孫 虎,劉昌燕,李 莉,劉良軍,韓雪松,萬正煌,沙愛華,陳宏偉

(1.長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院/濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心,湖北 荊州 434025;2. 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所/糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430064)

【研究意義】蠶豆(ViciafabaL.,2n=12)又名胡豆、羅漢豆等,豆科蝶形花亞科巢菜屬,為越年生或一年生草本植物,基因組大小約13 Gb[1-2]。蠶豆?fàn)I養(yǎng)價(jià)值豐富,為糧食、蔬菜和飼料、綠肥兼用作物。因?yàn)樾Q豆與其根瘤菌共生固氮使其在調(diào)整農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)、發(fā)展畜牧業(yè)、提高土壤肥力、保持農(nóng)田生態(tài)平衡中占有重要地位[3]。綠豆象屬于鞘翅目豆象科瘤背豆象屬。作為一種世界性倉儲(chǔ)害蟲,綠豆象危害蠶豆、綠豆、豌豆等多種食用豆類,在種植和儲(chǔ)藏食用豆的地方均可發(fā)生危害。目前,人們主要采用化學(xué)方法對(duì)綠豆象進(jìn)行防治,但該方法易產(chǎn)生化學(xué)殘留污染環(huán)境且容易使豆象產(chǎn)生抗藥性[4]。因此,培育抗豆象蠶豆品種成為避免豆象侵害的首選。傳統(tǒng)育種方法成本高,耗時(shí)長,限制性較大。現(xiàn)代分子生物技術(shù)的發(fā)展,尤其是分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展極大地促進(jìn)了作物新品種選育進(jìn)程。因SSR標(biāo)記具有重復(fù)性好、多態(tài)性高、共顯性遺傳、遍布整個(gè)基因組等優(yōu)點(diǎn),故在水稻、小麥、玉米、大豆等主要作物中,SSR標(biāo)記被用于作物遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源鑒定、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及QTL定位和分子標(biāo)記輔助選擇育種等方面的研究[5-8]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】迄今為止,大多數(shù)已知的蠶豆SSR標(biāo)記是通過挖掘基因SSR、cDNA測序或SSR富集文庫方法的公共數(shù)據(jù)庫開發(fā)的[9-18]。前人研究為蠶豆的分子標(biāo)記開發(fā)和功能基因組研究提供了豐富的轉(zhuǎn)錄組資源。盡管已經(jīng)開發(fā)了大量的SSR標(biāo)記,由于蠶豆基因組大小非常大,目前尚無參考基因組可用,還需開發(fā)新的蠶豆SSR標(biāo)記豐富蠶豆的遺傳與基因組資源。在蠶豆方面,SSR分子標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建以及關(guān)聯(lián)分析等方面的研究[19-21]。Mohamed等[22]使用SSR標(biāo)記對(duì)來自不同地理區(qū)域的35份蠶豆種質(zhì)資源進(jìn)行了種質(zhì)遺傳多樣性和結(jié)構(gòu)分析,聚類分析與結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致,35種蠶豆基因型被分為兩類。關(guān)于利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)于蠶豆抗豆象方面研究的報(bào)道基本沒有,人們目前主要通過表型性狀對(duì)蠶豆抗豆象方面進(jìn)行研究。段燦星等[23]通過室內(nèi)人工侵染以及自由選擇測驗(yàn)對(duì)339份蠶豆材料和100份豌豆材料進(jìn)行綠豆象抗性研究,研究結(jié)果表明對(duì)綠豆象抗性與品質(zhì)成分有關(guān),深色種子與淺色種子相比,受到的侵害更小。Estefanía等[24]為了鑒定蠶豆對(duì)豆象抗性的穩(wěn)定來源并揭示外界氣候條件與農(nóng)藝性狀對(duì)豆象侵害之間的關(guān)系,進(jìn)行了自然侵染下的田間試驗(yàn),研究結(jié)果表明在蠶豆中存在不同的抗豆象機(jī)制;溫度、降雨量和濕度似乎是影響蠶豆豆象危害發(fā)生的最大氣候因素,而在不同的實(shí)驗(yàn)中,早熟種子和小粒種子與較低的豆象侵染率相關(guān)聯(lián)。張紅巖等[4]在室溫條件下,對(duì)500份蠶豆種質(zhì)資源連續(xù)2年進(jìn)行綠豆象飽和侵染處理,最終篩選出H0048、H0092、H0094、H001455、H001471、H001787共6份高抗綠豆象的蠶豆資源。研究表明,食用豆類作物的抗性主要是由于自身攜帶抗性基因所致?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前為止,還沒有關(guān)于蠶豆對(duì)豆象抗性遺傳基礎(chǔ)相關(guān)的研究報(bào)道。本研究利用三代全長測序技術(shù)測定RNA-seq進(jìn)而開發(fā)新的蠶豆SSR分子標(biāo)記。利用開發(fā)的SSR分子標(biāo)記對(duì)80份蠶豆種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析,篩選與蠶豆抗豆象性狀相關(guān)的SSR位點(diǎn)。【擬解決的關(guān)鍵問題】本文旨在為蠶豆的抗豆象種質(zhì)資源篩選與鑒定提供依據(jù),進(jìn)一步挖掘與蠶豆抗豆象性狀相關(guān)聯(lián)的SSR分子標(biāo)記位點(diǎn),為培育蠶豆抗豆象品種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選用80份不同敏感度的蠶豆抗豆象種質(zhì)資源材料,所用材料均來自于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所。試驗(yàn)材料見表1。

表1 80份蠶豆材料及其相關(guān)信息Table 1 80 faba bean materials and their related information

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 豆象鑒定 本試驗(yàn)參考程須珍等[25]的方法進(jìn)行豆象鑒定:每份材料隨機(jī)選取50粒健康種子分別放入直徑5 cm、高12 cm的玻璃瓶中,每個(gè)玻璃瓶內(nèi)接種4～6頭綠豆象成蟲,讓其在種子上隨機(jī)產(chǎn)卵,至每粒種子落卵量在5個(gè)以上時(shí),除去所有的成蟲,養(yǎng)蟲室溫度(29±2) ℃,濕度60%～70%。待感蟲材料完全被蛀食后(約40～60 d), 調(diào)查每份材料的受害粒數(shù),計(jì)算種子被害率,根據(jù)種子被害率評(píng)價(jià)每份材料的抗性等級(jí),評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Resistance grading standards

1.2.2 SSR引物選擇 對(duì)2個(gè)蠶豆品種Y134和Y078進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,利用MISA軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄組測序所得的所有Unigene序列進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索,尋找含有SSR核心基序的Unigene序列。隨后利用Primer 3.0批量設(shè)計(jì)SSR引物,所得到的引物經(jīng)過處理后,構(gòu)建長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院沙愛華課題組自有蠶豆SSR引物庫(未公開)。在批量設(shè)計(jì)的SSR引物數(shù)據(jù)庫中隨機(jī)挑選100對(duì)SSR引物,由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

1.2.3 蠶豆總DNA的提取 本試驗(yàn)采用經(jīng)過改進(jìn)的簡化CTAB法[26]提取蠶豆基因組DNA。取蠶豆幼嫩葉片50～100 mg,加入含1%聚乙烯吡咯烷酮的CTAB提取緩沖液700 μL,充分研磨,研磨液轉(zhuǎn)入相對(duì)應(yīng)的1.5 mL離心管;65 ℃水浴30 min,每3～5 min取出輕輕搖動(dòng)混勻;水浴完成后于通風(fēng)櫥中加入500 μL混合液[v(苯酚)∶v(氯仿)∶v(異戊醇)=25∶24∶1],顛倒混勻;12 000 r/min離心10 min,取上清液轉(zhuǎn)入新的離心管,加入等量混合液[v(氯仿)∶v(異戊醇)=24∶1],顛倒混勻;12 000 r/min離心10 min,取500 μL上清液轉(zhuǎn)入新的離心管,加入2倍體積預(yù)冷無水乙醇顛倒混勻后-20 ℃靜置30 min;12 000 r/min離心10 min,棄上清液,加入500 μL 70%的乙醇洗滌2次,12 000 r/min離心10 min;棄上清液,室溫靜置干燥15 min,加入40 μL滅菌水溶解DNA沉淀,室溫放置1 d后,使用賽默飛NanoDrop 2000分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度及質(zhì)量。

1.2.4 SSR分析 PCR反應(yīng)體系(15 μL):DNA模板1.5 μL、ddH2O 9.4 μL、dNTP 0.3 μL、Mg2+0.9 μL、10×Buffer 1.5 μL、上下游引物各0.6 μL(10 (mol/L)、Taq酶0.2 μL(5 U/μL)。PCR擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,48～58 ℃(依引物而定)退火30 s,72 ℃延伸45 s,共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃恒溫保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入1/2體積(7.5 μL)變性劑,95 ℃變性5 min。6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,銀染顯影后觀察結(jié)果并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用人工讀帶的方法,有帶記為“1”,無帶記為“0”,缺失記為“9”。利用Power Marker v3.25軟件計(jì)算引物的多態(tài)性信息(Polymorphism information content,PIC);利用Popgen32計(jì)算引物的Shannon信息指數(shù)(I);利用NTSYS-pc2.10e軟件生成遺傳相似系數(shù)并對(duì)80份蠶豆材料進(jìn)行聚類分析,繪制樹狀聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 80份蠶豆材料豆象鑒定

采用室內(nèi)人工接蟲的方法對(duì)80份蠶豆種質(zhì)資源進(jìn)行抗豆象分級(jí)鑒定,其中高抗(HR)材料67份,中抗(MR)材料1份,高感(HS)材料9份,感(S)材料3份,詳細(xì)鑒定結(jié)果如表3所示。

表3 80份蠶豆材料抗豆象鑒定結(jié)果Table 3 Identification results of 80 faba bean materials for resistance to seed weevil

2.2 蠶豆DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測

由圖1-A可知,試驗(yàn)室原CTAB法提取的DNA質(zhì)量較差,存在DNA降解,對(duì)試驗(yàn)結(jié)果可能會(huì)產(chǎn)生誤差;改良CTAB法所提取的蠶豆基因組DNA質(zhì)量顯著提高,降解大幅度降低(圖1-B)。

A.原CTAB法提取DNA檢測結(jié)果;B.改良CTAB法提取DNA檢測結(jié)果。A. Detection results of DNA extracted by the original CTAB method;B.Detection results of DNA extraction by modified CTAB method.圖1 部分蠶豆材料DNA檢測結(jié)果Fig.1 DNA test results of some broad bean materials

2.3 蠶豆SSR分子標(biāo)記篩選

為避免品種特異性影響,本試驗(yàn)根據(jù)豆象鑒定結(jié)果對(duì)80份蠶豆材料進(jìn)行分組,并在不同組別中隨機(jī)選取32份蠶豆DNA混合后對(duì)100對(duì)SSR引物進(jìn)行初篩。初篩結(jié)果表明,100對(duì)SSR引物中有50對(duì)PCR擴(kuò)增出產(chǎn)物,有效擴(kuò)增率50%。隨后利用80份蠶豆材料對(duì)初篩的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其中32對(duì)SSR引物表現(xiàn)出多態(tài)性,多態(tài)性引物比率占有效擴(kuò)增引物的64%,占所選取總引物的32%。引物FabaSSR09、27擴(kuò)增條帶清晰,多態(tài)性較好,如圖2所示。

圖2 SSR引物FabaSSR09、FabaSSR27在80份蠶豆材料中的PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of SSR primers FabaSSR09 and FabaSSR27 in 80 faba bean varieties

2.4 蠶豆SSR分子標(biāo)記多態(tài)性分析

在100對(duì)SSR引物中篩選得到32對(duì)多態(tài)性好的引物,利用這32對(duì)引物對(duì)80份蠶豆種質(zhì)資源材料基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,32對(duì)SSR多態(tài)性引物及多態(tài)性信息結(jié)果如表4。32對(duì)SSR引物在80份材料中共檢測到220個(gè)等位變異,等位變異變化范圍為2～21個(gè),平均每個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)為6.875個(gè)。多態(tài)性位點(diǎn)最豐富的是FabaSSR29標(biāo)記,有21個(gè)等位基因;引物FabaSSR22檢測出的等位變異最少,只有2個(gè)。多態(tài)信息量(PIC)的變幅為0.25(FabaSSR02)～0.82(FabaSSR09),平均值為0.58,PIC值大于平均數(shù)的占比為56.25%,表明本研究開發(fā)的SSR標(biāo)記基因多樣性較高。其中SSR引物FabaSSR09在高抗和易感材料間擴(kuò)增出多態(tài)性條帶(擴(kuò)增出2條帶及以上的材料均為高抗材料),推測該標(biāo)記與蠶豆抗綠豆象性狀相關(guān),可用于蠶豆抗豆象材料的鑒定以及選育抗豆象品種。

表4 32對(duì)多態(tài)性SSR引物相關(guān)信息Table 4 Correlation information of 32 pairs of polymorphic SSR primers

2.5 蠶豆種質(zhì)資源材料聚類分析

利用32對(duì)SSR引物對(duì)蠶豆材料進(jìn)行鑒定,利用NTSYSpc2.1軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析,樹狀聚類圖結(jié)果(圖3)顯示,在相似系數(shù)0.70處將80份蠶豆材料可分為兩大類。第一大類包含65份材料,其中69(CD0112)、70(CD0283)為HS品種,78(CD0156)為S品種,其余為HR品種;第二大類包含15份材料,其中50(CD0254)、54(CD0279)、65(Y01-102-22)、66(Y04-111-3-1-3)、67(Y05-131-25)為HR品種,68(87-106-1-1)為MR品種,71(Y04-008)、72(Y04-210-1-1)、73(Y04-215-1-1)、74(Y05-131-4)、75(Y05-131-11-1-1)、76(Y10-613)、77(靖04-212-1-4)為HS品種,79(Y01-1021-91)、80(Y01-102-2)為S品種。聚類結(jié)果與蠶豆材料的抗性分級(jí)關(guān)系基本相符。

圖3 80份蠶豆材料UPGMA聚類圖Fig.3 Dendrogram of 80 faba bean varieties by SSR-UPGMA based on genetic similarities

3 討 論

種質(zhì)資源遺傳多樣性是作物種質(zhì)資源鑒定和遺傳改良的基礎(chǔ)。早期蠶豆的遺傳多樣性研究主要集中在其農(nóng)藝性狀(株高、籽粒大小、有效分支數(shù),百粒重等)等方面。姜翠棉等[27]通過對(duì)國內(nèi)外不同地理來源的637份蠶豆資源的18個(gè)形態(tài)性狀(見花期、株高、單柱莢數(shù)、單株粒數(shù)、百粒重等)進(jìn)行調(diào)查,研究表明國內(nèi)春冬性蠶豆資源間,以及國內(nèi)外蠶豆資源間的遺傳變異大;三維主成分分析顯示參試資源由三大基因庫構(gòu)成,包括國內(nèi)春播區(qū)資源、中國秋播區(qū)資源和國外資源。與其他豆科作物相比,蠶豆的基因組資源相對(duì)匱乏。雖然由于DNA測序技術(shù)的發(fā)展大大降低了測序成本,蠶豆的遺傳及基因組信息得到進(jìn)一步加強(qiáng)。但其龐大的基因組(約13 Gb)阻礙了蠶豆的發(fā)展。近年來,轉(zhuǎn)錄組測序等技術(shù)已被用于組裝轉(zhuǎn)錄本和量化基因表達(dá),并被廣泛用于植物的基因挖掘和引物開發(fā)。盡管已經(jīng)在蠶豆中開發(fā)了大量的SSR標(biāo)記,但相對(duì)于蠶豆龐大的基因組而言還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。楊濤等[16]利用羅氏454測序技術(shù)從247個(gè)春播和秋播蠶豆基因型的混合基因組中構(gòu)建了一個(gè)具有125 559條推定SSR序列的文庫,并對(duì)其重復(fù)類型和長度進(jìn)行了闡述。設(shè)計(jì)了28 503對(duì)引物,隨機(jī)選擇150對(duì)進(jìn)行驗(yàn)證。其中94對(duì)引物在選自不同地理位置的32個(gè)蠶豆基因型中表現(xiàn)出多態(tài)性。Sima等[28]概述了下一代測序(NGS)技術(shù)在挖掘和開發(fā)植物新的SSR標(biāo)記中的應(yīng)用,表明NGS技術(shù)是開發(fā)植物種群SSR標(biāo)記的一種有效方法,特別是對(duì)于遺傳信息未知的非模式植物。Mokhtar等[29]對(duì)前人研究進(jìn)行了匯總整理,搭建了在線平臺(tái)VfODB(http://vfodb.easyomics.org/.)。作為一個(gè)綜合數(shù)據(jù)庫,里面包含了蠶豆的種質(zhì)信息、各類標(biāo)記信息、遺傳圖譜等相關(guān)資源,可供研究人員使用。由于目前可用的蠶豆SSR引物不多,所以本研究通過測序開發(fā)了一定數(shù)量的SSR引物,其中32對(duì)SSR引物在供試蠶豆材料中表現(xiàn)出多態(tài)性。

隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展,人們開始利用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行種質(zhì)資源遺傳多樣性分析等方面的研究。楊訪問等[30]選取50對(duì)SSR引物對(duì)41份非洲和湖北蠶豆資源進(jìn)行SSR遺傳多樣性分析。研究表明供試41份蠶豆材料有一定遺傳多樣性,但豐富度不高,蠶豆的遺傳多樣性與其地理起源相關(guān)。目前,蠶豆育種工作者已經(jīng)針對(duì)某些病害成功培育出抗性品種,但進(jìn)展緩慢,因?yàn)樾Q豆的科研投入不足,導(dǎo)致對(duì)大多數(shù)已鑒定抗性的遺傳基礎(chǔ)以及病蟲害的病因和遺傳多樣性了解不足。雖然已經(jīng)確定了一系列抗性來源,針對(duì)蠶豆銹病、蠶豆枯萎病、列當(dāng)屬植物寄生抗性等已經(jīng)開發(fā)了一些DNA標(biāo)記。但在大多數(shù)情況下,它們的表型表達(dá)都沒有得到充分的描述,而且它們的遺傳基礎(chǔ)在很大程度上是未知的。其中沒有關(guān)于蠶豆豆象抗性遺傳信息方面的報(bào)道[31]。雖然對(duì)于蠶豆抗豆象種質(zhì)資源的分子遺傳基礎(chǔ)等方面的研究較少,但在豆科其他作物中有相關(guān)的報(bào)道。劉長友等[32]以抗豆象栽培綠豆V1128為父本、感豆象栽培品種冀綠7號(hào)為母本雜交構(gòu)建F2分離群體。通過對(duì)群體進(jìn)行抗豆象鑒定以及利用混合群體分離分析法 (BSA法) 篩選抗感池間的多態(tài)性標(biāo)記構(gòu)建連鎖圖譜,最終將抗豆象基因Br3定位在綠豆染色體5上,位于標(biāo)記DMB158和VRBR-SSR033之間。Prakit等[33]對(duì)蛾豆種子的綠豆象抗性進(jìn)行了QTL定位分析,揭示了對(duì)綠豆象抗性的一個(gè)主效QTL和一個(gè)修飾QTL,分別命名為qVacBrc2.1和qVacBrc5.1。qVacBrc2.1 位于SSR標(biāo)記 CEDG261 和 DMB-SSR160 之間的連鎖群 2 上。本試驗(yàn)利用32對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)80份蠶豆抗豆象相關(guān)種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析,在一定程度上反映了80份蠶豆材料的親緣關(guān)系,80份蠶豆種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)分布在0.69～0.90,表明不同蠶豆材料之間存在一定差異,但差異不大,各品種之間親緣關(guān)系較近,遺傳背景較窄,這與前人的研究結(jié)果基本一致[34]。聚類分析表明參試材料的遺傳多樣性與其抗性分級(jí)有關(guān)。試驗(yàn)材料的遺傳相似系數(shù)分布表明參試材料在分子水平上遺傳差異不大,遺傳背景較狹窄。這個(gè)問題在蠶豆育種中普遍存在,可能是因?yàn)樾Q豆作為常異花授粉植物,天然異交率很高,因此亟需加強(qiáng)對(duì)地方種質(zhì)資源的保護(hù)利用以及新種質(zhì)資源的引進(jìn),從而豐富育種基礎(chǔ)。從樹狀聚類圖中觀察到63和64號(hào)蠶豆材料聚類未分離,其原因可能是本研究所用的SSR引物數(shù)量有限,缺乏合適的引物區(qū)分這2個(gè)材料,因此在利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳多樣性分析時(shí),應(yīng)選取足夠多的SSR引物,并且所選SSR引物多態(tài)性位點(diǎn)應(yīng)該豐富,并且要盡可能覆蓋植物整個(gè)基因組。

4 結(jié) 論

以80份對(duì)豆象不同抗性分級(jí)的蠶豆種質(zhì)資源為材料,從基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)開發(fā)的100對(duì)SSR引物中篩選出32對(duì)有多態(tài)性、條帶清晰的引物。利用32對(duì)多態(tài)性SSR引物分析了80份蠶豆種質(zhì)資源的遺傳多樣性,80份蠶豆材料在遺傳相似系數(shù)0.70處被劃分為兩大類,分類結(jié)果與蠶豆品種抗性分級(jí)基本相符。開發(fā)的分子標(biāo)記擴(kuò)充了蠶豆SSR引物數(shù)據(jù)庫的數(shù)量,可用于蠶豆種質(zhì)資源的鑒定、構(gòu)建遺傳連鎖圖譜以及分子標(biāo)記輔助選擇育種等方面的研究。通過對(duì)蠶豆抗豆象種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析,可為今后蠶豆種質(zhì)資源的保護(hù)利用和品種鑒定以及培育新品種提供理論參考依據(jù)。