張萍 馬嵐 陳樺

(1 青島大學基礎(chǔ)醫(yī)學院,山東 青島 266071;2 臨沂市平邑縣中醫(yī)院病理科;3 青島市市立醫(yī)院病理科)

卵巢癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一,其發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌［1］,患者5年生存率低于45%。近年來,全球卵巢癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢［2］。卵巢癌分為不同的組織學亞型,這些亞型在細胞起源、分子模式和臨床特征上有所不同。最常見的亞型是高級別漿液性卵巢癌(high grade serous ovarian cancer,HGSOC),其也是卵巢癌患者死亡率較高的亞型之一［3］。隨著分子病理學發(fā)展和靶向藥物研發(fā),HGSOC的診療取得了很大進步,但復發(fā)性和多藥耐藥(MDR)仍舊是其治療上的主要障礙［4］。且孕烷X受體(PXR)、多藥耐藥蛋白1(MDR1)、細胞色素P450 3A5(CYP3A5)和細胞色素P450 2B6(CYP2B6)可通過不同的方式參與藥物代謝,引起腫瘤的化療耐藥［5］。有研究顯示,PXR基因能調(diào)控CYP3A5、CYP2B6、MDRl基因的表達［6］,引起相應基因表達產(chǎn)物改變,從而影響相應的藥物代謝,導致MDR的出現(xiàn)［7］。本研究通過免疫組織化學、實時定量熒光PCR及蛋白印跡等方法,對PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6蛋白及基因進行檢測,比較其在HGSOC和非HGSOC患者及HGSOC化療耐藥和敏感患者間的差異表達,以求為HGSOC患者個體化治療提供更多理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年9月—2021年12月青島市市立醫(yī)院婦科收治的56例HGSOC患者作為試驗組?；颊呒{入標準：①原發(fā)性HGSOC者;②未合并其他臟器惡性疾病者;③既往無卵巢手術(shù)史者;④行腹腔鏡或者開腹全子宮+雙側(cè)附件+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù),且術(shù)后行鉑類藥物化療者。排除標準：①認知功能或精神異常者;②合并有心肝肺等重要臟器疾病者;③臨床資料缺損或丟失者。根據(jù)HGSOC患者對鉑類化療藥的耐藥情況,將初次采用鉑類藥物作為基礎(chǔ)化療藥物并獲得緩解,且停藥超過6個月未復發(fā)者設為敏感組;將初次采用鉑類藥物作為基礎(chǔ)化療藥物治療有效,但完成化療6個月內(nèi)復發(fā)者設為耐藥組。另選取婦科同期收治的行子宮+雙側(cè)輸卵管切除術(shù)的16例子宮肌瘤患者作為對照組。

1.2 主要試劑和儀器

PXR鼠抗人單克隆抗體購自美國SantaCruz公司,MDR1、CYP3A5和CYP2B6鼠抗人單克隆抗體購自美國Abcam公司,免疫組化二抗PV-6000試劑盒、DAB試劑盒和山羊血清封閉液購自北京中杉金橋生物科技有限公司,GAPDH抗體、兔/鼠二抗購自上海艾比瑪特醫(yī)藥科技有限公司,RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司,熒光定量PCR試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司,PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司設計,蛋白印跡預制膠購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司,電泳液、轉(zhuǎn)膜液及裂解液購自上海碧云天生物科技有限公司,TBST購自北京索萊寶生物科技有限公司。儀器包括超微量分光光度計(上海凌光技術(shù)公司)、實時定量PCR儀CFX96 Real-Time PCR Detection System(美國伯樂公司)和電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)等。

1.3 研究方法

1.3.1免疫組織化學檢測 將試驗組HGSOC患者腫瘤組織及對照組子宮肌瘤患者的正常輸卵管組織置于40 g/L的甲醛溶液中固定,后脫水、包埋、切片、烤片、脫蠟,在檸檬酸鹽緩沖液中加熱進行抗原修復,使用山羊血清封閉;分別滴加PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6一抗,37 ℃下孵育1 h,PBS清洗后滴加二抗,室溫孵育30 min;繼續(xù)用PBS清洗3次,DAB顯色,蘇木精復染,封片處理［8］。顯微鏡下觀察,每張切片隨機選取10個具有代表性著色的高倍視野作為最終結(jié)果。使用AxioVision Rel.4.6計算機化圖像分析系統(tǒng)進行拍照。所有切片請病理學專家評估組織染色的程度,染色區(qū)域評分如下：0分(染色區(qū)域接近0)、1分(染色區(qū)域小于10%)、2分(染色區(qū)域11%～35%)、3分(染色區(qū)域36%～75%)、4分(染色區(qū)域76%～100%);染色強度評分如下：0分(無染色)、1分(弱染色)、3分(中度染色)和4分(強染色)。最終使用染色指數(shù)(SI)評分(SI評分=染色區(qū)域評分×染色強度評分)評價蛋白表達程度,SI評分≥4為陽性,SI評分<4為陰性［9］。統(tǒng)計各組患者中PXR、MDR1、CYP3A5、CYP2B6的陽性例數(shù),并計算各組上述指標的陽性表達率。

1.3.2實時熒光定量PCR檢測 將試驗組HGSOC腫瘤組織及對照組正常輸卵管組織分別在液氮中磨碎,按RNA提取試劑盒說明書步驟提取組織RNA,并用分光光度計測量吸光度值計算RNA濃度,根據(jù)各組濃度按照逆轉(zhuǎn)錄和擴增試劑盒說明書分別加入試劑和引物(表1)。在實時定量PCR儀上用兩步法行PCR擴增,首先95 ℃預變性30 s;然后95 ℃變性 5 s,60 ℃ 退火30 s,共進行40個循環(huán),從而得到各組的溶解曲線。根據(jù)PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6基因擴增的CT值,以GAPDH作為內(nèi)參照,使用2-△△CT法計算出各組PXR、MDR1、CYP3A5、CYP2B6 mRNA的相對表達量。

表1 PCR引物名稱及序列

1.3.3蛋白質(zhì)印跡分析 將試驗組HGSOC腫瘤組織及對照組正常輸卵管組織分別剪碎并充分研磨,加入裂解液和蛋白酶抑制劑及少量液氮勻漿;放置于預冷離心機中,在4 ℃下以12 000 r/min離心20 min;離心后EP管中吸取中間層,用BCA法檢測蛋白濃度;加入Loading Buffer,100 ℃下煮沸10 min。根據(jù)測得蛋白濃度進行電泳、轉(zhuǎn)膜,用含體積分數(shù)0.05脫脂奶粉的TBST液室溫封閉2 h;以后分別加入PXR (1∶1 000)、MDR1(1∶2 000)、CYP3A5(1∶1 000)、CYP2B6(1∶1 000)和GAPDH(1∶8 000)一抗進行孵育,4 ℃環(huán)境下過夜。TBST清洗后,加入兔/鼠二抗(1∶8 000)室溫孵育1 h,TBST溶液清洗3次后顯影。使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參計算各組PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1 試驗組及對照組患者PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6表達情況比較

本研究試驗組56例患者中耐藥組24例,敏感組32例;對照組患者16例。免疫組化染色結(jié)果顯示,試驗組患者HGSCO組織中PXR、CYP3A5和CYP2B6表達呈陽性,腫瘤細胞胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色,MDR1表達呈陽性,腫瘤細胞膜呈棕黃色;對照組患者正常輸卵管組織PXR、CYP3A5和CYP2B6表達呈弱陽性或陰性,細胞質(zhì)淡黃色或不著色,MDR1表達呈弱陽性或陰性,腫瘤細胞膜淡黃色或不著色(圖1)。試驗組患者HGSOC組織中PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6的陽性表達率分別為71.4%、75.0%、73.2%和76.8%,對照組患者中上述指標的陽性表達率分別為43.8%、37.5%、31.3%和43.8%,試驗組患者HGSCO組織上述指標的的陽性率均顯著高于對照組(χ2=12.879～17.174,P<0.05)。

圖1 試驗組與對照組患者相應組織PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6免疫組織化學染色結(jié)果(HE染色,400倍)

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示,試驗組患者HGSOC組織中PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6 mRNA相對表達量分別為0.79±0.18、0.93±0.06、0.87±0.07和1.01±0.11,對照組患者正常輸卵管組織中上述指標mRNA相對表達量分別為0.30±0.05、0.35±0.03、0.31±0.021和0.59±0.05,兩組比較差異有顯著性(t=9.746～17.640,P<0.05)。

蛋白印跡實驗結(jié)果顯示,試驗組患者HGSOC組織中PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6蛋白的相對表達量分別為1.15±0.16、0.96±0.03、1.13±0.14和1.18±0.07,對照組患者正常輸卵管組織中上述指標的相對表達量分別為0.56±0.00、0.68±0.06、0.54±0.05和0.58±0.08,兩組比較差異有顯著性(t=13.312～60.448,P<0.05)。見圖2。

圖2 試驗組與對照組患者PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6蛋白的表達量

2.2 敏感組及耐藥組患者PXR、MDR1、CYP3A5Y和CYP2B6表達情況比較

耐藥組患者的HGSOC組織中PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6的陽性表達率分別為87.50%、91.70%、87.50%和95.80%,敏感組患者HGSOC組織中上述4指標的陽性表達率則分別為59.40%、62.50%、62.50%和62.50%,兩組比較差異有顯著性(χ2=4.371～8.549,P<0.05)。

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示,耐藥組患者HGSOC組織中PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6的mRNA相對表達量分別為0.83±0.10、0.93±0.08、0.87±0.08和1.01±0.09,敏感組患者HGSOC組織中上述指標mRNA的相對表達量分別為0.57±0.07、0.50±0.04、0.55±0.02和0.49±0.08,兩組比較差異具有顯著性(t=6.859～19.000,P<0.05)。

蛋白印跡實驗結(jié)果顯示,耐藥組患者HGSOC組織中PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6蛋白相對表達量分別為1.01±0.02、1.13±0.10、0.90±0.07和1.23±0.04,敏感組患者HGSOC組織中上述指標的蛋白相對表達量分別為0.73±0.04、0.47±0.06、0.44±0.26和0.60±0.14,兩組比較差異有顯著性(t=8.693～27.670,P<0.05)。見圖3。

圖3 耐藥組與敏感組患者PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6蛋白的表達量

2.3 試驗組患者HGSOC組織中PXR與MDR1、CYP3A5、CYP2B6的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析顯示,試驗組患者HGSOC組織中PXR與CYP3A5、CYP2B6的表達呈正相關(guān)(r=0.332、0.308,P<0.05),而與MDR1無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

3 討 論

約80%卵巢癌患者在行全子宮+雙側(cè)附件+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)后,會接受卡鉑或順鉑和紫杉醇輔助化療,其中70%患者會復發(fā),進而對標準化療方案中的鉑類藥物產(chǎn)生耐藥,尤其是HGSOC患者,在治療中面臨著MDR的挑戰(zhàn),其預后往往較差［10-11］。有研究指出MDR潛在的機制有：①通過外排泵,如ABCB1編碼的MDR1,增加藥物的泵出;②通過藥物代謝轉(zhuǎn)運體(如MDR1表達的P-糖蛋白)使藥物攝取減少;③激活細胞色素P450酶系(CYPs)和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶等藥物代謝酶［12-13］,從而分解藥物并促進其排出。本研究通過免疫組化、實時定量熒光PCR以及蛋白印跡方法,證明了PXR、MDR1、CYP3A5以及CYP2B6在試驗組患者HGSOC組織中表達升高;其中耐藥組中患者PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6的mRNA及蛋白相對表達量均顯著高于敏感組,提示了HGSOC患者腫瘤組織中PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6的高表達可能與耐藥相關(guān)。因此可以通過檢測上述因子,來預測HGSOC患者對化療的敏感性,或者通過靶向抑制這些因子的表達來提高HGSOC患者對化療藥物的敏感性,以獲得更有效的治療效果。

PXR是核受體超家族的典型成員,在細胞內(nèi)的主要功能是通過配體依賴的方式與調(diào)控基因序列結(jié)合,在細胞增殖、細胞周期等過程中發(fā)揮著重要作用［14］。PXR與宮頸癌、結(jié)腸癌及肺癌等多種惡性腫瘤相關(guān)［5］。PXR在解毒過程中也發(fā)揮著重要的作用,內(nèi)源性化合物及化療藥物等外源性化合物在體內(nèi)都可以通過結(jié)合配體激活PXR,上調(diào)藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運體(例如CYPs和多藥耐藥蛋白等)的表達,從而加速自身在體內(nèi)的代謝和清除［15］,上述過程使化療藥物的效果大打折扣。本研究中,試驗組患者中PXR陽性表達率和mRNA及蛋白相對表達量均明顯高于對照組,說明PXR可能參與HGSOC的發(fā)生發(fā)展過程,這與VETTER等［16］的研究結(jié)果一致。MDR1是一種膜結(jié)合的ABC轉(zhuǎn)運蛋白,它編碼的P-糖蛋白參與多種抗癌藥物(包括阿霉素、紫杉烷和鉑類)的MDR。人體內(nèi)MDR1可以廣泛結(jié)合多種底物化合物,并利用ATP水解作用將化療藥物排出癌細胞［17］,降低化療藥物的療效。因此其存在是卵巢癌化療失敗的重要原因之一［18］。本研究中,試驗組患者MDR1陽性表達率和mRNA及蛋白相對表達量均明顯高于對照組。另外既往研究顯示MDR1與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展及臨床預后有關(guān)［19］。喻朝霞等［20］的研究也發(fā)現(xiàn),MDR1的高表達參與了上皮性卵巢癌的發(fā)生及由良性到惡性的進展過程。這也與本研究的結(jié)論一致,提示MDR1可以作為HGSOC發(fā)生發(fā)展,尤其是從正常組織或良性病變進展為惡性病變的輔助診斷標志物之一。

CYPs是藥物代謝的主要催化劑之一,其功能受基因多態(tài)性的影響較大,從而導致了藥物療效和(或)個體間差異顯著［21］。CYP3A5基因位點的遺傳變異影響了包括免疫抑制劑他克莫司、環(huán)孢素等在內(nèi)的多種臨床藥物代謝［22］。SEELIG等［18］發(fā)現(xiàn)CYP3A5蛋白在多種惡性腫瘤中呈高表達,重要的是,它在外分泌樣亞型腫瘤中會降低腫瘤細胞的藥物敏感性,使其對酪氨酸激酶抑制劑和紫杉醇產(chǎn)生耐藥性,這使得CYP3A5可能成為檢驗化學藥物療效和腫瘤早期診斷的預測因子。CYP2B6是人類唯一屬于CYP2B亞家族的酶,其主要在成人肝臟中表達［23］,可參與抗逆轉(zhuǎn)錄病毒、抗瘧疾、抗癌以及抗抑郁藥物的代謝過程,但是受自身基因多態(tài)性的影響［24］,其催化活性和表達在個體之間差異較大。本研究中,試驗組患者CYP3A5、CYP2B6的陽性表達率和mRNA及蛋白相對表達量均明顯高于對照組,提示CYP3A5、CYP2B6的高表達可能參與了HGSOC的增殖侵襲過程。

為進一步探究HGSOC患者腫瘤組織中PXR、MDR1、CYP3A5以及CYP2B6間關(guān)系,本研究進行了Spearman相關(guān)分析,結(jié)果顯示PXR與CYP3A5和CYP2B6的表達正相關(guān),也與已有報道一致［25］;CREAMER等［15］的研究表明PXR可調(diào)控MDR1的表達并存在協(xié)同作用,而本研究中PXR與MDR1無相關(guān)性,故后續(xù)可通過擴大樣本量、細化實驗如體外卵巢癌細胞培養(yǎng)、干擾PXR表達及觀察MDR1表達有無變化等進一步研究兩者間的關(guān)系。

綜上所述,PXR、MDR1、CYP3A5、CYP2B6在HGSOC患者的腫瘤組織中呈高表達,其可能參與HGSOC的發(fā)生發(fā)展過程。PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6的表達水平可用于判斷HGSOC對化療藥物的敏感性,有助于為術(shù)后化療提供指導意見。

倫理批準和知情同意：本研究涉及的所有試驗均已通過青島市市立醫(yī)院科學倫理委員會的審核批準(文件號2022臨審字第093號)。所有試驗過程均遵照《青島市市立醫(yī)院中心實驗室守則》的條例進行。受試對象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書。

作者聲明：張萍、馬嵐和陳樺參與了研究設計;張萍、陳樺參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。