張 璐,李翹楚,王增利,丁 強,王鴻磊,*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙臺研究院,山東 煙臺 264670; 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083)

金耳(Tremellaaurantialba)隸屬擔(dān)子菌門(Basidiomycota)銀耳綱(Tremellomycetes)銀耳目(Tremellales)銀耳科(Tremellaceae)銀耳屬(Tremella)[1-2],是一種珍稀的食用菌。野生金耳分布于貴州、福建、甘肅、西藏、四川、云南等省份,其中滇西北和西藏東部等高海拔地區(qū)分布最廣,產(chǎn)量最高[3]。金耳新鮮子實體膠質(zhì)豐富、肉質(zhì)細嫩、滑潤可口、味香色美,含多種維生素和人體必需的氨基酸,具有較高的食用價值。此外,金耳還具藥用價值,多糖是金耳的主要活性物質(zhì),已有研究表明,金耳多糖具有抗氧化[4-5]、提高機體免疫力[6-7]、抗腫瘤[8]、降血脂降血糖[9-10]、抗炎[11]等多種功效,有良好的應(yīng)用前景。但是,與大宗菇類相比,金耳人工栽培規(guī)模較小,產(chǎn)量較低,價格昂貴,這極大地限制了金耳資源的開發(fā)利用[12]。與傳統(tǒng)的人工栽培技術(shù)相比,液體發(fā)酵具有生產(chǎn)周期短、不受季節(jié)和地域限制、成本低、菌種質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點。通過食用菌液態(tài)發(fā)酵,能夠在短時間內(nèi)獲得菌體和代謝產(chǎn)物,符合工業(yè)化發(fā)展的趨勢,是獲取多糖的一種有效方式。然而,金耳子實體是由金耳菌絲和毛韌革菌菌絲(Stereumhirsutum)組成的異質(zhì)復(fù)合體,其二型菌絲體結(jié)構(gòu)的特殊性導(dǎo)致其生態(tài)、生理的復(fù)雜性。市售的金耳菌種多為混合菌種,以此為研究對象發(fā)酵產(chǎn)生的多糖為金耳多糖和毛韌革菌多糖的混合物,且兩者的比例無法確定,這為金耳多糖的研究和開發(fā)帶來了困難[13-14]。

本研究從金耳子實體中分離獲得了金耳類酵母型菌株,研究了金耳產(chǎn)胞外多糖的最佳營養(yǎng)條件,并且通過單因素試驗和正交試驗對金耳產(chǎn)胞外多糖培養(yǎng)基進行了優(yōu)化,獲得了高產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)基配方,為金耳胞外多糖工廠化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

金耳子實體取自招遠東萍食用菌有限公司。本研究用到的培養(yǎng)基有馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖(PDB)培養(yǎng)基、多糖發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(葡萄糖20 g·L-1、酵母浸粉5 g·L-1、磷酸二氫鉀2 g·L-1、土豆浸粉3 g·L-1、維生素B10.2 g·L-1,pH值6.0)。

1.2 儀器設(shè)備

A200基因擴增儀,杭州朗基科學(xué)儀器有限公司;凝膠成像分析系統(tǒng),北京君意東風(fēng)電泳設(shè)備有限公司;奧林巴斯BX51顯微鏡,奧林巴斯;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠;電泳儀,北京君意東風(fēng)電泳設(shè)備有限公司;核酸蛋白檢測儀,北京五洲東方科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金耳類酵母型菌株的分離鑒定

金耳類酵母型菌株的分離:將新鮮金耳子實體表面用75%乙醇擦拭,無菌水洗滌3次,無菌風(fēng)吹干表面水分后,取小塊金耳子實體,腦狀表面向下懸掛于盛有PDA培養(yǎng)基的無菌錐形瓶中,耳片距離培養(yǎng)基約2～3 cm。將錐形瓶置于22 ℃恒溫培養(yǎng)箱中,4 d后移去子實體。挑取少量培養(yǎng)基表面形成的白色菌落進行平板劃線分離,取單菌落接種于PDA斜面上,22 ℃培養(yǎng),菌種長滿斜面后,置于4 ℃冰箱保藏。

金耳類酵母型菌株形態(tài)觀察:取金耳類酵母型菌種涂片,美藍染色,顯微鏡觀察。

金耳類酵母型菌株的ITS鑒定:采用CTAB法[15-16]提取金耳子實體和金耳類酵母型菌株基因組DNA,使用真菌ITS通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACGG-3′)、ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴增ITS序列。PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序,所得基因序列通過BLAST程序與GenBank數(shù)據(jù)庫的序列比對,進行分子生物學(xué)鑒定。用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2 金耳胞外多糖的提取與抗氧化性測定

胞外多糖的提取:將金耳類酵母型菌株接種到PDB培養(yǎng)基中,22 ℃、150 r·min-1培養(yǎng)4 d,培養(yǎng)液12 000×g離心20 min,取上清液,真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,加3倍體積無水乙醇低溫沉淀,離心取多糖沉淀,干燥后稱其質(zhì)量。

金耳胞外多糖抗氧化能力測定:配置6 mg·mL-1金耳胞外多糖溶液,采用試劑盒法分別測定金耳胞外多糖溶液的羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基清除能力。

1.3.3 金耳高產(chǎn)胞外多糖培養(yǎng)基優(yōu)化

最佳碳源、氮源和無機鹽篩選。多糖發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源有葡萄糖、甘露醇、麥芽糖、蔗糖、乳糖,氮源有酵母浸粉、胰蛋白胨、牛肉浸膏、酒石酸銨、大豆蛋白胨,無機鹽有氯化鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化鉀。以粗多糖干重為指標(biāo),確定最佳碳源、氮源和無機鹽。

單因素試驗。設(shè)置蔗糖質(zhì)量濃度為20、30、40、50、60 g·L-1,22 ℃培養(yǎng)5 d,測定其胞外粗多糖干重,確定最佳的碳源質(zhì)量濃度;設(shè)置酒石酸銨的質(zhì)量濃度為5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 g·L-1,確定最佳的氮源質(zhì)量濃度;設(shè)置磷酸二氫鉀的質(zhì)量濃度為2、4、6、8、10 g·L-1,確定最佳的無機鹽質(zhì)量濃度。

正交試驗。根據(jù)單因素試驗結(jié)果,選取蔗糖質(zhì)量濃度(A)、酒石酸銨質(zhì)量濃度(B)、磷酸二氫鉀質(zhì)量濃度(C)為影響胞外多糖產(chǎn)量的3個因素,設(shè)計3因素3水平正交試驗,因素水平設(shè)置見表1。按照正交試驗確定的最佳培養(yǎng)基配方進行液體培養(yǎng),22 ℃培養(yǎng)5 d,測定其胞外多糖干重。

表1 正交試驗因素與水平設(shè)置表Table 1 The factor and level of orthogonal experiment g·L-1

1.4 數(shù)據(jù)處理

用MEGA5.0軟件進行多序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。采用WPS和SPSS軟件分析試驗數(shù)據(jù),利用Origin軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 金耳類酵母型菌株分離鑒定

子實體懸掛2 d后,培養(yǎng)基表面有水珠狀凸起的孢子印,4 d后形成乳白色菌落(圖1-A),平板劃線得到金耳類酵母型菌株單菌落,命名為EF145。EF145菌株的菌落為乳白色、表面凸起、光滑、濕潤(圖1-B)。PDB培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d的發(fā)酵液為乳白色黏稠液體,無顆粒,質(zhì)地均勻,無異味(圖1-C)。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),EF145菌株單個細胞為卵圓形,大小約為(2.5～4.0)μm×(2.0～4.0)μm,出芽增殖(圖1-D)。

以ITS1、ITS4為引物進行PCR擴增,凝膠電泳檢測結(jié)果如圖2所示:金耳子實體PCR產(chǎn)物為2條分子量不同的條帶(大條帶編號為1.1,小條帶編號為1.2),從分子水平證明金耳子實體是由2種菌絲構(gòu)成。EF145菌株的PCR產(chǎn)物只1個條帶,其分子量與金耳子實體小條帶一致。

M,DL2000 marker;1,金耳子實體;2,EF145 菌株。M, DL2000 marker; 1, Fruiting body of Tremella aurantialba; 2. Strain EF145.圖2 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophorogram of PCR products

測序結(jié)果顯示,金耳子實體小條帶的堿基數(shù)量為481,EF145菌株的PCR擴增產(chǎn)物的堿基數(shù)量為478,兩者基本一致。BLAST比對顯示兩者均與金耳(Tremellaaurantialba)同源性最高,為96%～98%,證明本實驗通過擔(dān)孢子彈射法獲得的菌株確為金耳。系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)顯示,EF145菌株與金耳子實體小條帶(1.2)聚為一小支,且兩者與金耳聚為一支,遺傳距離最小,親緣關(guān)系最近。

圖3 EF145菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain EF145

2.2 金耳胞外多糖抗氧化能力測定

如4圖所示,金耳胞外多糖對羥自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基均有一定的清除能力,其中,金耳胞外多糖對羥自由基和超氧陰離子的清除率較高,分別為56.67%和51.73%,對DPPH自由基清除能力較差,僅為17.43%。

圖4 金耳胞外多糖抗氧化能力測定Fig.4 Determination of antioxidant capacity of exopolysaccharide from T.aurantialba EF145

2.3 高產(chǎn)胞外多糖培養(yǎng)基優(yōu)化

2.3.1 最佳碳源、氮源和無機鹽篩選

如圖5-A所示,胞外多糖產(chǎn)量較高的幾種碳源分別是葡萄糖、蔗糖、乳糖,其中以蔗糖為碳源時胞外多糖產(chǎn)量達到最高,為(4.180±0.176)g·L-1。麥芽糖為碳源時胞外多糖產(chǎn)量最低。無機氮源酒石酸銨最有利于胞外多糖的產(chǎn)生,其產(chǎn)量達到(3.936±0.449)g·L-1,顯著高于其他4種有機氮源(圖5-B)。如圖5-C所示,以磷酸二氫鉀為無機鹽時,胞外多糖產(chǎn)量最高,為(3.367±0.133)g·L-1,顯著(P<0.05)高于其他無機鹽。以氯化鈉為無機鹽時多糖產(chǎn)量最低。

柱上無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Data marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05.The same as below.圖5 碳源、氮源和無機鹽對胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of carbon sources, nitrogen sources and inorganic salts on exopolysaccharide production

2.3.2 單因素試驗

在確定最佳碳源、氮源和無機鹽的基礎(chǔ)上,探究濃度對胞外多糖產(chǎn)量的影響,結(jié)果如下:隨著蔗糖質(zhì)量濃度增大,胞外多糖產(chǎn)量先升高后下降,當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度達到40 g·L-1時胞外多糖產(chǎn)量達到最高,繼續(xù)增大蔗糖質(zhì)量濃度多糖產(chǎn)量下降(圖6-A),故40 g·L-1為最佳蔗糖質(zhì)量濃度。

圖6 蔗糖(A)、酒石酸銨(B)、磷酸二氫鉀(C)質(zhì)量濃度對胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of concentration of sucrose (A), ammonium tartrateon (B) and monopotassium phosphate (C) on exopolysaccharide production

當(dāng)酒石酸銨質(zhì)量濃度達到10.0 g·L-1時,胞外多糖的產(chǎn)量最高,質(zhì)量濃度繼續(xù)增大胞外多糖產(chǎn)量無顯著性變化(圖6-B),考慮經(jīng)濟因素選擇10.0 g·L-1為最佳酒石酸銨質(zhì)量濃度。較低質(zhì)量濃度的磷酸二氫鉀就可促進胞外多糖的產(chǎn)生,質(zhì)量濃度增高胞外多糖的產(chǎn)量反而有所下降,當(dāng)質(zhì)量濃度達到10 g·L-1時會抑制胞外多糖的產(chǎn)生(圖6-C),故磷酸二氫鉀的最佳質(zhì)量濃度為4 g·L-1。

2.3.3 正交試驗優(yōu)化

正交試驗結(jié)果如表2。極差分析結(jié)果如表3所示。通過極差R值可以看出,蔗糖質(zhì)量濃度(A)、酒石酸銨質(zhì)量濃度(B)、磷酸二氫鉀質(zhì)量濃度(C)對胞外多糖產(chǎn)量的影響依次為A>C>B。根據(jù)k值可以看出,高產(chǎn)胞外多糖培養(yǎng)基最優(yōu)組合為A2B1C2,即蔗糖40 g·L-1、酒石酸銨7.5 g·L-1、磷酸二氫鉀4 g·L-1。方差分析結(jié)果(表4)表明,蔗糖質(zhì)量濃度、酒石酸銨質(zhì)量濃度、磷酸二氫鉀質(zhì)量濃度均對胞外多糖產(chǎn)量有顯著性影響。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 極差分析結(jié)果Table 3 Result of range analysis

表4 正交試驗方差分析結(jié)果Table 4 The variance analysis results of orthogonal experiment

根據(jù)最優(yōu)培養(yǎng)基配方進行驗證試驗,以基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對照,優(yōu)化培養(yǎng)基后,胞外多糖產(chǎn)量達到(5.092±0.473)g·L-1,與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比產(chǎn)量提高了56.78%。

3 結(jié)論與討論

本文通過擔(dān)孢子彈射法分離到了類酵母型菌株EF145,經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為金耳。金耳胞外多糖的羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的清除率分別為57.67%、51.73%和17.43%;EF145菌株產(chǎn)胞外多糖培養(yǎng)基的最佳配方為蔗糖40 g·L-1、酒石酸銨7.5 g·L-1、磷酸二氫鉀4 g·L-1、土豆浸粉3 g·L-1、維生素B10.2 g·L-1。

金耳多糖是金耳主要的活性物質(zhì),由于金耳人工栽培困難,利用子實體提取多糖成本較高,液體發(fā)酵是金耳多糖工業(yè)化生產(chǎn)的有效解決方案,具有較好的應(yīng)用前景[17-18]。金耳有菌絲型和和類酵母型2種類型。菌絲型金耳生活能力差,需要伴生菌的幫助才能正常地生長發(fā)育。通過組織分離獲得的菌種均為金耳和伴生菌的混合菌種,這種菌種無法確定二者的數(shù)量關(guān)系[19-20],發(fā)酵產(chǎn)物不穩(wěn)定。類酵母型金耳可以像酵母菌一樣通過出芽方式快速生長繁殖,利用此菌種可以發(fā)酵產(chǎn)生純正的金耳多糖[21],故利用金耳類酵母型菌株生產(chǎn)金耳多糖是現(xiàn)階段發(fā)酵金耳多糖的主要途徑。筆者在研究時發(fā)現(xiàn),在分離金耳類酵母型菌株時經(jīng)常會有隱球酵母污染,其形態(tài)與金耳類酵母型菌株非常相似且亦會產(chǎn)生大量多糖,故在分離到酵母樣細胞后需要對其進行分子生物學(xué)鑒定以排除隱球酵母污染。

本文獲得了金耳類酵母型菌株,優(yōu)化了高產(chǎn)金耳胞外多糖發(fā)酵培養(yǎng)基,并初步探討了金耳多糖的抗氧化性,為金耳多糖的發(fā)酵生產(chǎn)和開發(fā)利用提供了一定的數(shù)據(jù)支持。