豆 玲,周 峰,★,高軍軍,王雪瑩,王志宇,康文彪,*

(1.甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,甘肅 蘭州 730046;2.英科新創(chuàng)(蘇州)生物科技有限公司)

根據(jù)快速準(zhǔn)確診斷綿羊痘/山羊痘的實(shí)際需求,我們成功建立了綿羊痘病毒和山羊痘病毒通用RPA檢測(cè)方法,為了保證該方法在應(yīng)用中的準(zhǔn)確性和可靠性,我們選用臨床癥狀與綿羊痘/山羊痘相似疫病的病原(口蹄疫病毒、傳染性膿皰皮炎病毒)、其他痘病毒(雞痘病毒)、綿羊痘病毒、羊痘疫苗和羊痘重組質(zhì)粒樣本進(jìn)行了該RPA檢測(cè)方法特異性試驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

1份羊痘疫苗、3份羊痘病毒核酸陽(yáng)性樣本(RPO35基因片段克隆至載體pUC57后制作的重組質(zhì)粒)、2份口蹄疫病毒核酸陽(yáng)性樣本(疫苗)、2份羊傳染性膿皰皮炎病毒核酸陽(yáng)性樣本(疫苗)、2份雞痘病毒陽(yáng)性樣本(疫苗)、1份陽(yáng)性對(duì)照、2份陰性對(duì)照。

1.2 主要試劑和儀器

核酸(DNA/RNA)提取試劑盒購(gòu)自哈爾濱元亨公司。RPA試劑盒(Twist Basic及Twist nfo)購(gòu)自英國(guó)Twist Dx公司。HybriDetect 1試紙條購(gòu)自Milenia公司。國(guó)產(chǎn)RPA試劑購(gòu)自先達(dá)公司。國(guó)產(chǎn)試紙條購(gòu)自英科新創(chuàng)公司。恒溫水浴鍋購(gòu)自Heal force公司。高速離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf公司。

1.3 核酸提取

DNA和RNA的提取按照周峰等文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行提取,保存。

1.4 RPA擴(kuò)增

按照表1配制Rehydration Solution溶液。

表1 Rehydration Solution溶液組分

表2 引物序列

在試劑盒準(zhǔn)備的8聯(lián)管中配制Rehydration Solution溶液完成后,總體積為46.5 μL,混勻復(fù)溶。將2.5 μL醋酸鎂與1 μL模板混合均勻后,加入8聯(lián)管中,隨后將8聯(lián)管放入水浴鍋中,37℃反應(yīng)15min。反應(yīng)結(jié)束后,取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物至1.5 mL離心管中,用稀釋液20倍稀釋,混勻后,將試紙條插入離心管中,等待15 min后查看反應(yīng)結(jié)果。反應(yīng)體系最終鎂離子濃度為21 mmol/L。

2 結(jié)果

特異性試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出,建立的綿羊痘病毒和山羊痘病毒通用RPA檢測(cè)方法的特異性良好,對(duì)羊痘疫苗、羊痘重組質(zhì)粒、綿羊痘病毒核酸和山羊痘病毒核酸陽(yáng)性樣品能夠在試紙條上顯示出陽(yáng)性條帶,口蹄疫病毒、傳染性膿皰皮炎病毒和雞痘病毒均無(wú)陽(yáng)性條帶出現(xiàn)。

圖1 特異性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

綿羊痘/山羊痘是由綿羊痘/山羊痘病毒引起的動(dòng)物傳染病,以綿羊和山羊的體溫升高、全身性丘疹或結(jié)節(jié)、水皰、內(nèi)臟病變?yōu)樘卣?特別是肺部具有明顯的病變特征。其病原綿羊痘病毒/山羊痘病毒的分子生物學(xué)檢測(cè)方法常用的有普通 PCR和熒光定量 PCR,RPA替代PCR檢測(cè)技術(shù)主要優(yōu)勢(shì)在于不需要特定昂貴的溫控儀器即可快速定量擴(kuò)增目的DNA或RNA病毒,該方法克服了對(duì)傳統(tǒng)PCR檢測(cè)設(shè)備的依賴,在臨床和現(xiàn)場(chǎng)操作中簡(jiǎn)單、快捷、實(shí)用性強(qiáng)。在成功建立綿羊痘病毒和山羊痘病毒通用RPA檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上,本文對(duì)改進(jìn)方法檢測(cè)的特異性進(jìn)行了研究,從試驗(yàn)結(jié)果看,我們建立的綿羊痘病毒和山羊痘病毒通用RPA檢測(cè)方法對(duì)綿羊痘/山羊痘病毒的檢測(cè)具有很好的特異性。

4 結(jié)論

本研究對(duì)我們建立的綿羊痘病毒和山羊痘病毒通用RPA檢測(cè)方法的特異性開展了試驗(yàn)研究,結(jié)果表明,該方法對(duì)綿羊痘和山羊痘病毒核酸的檢測(cè)具有很好的特異性,在綿羊痘/山羊痘病毒的臨床檢測(cè)上應(yīng)用前景廣闊。