吾力江·卡馬力,馬 偉,賈舒安,艾日登才次克,*

(1.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所,新疆 烏魯木齊 830010;2.新疆維吾爾自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所)

犬新孢子蟲是原生動物門的一種原生動物寄生蟲,該寄生蟲被認(rèn)為是導(dǎo)致家畜流產(chǎn)的主要原因之一。犬科動物是犬新孢子蟲的中間宿主和終末宿主,它能感染多種動物,包括牛、羊、山羊、馬、驢和鳥類等,家畜感染新孢子蟲病造成的經(jīng)濟(jì)損失不容小覷。據(jù)統(tǒng)計,歐洲(荷蘭、愛爾蘭、瑞典、瑞士、德國、西班牙、丹麥、匈牙利、英國、芬蘭、挪威)、北美洲(美國、加拿大、墨西哥)、南美(烏拉圭)、亞洲(日本、朝鮮、中國、以色列)、大洋洲(新西蘭)、北非(洲)等多個國家報道有此病的流行,流行情況不等;尤其在畜牧業(yè)發(fā)展國家感染率很高,如新西蘭、美國、墨西哥等國普遍流行。全球每年由新孢子蟲引起的經(jīng)濟(jì)損失,約三分之二發(fā)生在美洲。

目前,新孢子蟲被認(rèn)為是奶牛流產(chǎn)的主要原因之一,但近幾年有調(diào)查報道,犬新孢子蟲感染綿羊和山羊在世界范圍內(nèi)存在不同程度的流行率。犬新孢子蟲對綿羊群體造成繁殖問題和經(jīng)濟(jì)損失,雖沒有直接證據(jù)證明犬新孢子蟲是導(dǎo)致綿羊與山羊發(fā)生流產(chǎn)的主要原因,但流產(chǎn)的羊群血清陽性率顯著升高。

近年來,有大量研究對牛羊感染犬新孢子蟲病的流行率進(jìn)行了估算,但絕大部分都是以血清學(xué)診斷為主,對其進(jìn)行分子診斷的研究較少。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)具有比血清學(xué)檢測技術(shù)更高靈敏度和特異性,因此,是檢測動物組織與血液中犬新孢子蟲的最佳方法之一。

巴音布魯克黑頭羊作為新疆肉脂兼用地方優(yōu)良綿羊品種之一,系巴州和靜獨有,黑頭羊飼養(yǎng)對于提高廣大農(nóng)牧民收入、提升和靜縣有機畜產(chǎn)品的知名度和美譽度,將起到巨大的推動作用,實現(xiàn)社會效益和經(jīng)濟(jì)效益共贏。本試驗旨在預(yù)估和靜縣部分區(qū)域分布的黑頭羊中犬新孢子蟲的分子流行情況,對新孢子蟲病的防治具有重要作用,利于畜牧業(yè)生產(chǎn)中新孢子蟲病的防治。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2019年11月～2020年1月,課題組成員與和靜縣獸醫(yī)站的村級防疫員采用靜脈采血的方式,從巴音郭楞蒙古自治州和靜縣(干燥少雨氣候)的八個地區(qū)(奧倫布魯克村、巴西力克村、賽熱木村、賽罕托海村、藏德哈德村、伊克扎克村、二鄉(xiāng)哈爾薩拉村、二鄉(xiāng)烏村)采集黑頭羊母羊血液樣本,共計165份,并記錄了母羊的年齡、胎次與飼養(yǎng)環(huán)境是否有飼養(yǎng)犬等信息,采集的樣品在4℃下冷藏。

1.2 主要試劑與儀器

試劑:瓊脂糖、2 × Taq PCR Green Mix、ddH2O、DL2000 Marker、pMD18-T載體、E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞等購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司,犬新孢子蟲基因組DNA均保存于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院寄生蟲實驗室。

試劑盒:賽百盛樹脂型TM基因組DNA提純試劑盒(鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司),膠回收試劑盒(美國OMEGA公司)。

儀器:RA-DIAL20臺式高速離心機(西班牙ORTOALRESA公司),DK-600A型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司),搖床、振蕩器、37℃培養(yǎng)箱、pH計、低速瞬時離心機(鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司),PCR儀(美國Bio-Rad公司),DYY-II型電泳儀(北京六一公司),YXQ-LS-50A立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實業(yè)有限公司),BSS-SDC型BIOBASE超凈工作臺(鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)。

1.3 血液樣本DNA提取、擴(kuò)增

血液樣本進(jìn)行基因組DNA提取按商品化試劑盒廠家指導(dǎo)方法進(jìn)行,所得DNA在-20℃冷藏進(jìn)行PCR分析。本次試驗運用新孢子蟲Nc5基因特異性引物進(jìn)行PCR分子檢測。采用犬新孢子蟲特異性引物,即SN/T 3499 F (5′-GGGTGAACCGAGGGAAT-3′)和SN/T 3499 R (5′-TCGCCAGTCAACCTACG-3′)。以提取的DNA為模板進(jìn)行目的基因擴(kuò)增,每個擴(kuò)增均使用50 μL:2xEsTaq Master Mix 25 μL,上、下游引物各2 μL,模板DNA 2 μL,ddH2O 19 μL。擴(kuò)增:94℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,35個循環(huán),58℃退火30 s,72℃延伸30 s,最后72℃延伸10 min。每一個反應(yīng)都是設(shè)有陰性和陽性對照(分別包括雙蒸水和新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院寄生蟲實驗室保存的犬新孢子蟲Nc5菌株DNA)的情況下進(jìn)行的。擴(kuò)增產(chǎn)物取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。用DNA產(chǎn)物純化試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化,將其連在pMD18-T載體上,轉(zhuǎn)至E.coli DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,將成功后的菌體沉淀均勻涂布在含氨芐青霉素(100 mg/L)的LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),12 ～ 17 h后進(jìn)行單菌落挑取,進(jìn)行PCR驗證,成功獲取的產(chǎn)物委托上海生工生物工程服務(wù)有限公司用正向和反向引物進(jìn)行測序。

1.4 DNA測序和系統(tǒng)發(fā)育分析

測序結(jié)果用BLAST分析(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)與GenBank中的可用序列進(jìn)行比對。由于本研究測序的擴(kuò)增引物的相似性為99.2%,因此,比對出了NCBI GenBank中上傳的11組序列,用MEGA 6.0軟件分析測序結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0軟件中Fisher’s分類變量精確檢驗對新孢子蟲病感染相關(guān)潛在危險因素的結(jié)果進(jìn)行分析,當(dāng)P< 0.05時,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分子檢測

所有樣品均使用犬新孢子蟲Nc5基因檢測,對樣品DNA進(jìn)行目的基因擴(kuò)增,檢測結(jié)果顯示:犬新孢子蟲總感染率為7.9%(13/165)。受感染的羊群中,大多數(shù)感染發(fā)生在2歲及以上的母羊中(12.2±6.8%,P<0.05),2歲以下的母羊感染率最低(2.7±3.6%);此外,與無流產(chǎn)史羊群(6.5±3.8%)相比,有流產(chǎn)史羊群犬新孢子蟲感染率較高(27.2±28.0%,P<0.01);飼養(yǎng)場地周邊犬的存在對感染率也有所影響,有飼養(yǎng)犬的羊群感染率(11.4±6.1%,P<0.01)高于未飼養(yǎng)犬的羊群(1.7±3.3%)。在考慮分層優(yōu)勢比后,犬新孢子蟲感染的易感性與不同年齡之間沒有關(guān)聯(lián),與羊群是否有流產(chǎn)史和有無犬的飼養(yǎng)存在一定的關(guān)聯(lián)性。

表1 基于PCR的犬新孢子蟲感染率結(jié)果 歲,%

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

所有測序的擴(kuò)增產(chǎn)物都是100%相同的,基于所得犬新孢子蟲Nc5序列,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,經(jīng)測序和BLAST搜索比對分析發(fā)現(xiàn),獲得的犬新孢子蟲序列與在GenBank中公開的犬新孢子蟲序列同源性為92%～100%。根據(jù)物種的犬新孢子蟲序列比對,系統(tǒng)發(fā)育樹顯示三個簇(圖1)。第一簇序列包括來自亞洲(伊朗)、大洋洲(澳大利亞)、非洲(埃塞俄比亞);在第二簇中,序列與來自南美洲(阿根廷)、大洋洲(新西蘭)、歐洲(瑞士和英國)、亞洲(蒙古國)序列接近。本試驗所得到的犬新孢子蟲序列(N.caninum HTY)與N.caninum分離物(Genbank登錄號:X84238、AY459289、EU686398、MN972456)的同源性為100%,根據(jù)我們擴(kuò)增的NC5基因序列和GenBank中的序列,構(gòu)建了犬新孢子蟲的系統(tǒng)發(fā)育樹;系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,獲得的新孢子蟲序列與N . caninum聚為一支(圖1)。

圖1 本研究根據(jù)GenBank中新孢子蟲特異性Nc5位點的部分序列,對巴州和靜縣部分區(qū)域犬新孢子蟲分離株與其他分離株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析

3 討論

巴音布魯克黑頭羊稱巴音布魯克羊,產(chǎn)于和靜縣,是巴州的優(yōu)良地方羊品種;具有早熟、耐粗飼、適應(yīng)性強等優(yōu)點,以產(chǎn)肉量高而著稱,是新疆三個大尾羊品種之一。黑頭羊既是巴州的當(dāng)家肉用羊品種,也是巴音布魯克區(qū)高寒草原的主體畜種之一。因此,查清影響和靜縣一帶黑頭羊發(fā)生流產(chǎn)的病因?qū)Ξ?dāng)?shù)仞B(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展尤為重要。

犬新孢子蟲是一種胞內(nèi)原生動物寄生蟲,主要與家畜流產(chǎn)有關(guān),其主要經(jīng)濟(jì)效應(yīng)是影響包括牛和小反芻動物在內(nèi)的中間宿主的繁殖能力。近年來,隨著新疆地方特色產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展,地方優(yōu)良品種羊群養(yǎng)殖量的急劇上升,妊娠母羊發(fā)生流產(chǎn)的原因成為畜牧養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸。為了幫助養(yǎng)殖戶解決眼前的難題,課題組從和靜縣隨機采集羊血液樣品,進(jìn)行布魯氏桿菌病血清學(xué)檢測,并未發(fā)現(xiàn)陽性病例;當(dāng)?shù)赜嘘P(guān)犬新孢子蟲病的報道較少,巴音查汗等曾對和靜縣黑頭羊進(jìn)行了系統(tǒng)的抗原檢測,犬新孢子蟲的平均感染率為16.94%。缺乏犬新孢子蟲的分子檢測研究;因此,補充有關(guān)黑頭羊新孢子蟲病分子流行情況的數(shù)據(jù)尤為重要。采用PCR檢測方法,檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確;新孢子蟲NC5基因?qū)z測血液、腦組織內(nèi)蟲體敏感性較好,故作為本試驗的診斷引物。

本次PCR檢測得到的犬新孢子蟲感染率(7.9%)低于先前巴音查汗等的報道(16.94%),低于近期報道的云南省烏骨羊新孢子蟲血清陽性率(8.55%),高于中國中部河南一帶的陽性率(7.32%)。本研究中犬新孢子蟲病的感染率與流產(chǎn)史、有無犬的飼養(yǎng)有關(guān),這與先前中國中部、北非的突尼斯報道的一致。統(tǒng)計分析顯示,不同年齡段、有無流產(chǎn)史、有無犬飼養(yǎng)與感染率之間存在顯著差異,但分層優(yōu)勢比顯示,年齡段與感染率無關(guān)聯(lián),這與先前的報道不同,原因可能是本次選取的樣本年齡段不均衡或者其他原因所致,需進(jìn)一步研究證實。

對13份黑頭羊新孢子蟲陽性樣本進(jìn)行擴(kuò)增、測序,確認(rèn)了犬新孢子蟲的感染。犬新孢子蟲Nc5基因與NCBI上傳的序列同源性較高(92%～100%),它們與蒙古、英國、阿根廷、新西蘭等地報道的序列具有較高的同源性。本研究對巴州黑頭羊犬新孢子蟲的感染進(jìn)行了PCR檢測,初步估計了巴州黑頭羊中犬新孢子蟲的分子流行率。羊群飼養(yǎng)模式、牧羊犬的飼養(yǎng),都可能是犬新孢子蟲感染的風(fēng)險因素;而不同年齡段與感染率無明顯關(guān)聯(lián),需要進(jìn)一步證實。因此,提高農(nóng)牧民的疾病防范意識,可大大降低此病的感染率。