呂卓純 陳曉慧 秦琛 鞠芳

(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部,山東 青島 266071;2 青島大學(xué)附屬青島市中心醫(yī)院,青島市腫瘤醫(yī)院腫瘤科)

宮頸癌和直腸癌是常見(jiàn)的盆腔腫瘤,同步放化療是很多局部晚期盆腔腫瘤患者的首選治療方案,也是盆腔腫瘤多學(xué)科綜合治療的重要部分［1-2］。近年來(lái),關(guān)于宮頸癌、直腸癌患者放化療對(duì)機(jī)體影響的研究,多以全身免疫炎癥指數(shù)及外周血中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值作為檢測(cè)指標(biāo)［3］,沒(méi)有進(jìn)一步分析這些指標(biāo)具體的影響機(jī)制,而且對(duì)腸道微生態(tài)與療效相關(guān)性的研究報(bào)道也比較少。本研究選擇宮頸鱗癌及直腸腺癌患者作為研究對(duì)象,分析患者同步放化療前后外周血中淋巴細(xì)胞、細(xì)胞因子和糞便中腸道菌群的變化,并進(jìn)一步分析有顯著變化的指標(biāo)與療效的關(guān)系,為探討盆腔腫瘤同步放化療對(duì)機(jī)體免疫功能、炎癥狀態(tài)和腸道微生態(tài)的影響及其機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2021年7月—2022年12月青島市中心醫(yī)院收治的病理確診為宮頸鱗癌或直腸腺癌的患者60例,其中宮頸鱗癌30例,直腸腺癌30例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～75歲者;②體力活動(dòng)狀態(tài)(PS)評(píng)分0～2分者;③宮頸鱗癌患者均符合美國(guó)國(guó)家癌癥網(wǎng)(NCCN)診療指南根治性同步放化療指征,直腸腺癌患者均符合中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)(CSCO)診療指南新輔助同步放化療指征［4］。排除標(biāo)準(zhǔn)：①治療前2個(gè)月內(nèi)接受過(guò)系統(tǒng)性抗菌藥物或者益生菌治療者,2周內(nèi)接受過(guò)任何質(zhì)子泵抑制劑治療者;②治療前6個(gè)月內(nèi)接受過(guò)腹盆腔放療及系統(tǒng)性化療者;③合并炎癥性腸病或者腸易激惹綜合征等腸炎疾病者;④合并有自身免疫性疾病者;⑤合并嚴(yán)重的心血管、肝臟、腎臟等疾病,即存在放化療禁忌證者;⑥同步放化療過(guò)程中出現(xiàn)不良反應(yīng)需行粒細(xì)胞集落刺激因子或激素治療者。

1.2 同步放化療方案

宮頸鱗癌患者采用容積弧形調(diào)強(qiáng)技術(shù)盆腔照射50.4 Gy/28 F,5次/周,腔內(nèi)照射治療A點(diǎn)劑量為6 Gy/F,1次/周,共4～5次,同步順鉑25 mg/m2,靜脈滴注,1次/周。直腸腺癌患者采用容積弧形調(diào)強(qiáng)放療技術(shù)盆腔照射50 Gy/25 F,5次/周,同步卡培他濱825 mg/m2,每天2次,口服,5次/周。

1.3 樣本采集

分別于盆腔放療開(kāi)始前3 d內(nèi)和結(jié)束后3 d內(nèi),采集患者清晨空腹?fàn)顟B(tài)外周靜脈血4 mL,用乙二胺四乙酸抗凝處理,6 h內(nèi)進(jìn)行外周血指標(biāo)檢測(cè);同期收集患者清晨糞便標(biāo)本1管(1.0～2.0 g),2 h內(nèi)置于-80 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.4 觀察指標(biāo)的檢測(cè)

1.4.1外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 使用Cytomics FC500流式細(xì)胞儀(美國(guó)BECKMAN COULTER公司)和淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD Biosciences公司),以熒光激活細(xì)胞分選法檢測(cè)外周血中B細(xì)胞(CD3-CD19+)、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+、自然殺傷細(xì)胞(CD3-CD16+CD56+),并計(jì)算細(xì)胞百分比。

1.4.2外周血細(xì)胞因子檢測(cè) 使用BriCyte E6流式細(xì)胞分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)和細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒(青島瑞斯凱爾生物科技有限公司),通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選法檢測(cè)患者外周血中白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、γ干擾素(IFN-γ)以及腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。

1.4.3糞便腸道菌群檢測(cè) 使用E.Z.N.A.?Mag-Bind Stool DNA Kit(200)DNA提取盒(美國(guó)Omega Bio-Tek公司),根據(jù)試劑盒上的指示進(jìn)行操作。提取DNA之后使用SMA4000超微量紫外可見(jiàn)核酸蛋白分析儀(北京美林恒通儀器有限公司)測(cè)量DNA的濃度,DNA吸光度(A)值滿足A260/A280≈1.7～1.9。設(shè)計(jì)具核梭桿菌、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌、鏈球菌引物序列［5-7］,引物名稱及其序列見(jiàn)表1,由Invitrogen公司合成。使用各目標(biāo)菌的質(zhì)粒(北京擎科生物科技股份有限公司)作為標(biāo)準(zhǔn)品,將各目標(biāo)菌的標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行6次10倍稀釋,獲得10-1～10-6共6個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品。以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè),以模板數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo),Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用TransStart?Top Green qPCR SuperMix(北京全式金生物技術(shù)股份有限公司)配制反應(yīng)體系：2×TransStart?Top Green qPCR SuperMix 10 μL,上游引物0.4 μL,下游引物0.4 μL,DNA模板2 μL,去離子水7.2 μL。RT-qPCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)熱30 s;94 ℃變性5 s,60 ℃延伸30 s,共循環(huán)45次,每次延伸階段采集熒光信號(hào),反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線分析。記錄CT值及溶解曲線,將CT值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式,得出每克糞便樣品中待測(cè)細(xì)菌基因拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值。

表1 引物名稱及其序列

1.5 療效評(píng)價(jià)

首次同步放化療前14 d內(nèi)及同步放化療結(jié)束后(30±3)d內(nèi)行盆腔MRI檢查,根據(jù)實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)1.1版本［8］進(jìn)行客觀療效評(píng)價(jià),包括完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)和疾病進(jìn)展(PD)4種療效等級(jí)。將影像學(xué)評(píng)估達(dá)到CR和PR的患者納入療效較好組,達(dá)到SD和PD的患者納入療效較差組。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 患者同步放化療前后外周血淋巴細(xì)胞亞群變化

患者進(jìn)行同步放化療以后外周血CD3+CD8+和CD3-CD19+細(xì)胞百分比較治療前均顯著性降低(t=2.995、2.779,P<0.05),CD3+、CD3+CD4+細(xì)胞百分比以及CD4+/CD8+比值較治療前均顯著升高(t=-4.321～-2.638,P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 患者同步放化療前后外周血淋巴細(xì)胞亞群變化

2.2 患者同步放化療前后外周血細(xì)胞因子變化

患者同步放化療后外周血中IL-1β、IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α水平相較于治療前均顯著升高(t=-3.422～-2.678,P<0.05),IL-10水平較治療前顯著降低(t=2.571,P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 患者同步放化療前后外周血細(xì)胞因子變化

2.3 患者同步放化療前后糞便腸道菌群變化

患者同步放化療后糞便具核梭桿菌、雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌數(shù)量較治療前顯著減少(t=3.128～3.954,P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 患者同步放化療前后糞便中腸道菌群的變化

2.4 患者同步放化療后外周血淋巴細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子和糞便腸道菌群與療效的相關(guān)性

本研究結(jié)果顯示,療效較好組47例,療效較差組13例。將患者治療前后存在差異變化的外周血淋巴細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子和糞便腸道菌群指標(biāo)與療效進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果顯示患者外周血CD3+細(xì)胞百分比、CD3+CD4+細(xì)胞百分比和糞便雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌數(shù)量與療效呈正相關(guān)(rs=0.440～0.540,P<0.05);外周血IL-6、TNF-α水平和糞便具核梭桿菌數(shù)量與療效呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.685～-0.377,P<0.05)。

3 討 論

宮頸癌和直腸癌作為常見(jiàn)的盆腔腫瘤,其早期臨床癥狀常較為隱匿,很多患者確診時(shí)已發(fā)展為中晚期［9］。同步放化療是局部晚期宮頸癌和直腸癌患者的重要治療手段,同步放化療較單純放療、化療有效率更高。新輔助同步放化療可降低直腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)率,根治性同步放化療可顯著延長(zhǎng)不可切除的宮頸癌患者生存期。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),機(jī)體免疫功能、炎癥狀態(tài)和腸道微生態(tài)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中有重要地位,且與腫瘤的療效密切相關(guān)［10-12］。而盆腔同步放化療對(duì)機(jī)體免疫功能、炎癥狀態(tài)和腸道菌群是否產(chǎn)生影響,以及是否進(jìn)一步影響療效,還有待進(jìn)一步研究。

淋巴細(xì)胞及細(xì)胞因子是機(jī)體免疫和炎癥反應(yīng)的重要組成部分,參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展［13］,并可能與療效相關(guān)。淋巴細(xì)胞具有免疫識(shí)別功能,根據(jù)其表型和生物學(xué)功能,分為CD3+CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTLs)、CD3+CD4+輔助性T細(xì)胞(Th)、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞［14］。其中CTLs通過(guò)直接或間接殺傷腫瘤細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞免疫功能;Th可分為T(mén)h1和Th2,Th1分泌的IL-2和IFN-γ可誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖、激活自然殺傷細(xì)胞,主要參與機(jī)體細(xì)胞免疫,能促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生,同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者的IL-2低水平與預(yù)后不良相關(guān)。Th2分泌的IL-4和IL-10可促進(jìn)B細(xì)胞分泌抗體,主要參與機(jī)體體液免疫,能同時(shí)抑制Th1所介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和由活性氧代謝產(chǎn)物所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［15-16］;B細(xì)胞通過(guò)分泌抗體發(fā)揮調(diào)節(jié)體液免疫功能,自然殺傷細(xì)胞通過(guò)分泌促炎因子和趨化因子參與機(jī)體的抗腫瘤、抗病毒過(guò)程。而促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α可通過(guò)它們各自受體誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)參與機(jī)體炎癥反應(yīng),促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展以及轉(zhuǎn)移［17-18］。有研究發(fā)現(xiàn)CD4+/CD8+比值能反映機(jī)體免疫功能,該比值下降則提示機(jī)體的免疫功能降低。腫瘤患者外周血中CD3+、CD3+CD4+、CD3-CD19+細(xì)胞百分比以及CD4+/CD8+比值均較健康人群低,提示腫瘤患者機(jī)體免疫功能受到了抑制［19］。

本研究結(jié)果顯示,盆腔同步放化療后患者外周血CD3+、CD3+CD4+細(xì)胞百分比和CD4+/CD8+比值顯著增高,外周血CD3+CD8+及CD3-CD19+細(xì)胞百分比顯著降低;同時(shí)外周血促炎因子IL-1β、IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α水平顯著增高,外周血抗炎因子IL-10水平顯著降低。提示盆腔同步放化療可能激活機(jī)體抗腫瘤免疫功能,減輕機(jī)體免疫抑制狀態(tài),促進(jìn)機(jī)體炎癥反應(yīng)的發(fā)生。結(jié)合淋巴細(xì)胞亞群變化和細(xì)胞因子變化分析,同步放化療后Th百分比以及由Th1分泌的IL-2、IFN-γ水平升高,提示同步放化療可能激活機(jī)體細(xì)胞免疫;而B(niǎo)細(xì)胞百分比以及由Th2分泌的IL-4、IL-10水平均降低,提示同步放化療可能抑制B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫。在同步放化療時(shí)可以通過(guò)監(jiān)測(cè)淋巴細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子變化,更好地了解盆腔腫瘤患者機(jī)體免疫功能及炎癥狀態(tài)的變化。

腸道菌群是微生物在人體等宿主的腸道內(nèi)共同進(jìn)化形成的一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)［20］。由于腸道處于缺氧環(huán)境,具核梭桿菌、雙歧桿菌等厭氧菌及嗜酸乳桿菌等兼性厭氧菌在腸道中起主導(dǎo)作用。研究發(fā)現(xiàn)具核梭桿菌可以促進(jìn)炎癥反應(yīng)、刺激癌細(xì)胞生長(zhǎng),可能參與結(jié)直腸癌、宮頸癌等多種腫瘤的發(fā)生［21-23］。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和鏈球菌等益生菌能降低盆腔放療、化療或同步放化療所致的腹瀉發(fā)生率,并且可能與療效相關(guān)［24］。本研究采用能針對(duì)特定細(xì)菌進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)的RT-qPCR技術(shù),選擇具核梭桿菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌以及鏈球菌4種前期研究顯示可能與腫瘤發(fā)生發(fā)展、療效相關(guān)的腸道細(xì)菌作為檢測(cè)對(duì)象,發(fā)現(xiàn)盆腔同步放化療后患者糞便具核梭桿菌、雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌數(shù)量顯著減少。提示盆腔同步放化療可能造成致病菌和益生菌減少,出現(xiàn)腸道菌群紊亂。

將治療前后有差異的觀察指標(biāo)與療效進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),盆腔腫瘤患者治療后外周血中CD3+、CD4+細(xì)胞百分比高水平和糞便雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌高表達(dá)與療效較好相關(guān),外周血IL-6、TNF-α的高水平和糞便具核梭桿菌高表達(dá)與療效較差相關(guān)。提示機(jī)體免疫功能、炎癥狀態(tài)和腸道菌群與療效有一定的相關(guān)性。因此,可望通過(guò)檢測(cè)上述指標(biāo)的變化預(yù)測(cè)患者療效,并有可能通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫炎癥狀態(tài)調(diào)控放化療療效,值得臨床進(jìn)一步研究。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)盆腔腫瘤患者同步放化療可激活機(jī)體抗腫瘤免疫功能,減輕機(jī)體免疫抑制狀態(tài),促進(jìn)機(jī)體炎癥反應(yīng)的發(fā)生。另外,盆腔同步放化療可導(dǎo)致腸道益生菌和致病菌減少,造成腸道菌群紊亂、改變腸道微生態(tài)。同時(shí),盆腔同步放化療后外周血中CD3+CD4+細(xì)胞百分比和糞便雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌數(shù)量與療效呈正相關(guān),而外周血IL-6、TNF-α水平和糞便具核梭桿菌數(shù)量與療效呈負(fù)相關(guān)。但本研究納入的病例數(shù)較少,今后將擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究,并觀察上述指標(biāo)與不良反應(yīng)的發(fā)生之間的關(guān)系,探討其具體作用機(jī)制。

倫理批準(zhǔn)和知情同意：本研究涉及的所有試驗(yàn)均已通過(guò)青島大學(xué)附屬青島市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)(文件號(hào)KY202110-601)。所有試驗(yàn)過(guò)程均遵照《涉及人的生物醫(yī)學(xué)研究倫理審查辦法》(2016)的條例進(jìn)行。受試對(duì)象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書(shū)。

作者聲明：呂卓純、鞠芳、陳曉慧參與了研究設(shè)計(jì);呂卓純、鞠芳、秦琛參與了論文的寫(xiě)作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。