李 繁,吳寒光, 段新華, 施遠(yuǎn)國, 羅國強(qiáng), 陳雨晴, 李穎鑫

(深圳市動物疫病預(yù)防控制中心, 廣東 深圳 518052)

狂犬病是由彈狀病毒科的狂犬病毒(Rabies virus, RV)引起的人畜共患傳染病,主要在野生動物(狼、狐貍、鼬鼠、蝙蝠等)及家養(yǎng)動物(狗、貓、牛等)中流行傳播。人狂犬病主要被患病動物咬傷所致,或與密切接觸有關(guān),感染發(fā)病后進(jìn)展速度快,病死率高達(dá)100%。動物接種狂犬病疫苗是預(yù)防人狂犬病最有效的手段,因此加強(qiáng)犬、貓的狂犬病免疫工作具有十分重要的公共衛(wèi)生意義。

動物接種疫苗后,科學(xué)評價免疫效果有賴于準(zhǔn)確檢測和監(jiān)測血清中狂犬病免疫抗體水平,現(xiàn)有的檢測方法有多種,如熒光抗體病毒中和試驗(FAVN)、快速熒光灶抑制試驗(RFFIT)、小鼠病毒中和試驗(MNT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等,前三種方法特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好,但都需要活病毒,試驗時間長,對實(shí)驗室生物安全條件和儀器設(shè)備配置要求高,不適合在基層檢測中推廣應(yīng)用。而ELISA檢測操作簡便快捷,成本也不高,近年來已有商品化的試劑盒應(yīng)用于狂犬病免疫抗體的監(jiān)測,以評估免疫效果。本研究以FAVN法為標(biāo)準(zhǔn),對ELISA檢測的符合率、特異性、靈敏度、假陽性、假陰性、OD值區(qū)間分布等參數(shù)進(jìn)行全面分析,探討ELISA方法的應(yīng)用價值,為基層檢測業(yè)務(wù)的開展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑盒 狂犬病毒抗體ELISA檢測試劑盒,批號:RV20211008E,由國內(nèi)某生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 儀器 洗板機(jī):BIOTEX ELX808,酶標(biāo)儀:BIOTEX ELX50,精密移液器:Eppendorf。

1.1.3 檢測樣品 犬血清。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 犬只來自深圳市10個行政區(qū),隨機(jī)采樣,無菌采血3mL,凝固后分離血清于離心管中,一式兩份,-20℃保存待檢。

1.2.2 中和試驗 委托軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所OIE狂犬病參考實(shí)驗室檢測,檢測方法為熒光抗體病毒中和試驗(FAVN)。中和效價≥0.5 IU/mL,判樣品陽性,表示該份血清的來源動物具備狂犬病免疫保護(hù)能力,中和效價<0.5 IU/mL,判樣品陰性,表示該份血清的來源動物無狂犬病免疫保護(hù)能力。

1.2.3 ELISA檢測 嚴(yán)格按試劑盒使用說明書進(jìn)行樣品稀釋、加樣、孵育、洗板、顯色、終止反應(yīng)、讀板等操作。以酶標(biāo)儀雙波長450nm和630nm讀取OD值,并計算A值和S/CO值:A值=OD450nm- OD630nm,S/CO值=樣品A值/臨界對照A值。當(dāng)S/CO值≥1.0,判樣品陽性;S/CO值<1.0,判樣品陰性。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析處理 采用SPSS軟件對檢測結(jié)果分析處理,進(jìn)行一致性檢驗,計算Kappa值,評估ELISA與FAVN的檢測結(jié)果一致性,并對陽性符合率、陰性符合率、總符合率、特異性、靈敏度、OD值與抗體水平的關(guān)聯(lián)性和分布等進(jìn)行計算分析。

2 結(jié)果與數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2.1 樣品定性檢測結(jié)果

結(jié)果見表1,共檢測了來自深圳市10個行政區(qū)的290份犬血清,FAVN法檢測為陽性樣品260份、陰性樣品30份,ELISA法檢測為陽性樣品228份、陰性樣品62份。

上表數(shù)據(jù),經(jīng)采用SPSS軟件進(jìn)行診斷結(jié)果一致性檢驗,Kappa值為0.545。

260份FAVN法陽性樣品中,ELISA法檢測為226份陽性,陽性符合率為86.92%;30份FAVN法陰性樣品中,ELISA法檢測為28份陰性,陰性符合率為93.33%;總符合率為87.59%(254/290)

2.2 不同中和效價的樣品檢測結(jié)果

FAVN法中和效價≥0.5 IU/mL,判樣品陽性,中和效價<0.5 IU/mL,判樣品陰性。將陰性樣品分類設(shè)2個中和效價區(qū)間,陽性樣品設(shè)10個中和效價區(qū)間,分別對ELISA法檢測結(jié)果的符合率進(jìn)行了分區(qū)間計算,結(jié)果見表2和圖1。符合率最高為100%,最低為55.88%。

圖1 不同中和效價的樣品ELISA法檢測結(jié)果符合率

表2 不同中和效價的樣品ELISA法檢測結(jié)果

2.3 相同中和效價的樣品檢測結(jié)果

選取表2中ELISA法與FAVN法檢測結(jié)果一致的樣品,分析同一中和效價的不同樣品的OD值大小分布區(qū)間。考慮統(tǒng)計數(shù)量的要求,選擇了同一中和效價的樣品數(shù)量≥20份者,其中4.5 IU/mL樣品34份,13.5 IU/mL樣品55份,40.5 IU/mL樣品55份。以上144份樣品OD值經(jīng)計算S/CO值最高為7.3。S/CO值分區(qū)間統(tǒng)計結(jié)果見表3和圖2～圖4。

圖3 中和效價13.5IU/mL的樣品ELISA檢測S/CO值分布圖

圖4 中和效價40.5IU/mL的樣品ELISA檢測S/CO值分布圖

表3 相同中和效價的樣品ELISA檢測S/CO值區(qū)間分布

表3數(shù)據(jù)和圖2～圖4分布圖顯示,中和效價4.5 IU/mL和13.5 IU/mL的樣品無S/CO值≥6.0的檢測值,其它各S/CO值區(qū)間均有分布。中和效價4.5 IU/mL的樣品S/CO值在1.0～1.9區(qū)間的百分率最高(47.06%),中和效價13.5 IU/mL的樣品S/CO值在4.0～4.9區(qū)間的百分率最高(30.91%);中和效價40.5 IU/mL的樣品S/CO值在2.0～2.9區(qū)間的百分率最高(27.27%),4.0～4.9區(qū)間的百分率為25.45%。

3 討論

3.1 免疫保護(hù)屏障

當(dāng)犬群免疫覆蓋率達(dá)到70%以上時,即可有效抑制狂犬病的傳播 。熒光抗體病毒中和試驗(FAVN)是國際獸醫(yī)局(OIE)推薦用于檢測動物血清狂犬病抗體活性的方法。本次研究檢測樣品來自深圳10個行政區(qū),FAVN法檢測免疫保護(hù)合格率達(dá)89.66%;經(jīng)初步分析犬只免疫史,發(fā)現(xiàn)成年和經(jīng)多次免疫的犬血清中和效價水平都較高,而幼年犬、僅初免或未按要求加強(qiáng)免疫的,則中和效價水平較低或不合格。深圳市2006年頒布《深圳市養(yǎng)犬管理條例》,實(shí)行狂犬病免費(fèi)強(qiáng)制免疫制度,市政府將每年的4月和9月定為犬類狂犬病強(qiáng)制免疫行動月,不斷提高免疫率,并將狂犬病疫苗經(jīng)費(fèi)納入財政預(yù)算,統(tǒng)一采購進(jìn)口狂犬病滅活疫苗,以提高免疫質(zhì)量。經(jīng)多年的免疫效果監(jiān)測發(fā)現(xiàn),深圳市的犬類狂犬病免疫抗體合格率一直保持在較高水平,建立了良好的免疫保護(hù)屏障。

3.2 定性檢測

Kappa檢驗常用于評價待驗證的診斷實(shí)驗方法與金標(biāo)準(zhǔn)的一致性,Kappa取值0～1之間,Kappa≥0.75,說明兩種方法診斷結(jié)果一致性較好; 0.4≤Kappa<0.75,說明兩種方法診斷結(jié)果一致性一般; Kappa<0.4,說明兩種方法診斷結(jié)果一致性較差。本研究數(shù)據(jù)經(jīng)采用SPSS軟件對FAVN法和ELISA方法進(jìn)行診斷結(jié)果一致性檢驗,Kappa值為0.545,表明該ELISA檢測試劑盒的結(jié)果為中度一致。王培等曾比較6種國產(chǎn)和進(jìn)口的不同品牌的商品化試劑盒,Kappa值由高至低依次為:0.583、0.549、0.465、0.370、0.184、0.105,前兩種均為進(jìn)口試劑盒,本次試驗所用試劑盒Kappa值為0.545,說明檢測效能與進(jìn)口產(chǎn)品相近。

陽性符合率通常用于評估檢測的靈敏度,而陰性符合率是檢測特異性的重要指標(biāo),本次試驗所用ELISA試劑盒的陽性符合率為86.92%;陰性符合率為93.33%;總符合率為87.59%。說明特異性強(qiáng),出現(xiàn)假陽性的概率較小,相比較則陽性符合率略低,說明產(chǎn)品的靈敏度有待提高,檢測時出現(xiàn)假陰性的概率會大于出現(xiàn)假陽性的概率,在基層應(yīng)用ELISA法檢測時,對檢測結(jié)果分析時應(yīng)予注意。

從不同中和效價的樣品檢測結(jié)果可以看出,中和效價0.00～0.20 IU/mL和中和效價≥15.01的樣品符合率均為100%,說明這些中和效價區(qū)間的樣品ELISA法檢測時不會出現(xiàn)假陽性和假陰性。符合率最低的為中和效價0.51～ 2.00 IU/mL的樣品,符合率僅為55.88%;其次為中和效價0.5 IU/mL的樣品,符合率為62.5%;說明這兩個中和效價區(qū)間的樣品,ELISA法檢測時容易出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。隨著中和抗體效價的升高,符合率也逐步提高,這提示在作免疫效果評價時,若為初次免疫,且接種后時間不長的犬只,建議對ELISA法檢測的陰性結(jié)果進(jìn)一步進(jìn)行驗證。

動物免疫應(yīng)答產(chǎn)生的抗體水平為包含中和抗體在內(nèi)的所有抗體的總和,其特異性結(jié)合位點(diǎn)既有狂犬病毒顆粒內(nèi)部的結(jié)構(gòu)蛋白或酶,也有病毒外部蛋白表位如糖蛋白等, 因此血清抗體水平始終不能代表保護(hù)性中和抗體的水平,這也是ELISA法與FAVN法檢測結(jié)果有差異的根本原因。不同品牌廠家的產(chǎn)品,由于生產(chǎn)工藝和技術(shù)不同,其酶標(biāo)板上包被不同的抗原或者不同的單抗或多抗,純度也有差異,此外疫苗種類和來源不同,其免疫應(yīng)答抗體的組成和水平也會有差異,因此ELISA法檢測結(jié)果的可靠性受多種因素的影響,建議各地應(yīng)通過采集當(dāng)?shù)厝谎暹M(jìn)行試劑盒比對試驗,選擇特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好的產(chǎn)品用于免疫抗體水平監(jiān)測的初步篩查。

3.3 定量檢測

本次試驗中和效價4.5 IU/mL和13.5 IU/mL的樣品無S/CO值≥6.0的檢測值,47.06%中和效價4.5 IU/mL的樣品其S/CO值區(qū)間為1.0～1.9;而中和效價為40.5 IU/mL的樣品則有9%的檢測值為S/CO值≥6.0。但更需要注意的是,在ELISA法檢測S/CO值(1.0～5.9)由低至高的各個區(qū)間中,相同區(qū)間內(nèi)各個中和效價的陽性樣品均有分布,也就是說中和效價與S/CO值兩者之間并不存在一一對應(yīng)的線性關(guān)系,高中和效價的樣品其S/CO值可能也會小于低中和效價的樣品,反之,低中和效價的樣品其S/CO值可能也會高于高中和效價的樣品。因此利用ELISA法作為檢測狂犬病免疫保護(hù)抗體水平的定量檢測方法,其有效性難以確認(rèn)。

于鵬程等通過檢測60份免疫后的人血清,認(rèn)為ELISA法可用于定量檢測0.5～10 IU/mL的有效線性范圍的血清樣本,與本次研究的結(jié)果有異,可能與所用試劑盒不同有關(guān),而且人和動物的血清樣本、以及免疫疫苗和抗體結(jié)構(gòu)等均有差異。袁潔等在對廣州地區(qū)家養(yǎng)犬只開展免疫抗體水平監(jiān)測中也發(fā)現(xiàn)ELISA在測定具體的抗體滴度方面與FAVN仍有較大誤差。我們認(rèn)為,在檢測動物血清樣本時,與FAVN法的金標(biāo)準(zhǔn)比較,ELISA方法的定性效能尚存在諸多差異,若用于定量檢測,需要做更廣泛深入的研究。