陳榮榮,張 茜

膿毒癥心肌病是臨床上膿毒癥最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一,炎癥、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙及心肌細(xì)胞凋亡參與了膿毒癥心肌損傷的發(fā)生;闡明心肌細(xì)胞損傷的機(jī)制,從而改善膿毒癥病人心肌損傷狀況,對(duì)臨床治療膿毒癥具有重要意義[1-2]。研究表明,中醫(yī)藥在治療膿毒癥方面效果明顯[3]。蔥白為百合科植物蔥近根部的鱗莖,是臨床常用的中藥,其主要化學(xué)活性成分為甾體及皂苷類(lèi)化合物、黃酮類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)等,具有心臟保護(hù)、抗血栓、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用,可以治療心腦血管疾病[4]。有研究報(bào)道,蔥白提取物可抑制心肌梗死后心力衰竭大鼠的心肌纖維化[5];蔥白提取物可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)與抗氧化損傷抗大鼠急性心肌缺血[6];蔥白提取物可明顯降低大鼠血清丙二醛(MDA),升高超氧化物歧化酶(SOD)及總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)水平,對(duì)缺血心肌具有保護(hù)作用[7]。以上研究表明,蔥白提取物具有抗氧化作用,且可抗心肌缺血。然而蔥白提取物對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷的影響及機(jī)制尚不清楚。有研究報(bào)道,敲減miR-194-5p可抑制LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎性因子的分泌,可為心血管損傷的治療提供新靶點(diǎn)[8]。因此,本實(shí)驗(yàn)旨在觀察蔥白提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷的影響,并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 H9c2細(xì)胞(美國(guó)ATCC);DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone);LPS(美國(guó)Sigma);蔥白提取物(西安金綠生物工程技術(shù)有限公司);細(xì)胞毒性試驗(yàn)(CCK-8)試劑盒、蛋白提取試劑盒、凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海吉至生化科技有限公司;MDA含量檢測(cè)試劑盒、SOD活性檢測(cè)試劑盒和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司;熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑盒購(gòu)自上?？泼羯锟萍加邢薰尽?/p>

1.2 CCK-8法檢測(cè)LPS對(duì)H9c2細(xì)胞活性的影響 H9c2細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,分別用1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL的LPS處理,在5%體積分?jǐn)?shù)CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,每孔加入10 μL的CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)2 h,酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處吸光度值(A)。后續(xù)試驗(yàn)選擇細(xì)胞活性約為50%的LPS濃度。

1.3 細(xì)胞處理與分組 常規(guī)培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞作為NC組,單獨(dú)用LPS 10 μg/mL處理的H9c2細(xì)胞作為L(zhǎng)PS組,分別用25 mg/mL、50 mg/mL、100 mg/mL蔥白提取物和LPS 10 μg/mL處理的H9c2細(xì)胞作為蔥白提取物低劑量組、中劑量組、高劑量組;將miR-194-5p抑制劑及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞后用10 μg/mL的LPS處理,作為anti-miR-194-5p+LPS組、anti-miR-NC+LPS組;將miR-194-5p模擬物及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞后用100 mg/mL蔥白提取物和10 μg/mL的LPS處理,作為miR-194-5p+蔥白提取物高劑量+LPS組、miR-NC+蔥白提取物高劑量+LPS組。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測(cè)蛋白表達(dá) 提取各組H9c2細(xì)胞的總蛋白,定量變性后取50 μg進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),然后轉(zhuǎn)膜、封閉,分別加入Cleaved-Caspase-3和Bax一抗(1∶800),4 ℃孵育過(guò)夜;洗膜后加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h,顯影、成像后分析蛋白條帶灰度值,以β-actin為內(nèi)參。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取各組培養(yǎng)48 h的細(xì)胞,加入胰酶消化后用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)漂洗細(xì)胞2次,加入結(jié)合緩沖液輕搖使之形成均勻細(xì)胞懸液,分別加V-異硫氰酸熒光素(annexin V-FITC)和碘化丙啶(propidium iodide,PI)各5 μL,輕搖混勻,常溫避光孵育15 min,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞中MDA含量及SOD、CAT活性 細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞,分別按各自試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)miR-194-5p表達(dá)水平 提取各組H9c2細(xì)胞總RNA,合成cDNA后以U6為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增,相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。miR-194-5p正向引物序列為5′-GCCGTGTAACAGCAACTCCA-3′,反向引物序列為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;U6正向引物序列為5′-GTGGACCGCACAAGCTCGCT-3′,反向引物序列為5′-TTGTTGAACGGCACTGTGTATAGCA-3′。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度LPS對(duì)H9c2細(xì)胞活性的影響 與0 μg/mL的LPS比較,1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL的LPS處理后H9c2細(xì)胞活性明顯降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。選擇細(xì)胞活力為50%左右的LPS濃度(10 μg/mL)用于后續(xù)試驗(yàn)。

表1 不同濃度LPS對(duì)H9c2細(xì)胞活性的影響

2.2 不同濃度蔥白提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡及蛋白表達(dá)的影響 與NC組比較,LPS組Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平和H9c2細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05);與LPS組比較,蔥白提取物低、中、高劑量組Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平和H9c2細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)。詳見(jiàn)圖1、圖2及表2。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組H9c2細(xì)胞凋亡

圖2 Western Blot檢測(cè)各組Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)

表2 各組H9c2細(xì)胞凋亡率及Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平比較

2.3 不同濃度蔥白提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響 與NC組比較,LPS組MDA含量升高,SOD和CAT活性降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與LPS組比較,蔥白提取物低、中、高劑量組MDA含量降低,SOD和CAT活性升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 各組氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、SOD、CAT比較

2.4 不同濃度蔥白提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中miR-194-5p表達(dá)水平的影響 與NC組比較,LPS組miR-194-5p表達(dá)水平升高(P<0.05);與LPS組比較,蔥白提取物低、中、高劑量組miR-194-5p表達(dá)水平降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表4。

表4 各組LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中miR-194-5p表達(dá)水平比較

2.5 anti-miR-194-5p對(duì)LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡、蛋白表達(dá)和氧化應(yīng)激損傷的影響 與anti-miR-NC+LPS組比較,anti-miR-194-5p+LPS組miR-194-5p表達(dá)水平降低,Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率降低,MDA含量降低,SOD和CAT活性升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。詳見(jiàn)圖3、圖4及表5。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)H9c2細(xì)胞凋亡

圖4 Western Blot檢測(cè)Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)

表5 anti-miR-194-5p對(duì)LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)和氧化應(yīng)激損傷的影響

2.6 miR-194-5p逆轉(zhuǎn)蔥白提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷的影響 與miR-NC+蔥白提取物高劑量+LPS組比較,miR-194-5p+蔥白提取物高劑量+LPS組miR-194-5p表達(dá)水平升高,Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率升高,MDA含量升高,SOD和CAT活性降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。詳見(jiàn)表6及圖5、圖6。

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)H9c2細(xì)胞凋亡

圖6 Western Blot檢測(cè)Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)

表6 miR-194-5p逆轉(zhuǎn)蔥白提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷的影響

3 討 論

膿毒癥心肌病的發(fā)生是膿毒癥病人預(yù)后不良的預(yù)測(cè)因素之一,氧化應(yīng)激是膿毒癥多臟器,多系統(tǒng)損傷的根本機(jī)制,參與了心肌損害的發(fā)病過(guò)程,抗氧化劑可能成為膿毒癥治療的新策略[9-11]。有研究表明,蔥白提取物可通過(guò)提高硫化氫(H2S)和一氧化氮(NO)水平抗大鼠急性心肌缺血[12]。蔥白提取物通過(guò)線粒體途徑減少心肌細(xì)胞凋亡從而對(duì)心肌缺血再灌注損傷起保護(hù)作用[13]。蔥白提取物可降低急性心肌缺血兔血清中MDA水平,升高SOD水平[14]。本實(shí)驗(yàn)用不同濃度LPS處理心肌細(xì)胞,選擇細(xì)胞活力為50%左右的LPS濃度(10 μg/mL)用于后續(xù)試驗(yàn),建立細(xì)胞損傷模型;LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2的凋亡率升高,MDA含量升高,SOD和CAT活性降低。而用不同濃度蔥白提取物預(yù)處理后,H9c2細(xì)胞凋亡率降低,MDA含量降低,SOD和CAT活性升高。表明蔥白提取物可抑制LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,蔥白提取物在LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中同樣具有抗凋亡和抗氧化應(yīng)激損傷的作用。

研究報(bào)道,敲除lncRNA MALAT1可通過(guò)miR-194-5p/FOXP2軸抑制細(xì)胞凋亡從而減輕LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷[15]。circ-USP1通過(guò)調(diào)節(jié)miR-194-5p/DNMT3A軸保護(hù)腎小管免受缺氧誘導(dǎo)的腎損傷[16]。且已有研究報(bào)道敲減miR-194-5p可抑制LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-194-5p表達(dá)水平升高;抑制miR-194-5p表達(dá)后,細(xì)胞凋亡率降低,MDA含量降低,SOD和CAT活性升高,表明抑制miR-194-5p表達(dá)可抑制LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激。

此外,本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)蔥白提取物處理可降低miR-194-5p表達(dá)水平;過(guò)表達(dá)miR-194-5p和高劑量蔥白提取物處理后,心肌細(xì)胞凋亡率升高,MDA含量升高,SOD和CAT活性降低。說(shuō)明miR-194-5p過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了蔥白提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的H9c2凋亡和氧化應(yīng)激損傷的影響。

綜上所述,蔥白提取物通過(guò)下調(diào)miR-194-5p抑制LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷。