單胞菌屬(Pseudomonas),根部是鹽單胞菌屬(Halomonas)和Fodinicurvata[27];竹根七葉部優(yōu)勢細菌屬是擬桿菌屬(Bacteroides)和不動桿菌屬 (Acinetobacter),根部是艾克曼菌屬(Akkermansia)和伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)[28];在黃芪中,Anderseniella和芽孢桿菌屬是優(yōu)勢細菌屬[35],說明不同植物、不同組織中內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)組成差異較大。本研究發(fā)現(xiàn),DtL和DtS內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)組成相似,其優(yōu)勢細菌屬均為芽孢桿菌,土壤紅桿菌屬是次優(yōu)勢屬,與其它藥用植物相比差異較大。根際土壤作為植物根系及根系分泌物的接觸區(qū)域,其微生物與根部內(nèi)生菌存在一定的相似性[36-38]。本研究發(fā)現(xiàn),DtR和DtRS中的細菌群落結(jié)構(gòu)組成相似,其優(yōu)勢菌屬均為土壤紅桿菌屬,這與主成分分析和樣本層級聚類結(jié)果一致。在黑果枸杞中,內(nèi)生細菌芽孢桿菌有較高的促生作用[39],在人參中,內(nèi)生細菌芽孢桿菌能夠增加人參生物量并誘導(dǎo)人參皂苷的合成[40]。甘青青蘭作為一種傳統(tǒng)藏藥材,主要以地上部分入藥,而莖和葉中富含大量的芽孢桿菌,說明芽孢桿菌可能參與甘青青蘭藥用活性成分的合成。土壤紅桿菌屬能夠適應(yīng)并定植到不同的生態(tài)系統(tǒng),甚至是嚴重污染的土壤[41-42],土壤紅桿菌屬是DtR和DtRS中的優(yōu)勢細菌屬,這可能與甘青青蘭生長環(huán)境和生態(tài)適應(yīng)性有關(guān)。假諾卡氏菌屬中的許多成員都能夠產(chǎn)生重要的生物活性物質(zhì),如抗生素、維生素和酶制劑等[43],而甘青青蘭不同組織和根際土壤中含有大量的假諾卡氏菌屬,說明甘青青蘭組織及根際土壤中含有產(chǎn)抗生素的微生物資源。

PICRUSt基因功能預(yù)測表明,甘青青蘭不同組織和根際土壤細菌中與代謝相關(guān)的功能基因相對豐度最高。由于黃酮類、黃酮苷類、萜類、揮發(fā)油類和植物甾醇類等是甘青青蘭的主要藥用活性物質(zhì)[3-6],甘青青蘭組織和根際土壤細菌中與膜轉(zhuǎn)運、氨基酸代謝、碳水化合物代謝、外源性化合物生物降解和代謝、能量代謝和脂類代謝等通路相關(guān)的功能基因相對豐度最高,這些細菌的功能基因可能參與了甘青青蘭藥用活性成分的合成;DtL和DtS樣品中參與各種生物代謝通路的細菌相對豐度均明顯高于DtR和DtRS樣品,這可能與甘青青蘭主要藥用部分是DtL和DtS有關(guān)。綜上所述,研究甘青青蘭不同組織和根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性,為系統(tǒng)、全面了解甘青青蘭不同組織和根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)組成,為闡明菌群功能和挖掘西藏甘青青蘭中特定微生物資源提供理論參考。

4 結(jié) 論

首次采用高通量測序技術(shù)對甘青青蘭不同組織和根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性進行研究,并對不同組織和根際土壤細菌功能進行了預(yù)測分析。DtL和DtS中內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)組成相似,且其優(yōu)勢細菌屬均為芽孢桿菌和土壤紅桿菌屬;DtR和DtRS中細菌群落結(jié)構(gòu)組成相似,其優(yōu)勢菌屬均為土壤紅桿菌屬;DtS中內(nèi)生細菌多樣性指數(shù)最高,其次是DtRS和DtL,DtR多樣性指數(shù)最低;此外,甘青青蘭不同組織和根際土壤細菌中富含與黃酮類、黃酮苷類和萜類等物質(zhì)合成相關(guān)的功能基因,這些可能參與了甘青青蘭藥用活性成分的合成,為后續(xù)篩選益生內(nèi)生菌奠定了基礎(chǔ)。