趙 霞,愛(ài)倫高娃,馬躍軍,樊 東,烏仁圖亞,娜仁花,吉林臺(tái),*

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031;2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院;3.赤峰市巴林左旗畜牧工作站;4.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué))

提高精液冷凍保存效果是實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量發(fā)展人工授精技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié),也是建立現(xiàn)代畜牧業(yè)遺傳資源庫(kù)的重要策略之一。選取優(yōu)質(zhì)凍精資源進(jìn)行人工授精不僅可以從源頭上減少生殖疾病的傳播,還可以提高優(yōu)秀種質(zhì)資源的改良速度,增加對(duì)遺傳特性和生產(chǎn)性能的高效選擇。目前,因綿羊精子易受低溫環(huán)境的影響發(fā)生冷休克現(xiàn)象,我國(guó)綿羊精液的冷凍保存技術(shù)尚未取得實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展;羊精液的冷凍保存過(guò)程中,溫度和滲透壓的改變會(huì)嚴(yán)重降低精子活力,產(chǎn)生精子膜功能受損、脂質(zhì)過(guò)氧化和冷凍保護(hù)劑的毒害等現(xiàn)象,降低精子與卵母細(xì)胞的結(jié)合能力,因此,優(yōu)化冷凍精液生產(chǎn)工藝對(duì)于綿羊精液的長(zhǎng)期高效保存具有重要意義。

蛋黃作為冷凍保護(hù)劑廣泛用于精液的冷凍保存,可以穩(wěn)定精子頂體膜并在解凍時(shí)降低耗氧量。但是,配制冷凍稀釋液時(shí),蛋黃質(zhì)量難以控制,存在病毒感染源和過(guò)敏原的風(fēng)險(xiǎn),并且蛋黃中特殊成分能與精清中酶類物質(zhì)相互作用,所產(chǎn)生的物質(zhì)對(duì)精子具有毒害作用。通常在稀釋前通過(guò)去除部分精清,降低蛋黃的毒害作用,從而提高解凍后的精子質(zhì)量。此外,蛋黃內(nèi)微生物所釋放的內(nèi)毒素會(huì)降低精子的受精潛力。

因此,蛋黃作為冷凍保護(hù)劑具有潛在的風(fēng)險(xiǎn),從生物安全方面考慮,選擇不含動(dòng)物源性的冷凍保護(hù)劑十分必要。相關(guān)研究表明,大豆卵磷脂(Soybean lecithin,SL)可以替代動(dòng)物源性冷凍保護(hù)劑保存人類、牛和山羊的精液。但截至目前,未見SL在東佛里生奶綿羊精液冷凍保存中使用的報(bào)道。本研究旨在評(píng)價(jià)不同濃度SL在奶綿羊精液冷凍保存中的效果,以添加蛋黃的冷凍精液稀釋液作為對(duì)照組,評(píng)價(jià)不同處理組對(duì)精子活率、頂體完整率和妊娠率的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和精液采集 本研究選用來(lái)自同一飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下的5只優(yōu)秀東佛里生奶種公羊;實(shí)驗(yàn)前40 d,對(duì)每只種公羊的日糧添加胡蘿卜和雞蛋,并自由取水;保持每天3～5 km早晚各一次的定時(shí)定量運(yùn)動(dòng)并使用假陰道法從公羊體內(nèi)收集精液。

1.1.2 試驗(yàn)藥品 Tris( 三羥甲基氨基甲烷)、果糖、檸檬酸、甘油和大豆卵磷脂(SL)購(gòu)自Sigma-Aldrich (USA)公司;伊紅、青霉素、鏈霉素購(gòu)自國(guó)內(nèi)。

1.1.3 儀器設(shè)備 電子天平(日本)、生物相差顯微鏡(尼康)、全自動(dòng)精子分析儀(美國(guó)HamiltonThome lvos ll)、0.25 mL麥管(法國(guó))、封口粉(日本);血細(xì)胞計(jì)、超聲波細(xì)胞粉碎儀、pH測(cè)試儀、恒溫版、恒溫水浴鍋、細(xì)管架、冰箱、剪刀和自制泡沫冷凍箱,以上設(shè)備均來(lái)自國(guó)內(nèi)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 稀釋液的配制 Tris基礎(chǔ)稀釋液的配置:所需化學(xué)藥品Tris、果糖、檸檬酸用萬(wàn)分之一分析天平精準(zhǔn)稱量(表1),放入100 mL的燒杯內(nèi),加入50 mL雙蒸水后用玻璃棒進(jìn)行攪勻,定容至100 mL后倒入三角瓶封口高壓滅菌;冷卻后分別加入青霉素、鏈霉素配制成pH為6.8的基礎(chǔ)稀釋液。

表1 Tris基礎(chǔ)稀釋液配方

Ⅰ號(hào)稀釋液的配制(對(duì)照組):在Tris基礎(chǔ)液中分別加入18%蛋黃和7%滅菌的甘油,用超聲波儀進(jìn)行加速溶解和離心,使用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾后備用。

Ⅱ-Ⅵ稀釋液的配制(試驗(yàn)組):在Tris基礎(chǔ)稀釋液中分別加入不同濃度的大豆卵磷脂(0.5%、1.0%、1.5%、2%、2.5%)和7%滅菌的甘油(表2),用超聲波儀進(jìn)行加速溶解和離心,使用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾后備用。

表2 不同添加劑稀釋液的配方 %

1.2.2 精液采集和質(zhì)量檢測(cè) 使用假陰道法采集精液后,立即將精液放置于34℃恒溫水浴鍋中的試管,靜置10～15 min后觀察精液顏色,檢測(cè)精子活率、精子密度和射精量。選擇射精量在0.5～2 mL、精子濃度為1.5～2×109精子/ mL、精子活率大于85%、異常精子率小于10%的精液備用。

1.2.3 精液冷凍處理 為消除個(gè)體間差異,將采集的不同公羊的精液混合,分成六等份,分別用Ⅰ-VI號(hào)稀釋液進(jìn)行等溫稀釋,稀釋至最終濃度為4.0×107個(gè)精子/ mL,并置于37℃水浴鍋中平衡10 min,平衡后的精液裝入0.25 mL麥管中,并用聚乙烯醇密封。將所有麥管用純棉毛巾或紗布包裹放入4℃冰箱中平衡3 h,再將麥管放置在距離液氮表面3 cm處熏蒸10～12 min,然后收集麥管投入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 凍精細(xì)管解凍后的質(zhì)量評(píng)定 凍精細(xì)管在37℃水浴鍋中解凍30s,依照常規(guī)方法檢測(cè)解凍后的精子活率、存活時(shí)間、死精子率和頂體完整率。根據(jù)Mortimer標(biāo)準(zhǔn),精子頸部區(qū)域呈現(xiàn)輕微粉紅色或紅色的歸類為活精子。

1.2.5 腹腔鏡輸精 腹腔鏡輸精技術(shù)與同期發(fā)情技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行輸精。上述方法冷凍的精液解凍后借助腹腔內(nèi)窺鏡,采用套管針穿刺方法,將精液直接輸入到發(fā)情后30～36 h母羊的(術(shù)前空腹12 h以上)子宮角,做到“精準(zhǔn)輸精”。

1.2.6 母羊管理及妊娠診斷 輸精后的母羊每天補(bǔ)飼優(yōu)質(zhì)干草、青干草、青貯飼料,妊娠后期適量補(bǔ)充精料、微量元素等。輸精后35～40 d使用羊用B超儀檢測(cè)妊娠情況,統(tǒng)計(jì)妊娠母羊數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)得到的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),進(jìn)一步用Etukey-Kramer檢驗(yàn)評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異,當(dāng)P<0.05時(shí),差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同冷凍稀釋液對(duì)精子活率、頂體完整率的影響

精液分別用冷凍稀釋液Ⅰ(對(duì)照組)和冷凍稀釋液Ⅱ-Ⅵ(試驗(yàn)組)稀釋,在4℃冰箱中降溫平衡3 h,用液氮熏蒸冷凍后投入液氮中保存。解凍后檢查其活率和頂體完整率,結(jié)果見表3。

表3 不同稀釋液對(duì)精子活率、頂體完整率的影響 %

表3顯示,0.5%、2.5%SL組精子解凍后活率和頂體完整率低于其他組(P<0.05);18%蛋黃和1%、1.5%、2%SL組精子解凍后活率和頂體完整率顯著高于其他各組,且顯著高于0.5%和2.5%組(P<0.05)。

2.2 不同稀釋液對(duì)冷凍精液受胎率的影響

表4顯示,添加18%蛋黃和1.0%～1.5%SL冷凍稀釋液稀釋的精液,人工授精后母羊的妊娠率之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表4 不同稀釋液對(duì)冷凍精液受胎率的影響 只,%

3 討論

在大多數(shù)動(dòng)物精液冷凍過(guò)程中,蛋黃作為高效的冷凍保護(hù)劑而廣泛應(yīng)用。但是,禽類的蛋黃作為精液冷凍保護(hù)劑容易受到病原體和細(xì)菌的污染,并有可能導(dǎo)致疾病的傳播,而面臨衛(wèi)生安全問(wèn)題,直接影響精液品質(zhì)。此外,因蛋源不同或蛋源不明會(huì)導(dǎo)致無(wú)法控制其質(zhì)量。因此,世界各地實(shí)驗(yàn)室在不斷研究可以替代動(dòng)物源性蛋黃的新型精液冷凍保護(hù)劑。而大豆卵磷脂是一種植物源性冷凍保護(hù)劑,是高分子量脂蛋白和磷脂的替代品,即可降低動(dòng)物源性冷凍保護(hù)劑的衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn),又能防止稀釋、冷卻和超低溫保存過(guò)程中對(duì)精子質(zhì)膜的損傷。研究表明,SL用于冷凍牛精液、公羊精液和山羊精液效果顯著。所以,精液冷凍保存過(guò)程中,使用非動(dòng)物源性的冷凍保護(hù)劑代替蛋黃是提高羊冷凍精液安全生產(chǎn)效率和冷凍精液受精率的關(guān)鍵所在。

Waterhouse等研究報(bào)道表示,大豆卵磷脂在冷凍過(guò)程中的保護(hù)作用是通過(guò)磷脂在降低至冰點(diǎn)過(guò)程中減少冰晶的形成而實(shí)現(xiàn)。磷脂是蛋黃和大豆卵磷脂磷酸鹽的主要成分,外源磷脂可以取代精子質(zhì)膜的磷脂,維持精子質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和功能的正常運(yùn)行。因此在精子冷凍過(guò)程中,這種植物性磷脂能夠有效降低精子質(zhì)膜的氧化受損。本研究結(jié)果顯示,在奶綿羊精液冷凍保存液中添加濃度為1%～2%的大豆卵磷脂,能使精子解凍后的活率、頂體完整率和妊娠率均與蛋黃作為保護(hù)劑所得效果無(wú)顯著差異,表明SL在奶綿羊精液冷凍過(guò)程中對(duì)精子起到了保護(hù)作用。

另外,本試驗(yàn)在添加1% 、1.5%SL稀釋液稀釋奶綿羊精液時(shí)發(fā)現(xiàn),SL對(duì)精子的運(yùn)動(dòng)速度有明顯的促進(jìn)作用,這可能與蛋黃稀釋液黏度高于SL稀釋液有關(guān),高黏度環(huán)境會(huì)阻礙精子的運(yùn)動(dòng)速度。但是,高濃度的SL對(duì)精子活力和存活能力有一定的毒性作用。稀釋液中加入高濃度的SL會(huì)增加稀釋液的黏度,而稀釋液中的雜物也會(huì)降低精子的受精能力,這可能與稀釋液的滲透壓有關(guān)。稀釋液中滲透壓隨著SL濃度的增加而降低,導(dǎo)致精子發(fā)生損傷現(xiàn)象。

由于較高濃度的SL可能存在對(duì)精子的毒害作用,而較低濃度可能不足以保護(hù)精子,所以稀釋液中的大豆卵磷脂含量存在一個(gè)臨界值。這與本試驗(yàn)結(jié)果相一致,當(dāng)SL添加濃度為1%～2%時(shí),公羊精液解凍后精子活率和頂體完整率較高,而SL添加濃度為0.5%和2.5%時(shí),精子活率和頂體完整率下降。所以,在東佛里生奶綿羊精液冷凍保存稀釋液中大豆卵磷脂最佳濃度為1%～2%。且Khalifa等報(bào)道,添加大豆卵磷脂的冷凍精液在輸精后獲得了較理想的受胎率,與蛋黃凍精受胎率無(wú)顯著差異。

綜上所述,大豆卵磷脂可以取代蛋黃作為精液冷凍保護(hù)劑,并在精液冷凍-解凍過(guò)程中對(duì)精子發(fā)揮保護(hù)作用,其最佳添加濃度為1%～2%。這為商業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化地生產(chǎn)綿羊冷凍精液奠定基礎(chǔ),提高綿羊凍精的冷凍效果,促進(jìn)羊凍精供種的進(jìn)程。