賈北平, 呂 炫, 楊 慶, 王一楠, 李皖蕭, 解新迪, 朱英奇, 王 蓓, 殷冬冬,張云凱, 王 晴, 王桂軍,*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院,安徽 合肥 230036; 2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所,安徽 合肥 230001; 3.合肥華盟生物技術(shù)有限公司,安徽 合肥 231131)

近年來,在我國安徽、山東、河南和福建等省均爆發(fā)了雛鵝痛風(fēng)病。該病的病原為新型鵝星狀病毒(GAstV)[1-2],以內(nèi)臟、關(guān)節(jié)中的尿酸鹽沉積為主要表現(xiàn)特征[3-4],會導(dǎo)致雛鵝生長遲緩、癱瘓,甚至死亡,嚴重影響?zhàn)B鵝產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

GAstV屬于星狀病毒科禽星狀病毒屬,是一種二十面體的無囊膜的單股正鏈RNA病毒[5-6]。禽星狀病毒的基因組全長一般在6.9～7.9 kb[7-8],主要由5′非編碼區(qū)(5′UTR)、3個開放閱讀框(ORF)(分別為ORF1a、ORF1b和ORF2)、3′非編碼區(qū)(3′UTR)和1個多聚A尾組成[9-10]。其中,ORF2編碼衣殼蛋白(capsid),是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白,也是主要毒力蛋白[11-12]。GAstV的體外分離培養(yǎng)比較困難,目前主要在原代鵝胚腎細胞(GEK)[13]、雞肝癌細胞(LMH)[14-15]和9～11日齡的鵝胚[16-17]中進行分離和培養(yǎng)。

由GAstV引起的雛鵝痛風(fēng)病主要侵害3周齡以內(nèi)的雛鵝[18],患病雛鵝生長緩慢、癱瘓,甚至死亡[19-20]。對發(fā)病雛鵝解剖可見,肝、腎、心臟等器官,及腿關(guān)節(jié)有明顯的尿酸鹽沉積[21]。本研究對2018—2021年采集的患病雛鵝的病料進行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)鑒定,通過分離培養(yǎng)獲得多株GAstV毒株,開展全基因組測序,分析其ORF1a、ORF1b、ORF2基因與其他毒株的同源性,及與以往年份毒株氨基酸變異位點的差異,同時構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,分析各毒株的遺傳進化關(guān)系,旨在為鵝星狀病毒的深入研究奠定基礎(chǔ),同時也可為安徽省鵝星狀病毒的診斷與防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

2018—2021年于安徽省內(nèi)多個養(yǎng)殖場采集疑似GAstV感染病料,保存于-80 ℃冰箱。健康鵝胚購自南京竹順生物技術(shù)有限公司。

RNAeasyTM動物RNA抽提試劑盒、BeyoRTTMII cDNA第一鏈合成試劑盒,購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;2×TaqPlus Master Mix Ⅱ購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;pMD19-T載體、大腸埃希菌感受態(tài)細胞DH-5α,購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;StarPrep快速DNA膠回收試劑盒購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 病例背景

2018年5月—2021年10月,安徽省多個鵝場先后爆發(fā)有雛鵝痛風(fēng)癥狀的傳染病,死亡雛鵝剖檢可見明顯的尿酸鹽沉積等病理變化。本研究采集到多份病例(表1),發(fā)病鵝的品種包括朗德鵝、泰州白鵝、皖西白鵝,系10～40日齡的雛鵝,在臨床上表現(xiàn)出采食量下降或廢絕、排白色稀便、癱瘓等癥狀,死亡率在5.0%～77.8%。剖檢病變情況如下:病料1,腎腫大發(fā)白,肝表面有白色尿酸鹽沉積,膽囊呈綠色;病料2,腎出血腫大、有尿酸鹽沉積,肝表面出血,膽汁發(fā)黃有顆粒物;病料3,輸尿管尿酸鹽沉積,腦膜出血;病料4,腎發(fā)白,輸尿管尿酸鹽沉積,心、肝表面白色尿酸鹽沉積,腦出血;病料5,腎腫大,花斑腎,輸尿管有尿酸鹽沉積,肝表面可見尿酸鹽沉積。

表1 雛鵝病例的基本情況Table 1 Basic information of gosling cases

1.3 病料的采集與處理

剖檢雛鵝后,采集尿酸鹽沉積明顯的雛鵝心、腎、肝組織,分別取各組織的2/3保存于-80 ℃冰箱,用于后續(xù)檢測;另外1/3室溫保存于4%多聚甲醛溶液中,用于組織病理學(xué)觀察。

從-80 ℃冰箱取出凍存的病料組織,用充分消毒的剪刀取等量雛鵝的心、肝、腎組織共1 g于研缽中,加入5 mL無菌PBS緩沖液充分研磨。收集病料研磨液,加入青霉素與鏈霉素,-80 ℃冷凍20 min后,室溫解凍,反復(fù)凍融3次后,將研磨液在4 ℃、12 000×g條件下離心10 min,吸取上清,經(jīng)0.22 μm濾器過濾后保存于-80 ℃冰箱,用于后續(xù)試驗。

1.4 RT-PCR檢測

取上述處理好的病毒液,用RNAeasyTM動物RNA抽提試劑盒提取RNA,用BeyoRTTMII cDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄,將得到的cDNA產(chǎn)物置于-20 ℃冰箱備用。針對GAstV設(shè)計、合成PCR檢測引物[引物序列(5′→3′)分別為AGAAGGTGCGGAAGAGTGGTATGA、GCGAAGAGTGCGTAAGAGGTTGT],用上述制備的cDNA作為模板,對病料進行RT-PCR檢測(退火溫度55 ℃,目的片斷大小為300 bp)。同時,用針對鴨坦布蘇病毒(DTMUV)、禽流感(AIV)、禽腺病毒(FAdV)、鴨乙型肝炎病毒(DHBV)、鴨呼腸孤病毒(DRV)和鵝細小病毒(GPV)等設(shè)計的特異性引物對病料進行RT-PCR檢測,判定病料中是否存在其他常見的外源性病毒。取PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,觀察結(jié)果。

1.5 GAstV的分離鑒定

取健康鵝胚在孵化箱內(nèi)孵化至9日齡,通過絨毛尿囊膜途徑分別接種各組陽性樣品的病毒液(每組接種3枚,每枚胚的接種劑量為200 μL),并設(shè)立使用PBS緩沖液的陰性對照組。接種完成后,將鵝胚放入孵化箱中繼續(xù)生長,每12 h照胚檢查一次,觀察并記錄鵝胚的存活情況。棄去接種后24 h之內(nèi)死亡的鵝胚。將1～7 d死亡的鵝胚及時取出。病毒接種7 d后收取其余鵝胚,放入4 ℃冰箱處死。

確定調(diào)度系統(tǒng)出現(xiàn)異常后，對操作人員進行告警。報警處理分兩種方式，一種是事故報警，另一種是預(yù)告報警。前者包括非操作引起的斷路器跳閘和保護裝置動作信號。后者包括狀態(tài)異常信息、模擬量越限/復(fù)限、計算機站控系統(tǒng)部件以及間隔層單元的狀態(tài)異常等。

于無菌條件下打開鵝胚,收集尿囊液與胚體,觀察病變。取胚體肝,研磨,離心,收取上清液,反復(fù)凍融。將上清液與尿囊液過濾除菌后繼續(xù)接種于下一代鵝胚中,按此方法傳3～5代。

將上述處理好的尿囊液與胚體研磨上清液一起提取RNA并進行RT-PCR檢測,檢測引物同1.4節(jié)。

1.6 GAstV的全基因組測序

根據(jù)GenBank收錄的GAstV全基因組序列(來源于SD01株,GenBank登錄號:MF772821),設(shè)計7對引物(表2),包含病毒的全基因組且相互重疊。引物委托南京擎科生物科技有限公司合成。

表2 GAstV全基因測序引物的基本信息Table 2 Basic information of primers for genome sequencing of GAstV

取上述分離到的GAstV各毒株的F3代病毒液進行RNA提取與反轉(zhuǎn)錄,其中,反轉(zhuǎn)錄引物使用各段測序引物的下游引物。利用設(shè)計的引物對各毒株的全基因組序列分段擴增,取PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收后連接T載體,委托南京擎科生物科技有限公司測序。

1.7 GAstV的遺傳進化分析

利用MegAlign軟件對本研究分離到的毒株與其他人分離得到的毒株的ORF1a、ORF1b、ORF2基因進行核苷酸同源性分析。用到的其他毒株具體包括:JSHA(分離于2016年),GenBank登錄號為MK125058;SD01(分離于2017年),GenBank登錄號為MF772821;GD(分離于2017年),GenBank登錄號為MK125058;SDPY(分離于2017年),GenBank登錄號為MH052598;GXZ(分離于2018年),GenBank登錄號為MH807626;GTF-04(分離于2018年),GenBank登錄號為MN068023;GTF-07(分離于2018年),GenBank登錄號為MN068024;AHAU1(分離于2018年),GenBank登錄號為MN428641;AHAU4(分離于2018年),GenBank登錄號為MN428644;XX(分離于2018年),GenBank登錄號為MN337323;SDXT(分離于2019年),GenBank登錄號為MN399857;HBXG(分離于2019年),GenBank登錄號為MN894548;HNKF-1(分離于2020年),GenBank登錄號為MW592377;HNSQ-6(分離于2020年),GenBank登錄號為MW592378;HR2105/1(分離于2021年),GenBank登錄號為OM066892;ZM(分離于2021年),GenBank登錄號為MZ648231。

利用MEGA 7軟件,基于本研究分離到的毒株與其他毒株的ORF2基因的核苷酸序列和編碼的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,分析其遺傳進化關(guān)系。同時,利用MEGA 7軟件,選取不同種屬的星狀病毒(包括哺乳動物星狀病毒和禽星狀病毒),根據(jù)其全基因組構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,分析GAstV與其他星狀病毒的親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 患病雛鵝的臨床觀察與剖檢

A～C,病例1的臨床觀察和剖檢變化;D～F,病例2的剖檢變化;G～I,病例3的臨床觀察和剖檢變化。A-C, Clinical observation and autopsy changes of case No. 1; D-F, Changes in autopsy of case No. 2; G-I, Clinical observation and autopsy changes of case No. 3.圖1 臨床發(fā)病雛鵝的臨床觀察與解剖變化Fig.1 Clinical observation and anatomical changes of diseased goslings

2.2 臨床病料的RT-PCR檢測結(jié)果

RT-PCR檢測結(jié)果顯示,5例病例均系GAstV陽性,擴增片段的大小符合預(yù)期(圖2),并且無外源性病毒感染,可確診為GAstV感染。

M,DL2000 DNA分子量標(biāo)記;1,陰性對照;2～6依次對應(yīng)于病例1～病例5。M, DL 2000 DNA marker; 1, Negative control; 2-6, Case 1-5, correspondingly.圖2 臨床病例的RT-PCR檢測結(jié)果Fig.2 RT-PCR results of clinical cases

2.3 GAstV的分離鑒定

采集GAstV陽性雛鵝的腎和肝,研磨過濾除菌后接種于9～11日齡健康鵝胚中,盲傳3代,分離得到5株新型鵝星狀病毒,分別命名為AHAU2018株、DY-19株、ZY02株、HR2105/2株、HR2110/1株。結(jié)果顯示,陰性對照組鵝胚未出現(xiàn)病變或死亡,未檢測到GAstV。各毒株各代次的鵝胚病變基本一致,胚體均表現(xiàn)出全身出血的病變,且隨著代次增加,胚體腹腔可見白色尿酸鹽沉積病變,部分毒株高代次時鵝胚出現(xiàn)絨毛尿囊膜上蓄積白色尿酸鹽的變化。前期低代次的毒株感染鵝胚并未導(dǎo)致鵝胚死亡,但隨著代次增加,逐漸有鵝胚死亡,死亡率在20%～30%,死亡時間集中在60～120 h。其中,HR2105/2株可見胚體嚴重出血(圖3),ZY02株可見胚體出血,解剖可見腹腔有白色尿酸鹽沉積。RT-PCR檢測結(jié)果顯示,各組F3代尿囊液均系GAstV陽性(圖4)。綜上,分離得到的各毒株均可在鵝胚上穩(wěn)定增殖傳代,并能引起鵝胚胚體廣泛性出血、胚體腹腔有白色尿酸鹽沉積等穩(wěn)定病變,可致鵝胚死亡。

圖3 HR2105/2株(A～C)和ZY02株(D～F)GAstV接種鵝胚的病變圖Fig.3 Pathological changes of goose embryos inoculated with HR2105/2 strain (A-C) and ZY02 strain (D-F) of GAstV

M,DL2000 DNA分子量標(biāo)記;1,陰性對照;2,陽性對照;3,AHAU2018株;4,DY-19株;5,ZY02株;6,HR2105/2株;7,HR2110/1株。M, DL2000 DNA Marker;1, Negative control; 2, Positive control; 3, AHAU2018 strain; 4, DY-19 strain; 5, ZY02 strain; 6, HR2105/2 strain; 7, HR2110/1 strain.圖4 F3代鵝胚尿囊液的RT-PCR檢測結(jié)果Fig.4 RT-PCR detection results of allantoic fluid from F3 generation goose embryos

2.4 GAstV毒株的全基因組測序結(jié)果

全基因組測序結(jié)果表明,本研究分離的5株毒株的全長均為7 175 nt,包括10 nt的5′UTR和236 nt的3′UTR,以及3個ORF(分別編碼ORF1a、ORF1b和ORF2蛋白)(圖5)。ORF1a長3 255 nt,ORF1b長1 551 nt,兩者編碼鵝星狀病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白,包含跨膜域、絲氨酸蛋白酶、卷曲螺旋、病毒基因組連接蛋白、核定位信號和RNA依賴性RNA聚合酶;ORF2長2 115 nt,編碼病毒衣殼蛋白。

圖5 GAstV分離株的基因組結(jié)構(gòu)Fig.5 Genome structure of GAstV strain

將AHAU2018、DY-19、ZY02、HR2105/2、HR2110/2株GAstV的全長序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫,登錄號分別為ON205965、MT701902、OM066895、OM066893、OM066894。

2.5 GAstV毒株的遺傳進化分析

對分離毒株核苷酸的同源性進行分析(表3),結(jié)果顯示,AHAU2018株(分離于2018年)與分離于2018年前后的毒株的同源性高于與2019年以后分離毒株的同源性;而HR2105/2、HR2110/1、ZY02株(均分離于2021年)與2021年前后分離株的同源性高于與2016—2019年分離毒株的同源性。上述結(jié)果表明,GAstV在我國已發(fā)生變異。

表3 分離毒株ORF1a、ORF1b和ORF2基因的同源性Table 3 Homology analysis of ORF1a, ORF1b and ORF2 genes of GAstV strains

為了探究不同年份GAstV分離毒株之間的差異,本研究選取ORF2基因作為研究對象,構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖6)。結(jié)果顯示,2019年以前分離的毒株(包括AHAU2018)處于同一個進化亞分支,而2019年以后分離的毒株處于另一個進化亞分支。

將分離到的5株GAstV與已發(fā)表的哺乳動物星狀病毒和禽星狀病毒進行全基因組的核苷酸比對,并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖7)。結(jié)果顯示,5株分離毒株均屬于目前流行的導(dǎo)致雛鵝痛風(fēng)的GAstV,其中,AHAU2018株與其他4株分離毒株,以及本實驗室2021年分離得到的ZM株(GenBank登錄號:MZ648231)和HR2105/1株(GenBank登錄號:OM066892)處于同一進化分支的不同進化亞分支上,與上文結(jié)果一致。所分離的這5株毒株均不屬于TAstV-1、DAstV-2進化分支,與以往分離得到的鵝星狀病毒FLX株和AHDY株處于同一進化分支的不同進化亞分支,與哺乳動物星狀病毒處于不同的進化分支。

圖7 基于星狀病毒全基因組的遺傳進化分析Fig.7 Genetic evolution analysis based on whole genome of astrovirus

3 討論

近幾年,GAstV感染引起的雛鵝痛風(fēng)病已經(jīng)成為制約安徽養(yǎng)鵝產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的問題之一[22]。該病以雛鵝關(guān)節(jié)、內(nèi)臟等產(chǎn)生尿酸鹽沉積為典型特征[23-24],可致雛鵝生長遲緩、癱瘓,甚至死亡。本研究于2018—2021年在安徽省內(nèi)主要養(yǎng)鵝地區(qū)采集疑似感染GAstV的病料,并對其進行鑒定、病毒培養(yǎng)、基因組測序和遺傳進化分析,以期為深入了解安徽省乃至我國GAstV的流行情況和病原特征提供參考。結(jié)果顯示,共分離到5株新的鵝星狀病毒毒株,經(jīng)鑒定,均系GAstV,分別將其命名為AHAU2018株、DY-19株、ZY02株、HR2105/2株、HR2110/1株。

因缺少合適的細胞系,星狀病毒的體外培養(yǎng)存在一定困難。有研究表明,鵝星狀病毒可在LMH細胞中增殖,但不引起LMH細胞出現(xiàn)病變。Wei等[25]利用LMH細胞成功地從發(fā)病雛鵝的肝和腎中分離得到GAstV。Wei等[26]還利用LMH細胞成功分離到鴨源的GAstV。孫永林[27]研究發(fā)現(xiàn),GAstV可以通過制備的雞胚肝細胞進行分離,且可以產(chǎn)生細胞病變。張玉杰等[28]研究發(fā)現(xiàn),GAstV-2 SCCD株可以在鵝胚上穩(wěn)定增殖,但是GAstV-1 SDPD株不能在鵝胚和SPF雞胚上穩(wěn)定增殖。本研究分離的不同年份的毒株均可以通過絨毛尿囊膜接種的方式在鵝胚上穩(wěn)定增殖,并可引起鵝胚胚體出血、腹腔尿酸鹽沉積等病變,但關(guān)于其在LMH細胞上的增殖特性還有待進一步研究。

星狀病毒作為單鏈RNA病毒,易發(fā)生不同毒株之間的同源重組。目前,在禽類和哺乳動物類星狀病毒中均發(fā)現(xiàn)了變異毒株。Niu等[29]從制備的原代鵝胚腎細胞中分離得到一株新型鵝星狀病毒SDPY株,發(fā)現(xiàn)其ORF1a、ORF1b和ORF2基因與已發(fā)表的禽星狀病毒株的相似性很低,最高不超過69%。Fei等[30]研究表明,GAstV中的Ⅱ-c型目前已經(jīng)成為山東省的優(yōu)勢基因型,同時發(fā)現(xiàn)了GAstV存在自然重組的證據(jù)。徐夢璐等[31]研究發(fā)現(xiàn),GAstV的JSSQ株與GD AHAU2株和AHAU4株發(fā)生了重組。盧秀嫻等[32]從山東省患病雛鵝中分離出1株鵝星狀病毒,與章麗嬌等[33]于2018年在安徽得到的分離株AHQJ18的親緣關(guān)系較近。Wei等[26]研究發(fā)現(xiàn),安徽地區(qū)分離毒株與分離自山東地區(qū)的SDPY株的親緣關(guān)系較近,江蘇地區(qū)分離毒株的重組位點可能來自安徽和山東分離株,同時存在安徽不同毒株間的重組。星狀病毒ORF2基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白是星狀病毒分型的主要依據(jù)。本研究通過分析GAstV不同分離株ORF2基因核苷酸和其編碼的氨基酸序列發(fā)現(xiàn),2019年前后分離的GAstV處于不同的進化亞分支上,表明GAstV在我國已發(fā)生變異,但其優(yōu)勢基因型是否發(fā)生變化還有待進一步研究證實。本研究分離的AHAU2018、DY-19、ZY02、HR2105/2、HR2110/1株均屬于目前在我國流行的導(dǎo)致雛鵝痛風(fēng)的GAstV,但AHAU2018株與作者團隊于2019年后獲得的其他分離株處于不同的進化亞分支上。