賈子君,周慶兵,張 艷,徐鳳芹

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、中風和外周動脈疾病的主要病理基礎[1]。動脈粥樣硬化嚴重威脅人民群眾的身體健康,也給國家和社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔[2]?，F(xiàn)有研究表明,動脈粥樣硬化的病理機制主要包括炎癥反應、血脂異常、平滑肌細胞異常增殖等[3]。近年來,隨著多組學技術的不斷發(fā)展,動脈粥樣硬化基因甲基化的研究受到眾多研究者的關注[4]。DNA甲基化是表觀遺傳學的重要組成部分,是指胞嘧啶添加甲基基團形成5-甲基胞嘧啶,這一過程需要DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的介導,并由S-腺苷甲硫氨酸提供甲基供體。DNA甲基化對基因的表達具有重要的調(diào)控作用,一般認為啟動子區(qū)域高甲基化能抑制基因的下游表達,低甲基化能促進基因的表達[5]。現(xiàn)有研究表明,DNA異常甲基化在動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展中扮演重要角色,以動脈粥樣硬化異?；蚣谆癁榘悬c的藥物開發(fā)研究有可能為動脈粥樣硬化的治療帶來突破[6]。

傳統(tǒng)中醫(yī)中并沒有動脈粥樣硬化這一病名,參照動脈粥樣硬化類疾病的常見臨床癥狀表現(xiàn),可將其歸入到中醫(yī)“脈痹”“胸痹”“中風”等疾病范疇中。近年來,陳可冀院士團隊提出了以瘀毒病機為核心的動脈粥樣硬化致病理論[7]。徐鳳芹教授傳承了陳可冀院士瘀毒理論思想,從古典名方越鞠丸中發(fā)掘出梔子、川芎兩味中藥,并在臨床中廣泛使用該藥對治療動脈粥樣硬化類疾病,取得了較好的臨床療效。梔子性味苦寒,歸心、肺、三焦經(jīng),有瀉火除煩、清熱涼血解毒之功[8]。川芎辛溫無毒,活血行氣、祛風止痛[9],《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載川芎“上行頭目,中開郁結(jié),下行血海,旁通絡脈,為血中之氣藥”。前期課題組研究表明,活血解毒藥對梔子、川芎能夠縮小兔動脈粥樣硬化斑塊厚度及面積,在DNA甲基化研究方面,高通量測序發(fā)現(xiàn)梔子、川芎藥對能調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化兔異常的基因甲基化水平[10]。本研究則從DNA甲基化及下游基因的表達角度,運用多組學技術,進一步深入闡明梔子、川芎藥對治療動脈粥樣硬化的現(xiàn)代生物學機制。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物、試劑及儀器 梔子-川芎凍干粉由中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院制劑室制備,梔子與川芎生藥質(zhì)量比為4∶5;人氧化型低密度脂蛋白(human oxidized-LDL,ox-LDL)購于廣東奕源生物科技有限公司(貨號:YB-002);Gbico DMEM高糖培養(yǎng)基(貨號:C11995500BT);細胞毒性試驗(CCK-8)細胞活力檢測試劑盒購于日本同仁有限公司(貨號:CK04-500);可溶性細胞間黏附分子-1(sICAM-1)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(貨號:EM013-96);小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA檢測試劑盒(貨號:EM008-96);小鼠白細胞介素6(IL-6)ELISA檢測試劑盒(貨號:EM004-96);DNA提取試劑盒DNeasy Blood Tissue Kit(250)(Qiagen, Valencia,CA,USA,貨號:166013782);動物總RNA抽提取試劑盒(磁珠法,貨號:T02-096);酶聯(lián)免疫檢測儀(美國,BioTek公司);二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(美國,Thermo公司);GCMS-TQ8040 NX mass spectrograph(SHIMADZU,Origin,Japan)。

1.2 細胞培養(yǎng)及泡沫細胞模型的建立 RAW 264.7細胞株購于北京協(xié)和細胞資源中心,培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,在37 ℃、5% CO2孵育箱中進行培養(yǎng)。按照前期課題組的方法建立泡沫細胞模型[11],以含有ox-LDL終濃度為80 mg/L的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h即可得到泡沫細胞。將細胞分為梔子-川芎凍干粉組(80 mg/L ox-LDL、0.3 g/L梔子-川芎凍干粉干預)、模型組(80 mg/L ox-LDL處理)和空白對照組(未處理)。

1.3 細胞毒性實驗 將梔子-川芎凍干粉溶于完全培養(yǎng)基中,進行細胞增殖抑制實驗,在細胞貼壁后加入含有梔子-川芎凍干粉不同濃度的完全培養(yǎng)基(藥物濃度分別為4.800 g/L、2.400 g/L、1.200 g/L、0.600 g/L、0.300 g/L、0.150 g/L、0.075 g/L),培養(yǎng)48 h后加入CCK-8試劑,檢測450 nm波長條件下的吸光度值,計算各組細胞存活率。

1.4 膽固醇和炎性因子檢測 使用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)測定不同細胞樣本中總膽固醇(total cholesterol,TC)、游離膽固醇(free cholesterol,FC)水平。使用帶有 RTX-5MS 色譜柱的 GCMS-TQ8040 NX 質(zhì)譜儀檢測樣本。ELISA法檢測不同樣本細胞上清中TNF-α、IL-6及ICAM-1含量,根據(jù)試劑盒說明書步驟進行檢測,由樣本的OD值計算出對應樣本中炎性因子濃度。

1.5 甲基化捕獲測序(MC-seq) 細胞樣本采用DNeasy Blood Tissue Kit(250)提取DNA,抽提所得DNA經(jīng)Qubit 2.0 Fluorometer和瓊脂糖凝膠電泳進行質(zhì)檢。對合格的DNA進行片段化及亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化等處理,完成建庫并使用Illumina NovaSeq6000測序儀測序。測序數(shù)據(jù)以GRCm38.p4(mm10)為參考基因組進行比對,計算差異甲基化CpG位點得到基因功能注釋。組間對比采用Bioconductor package中的DSS(dispersion shrinkage for sequencing data)工具,進行差異甲基化位點(differential methylation site,DMS)的檢測和注釋,閾值設為:P<0.05,甲基化差異程度>10%。

1.6 RNA測序(RNA-seq) 提取細胞RNA,抽提所得RNA經(jīng)Agilent 2100 Bioanalyzer(agilent technologies santa clara,US)電泳質(zhì)檢。對純化后的總RNA進行分離、片段化、cDNA合成及富集等步驟,完成建庫及質(zhì)檢后,使用Illumina NovaSeq6000測序儀進行測序,設定測序模式為PE150。對測序得到Raw Reads進行數(shù)據(jù)預處理,與基因組GRCm38.p4(mm10)進行比對,將reads轉(zhuǎn)化成FPKM(fragments per kilobase of exon model per million mapped reads)并進行基因表達量的標準化,進行基因功能注釋并計算出基因的表達量。應用edgeR進行樣本間差異基因分析,得出P值后進行多重假設檢驗校正,通過控制偽發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)來決定P的閾值。同時,根據(jù)FPKM值計算差異表達倍數(shù),即Fold-change。

1.7 京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析與基因本體(GO)富集分析 將符合篩選條件的基因運用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)進行KEGG富集分析及GO富集分析,并使用微生信在線繪圖平臺將結(jié)果進行可視化展示。

2 結(jié) 果

2.1 梔子-川芎凍干粉對RAW264.7細胞增殖的抑制效應 CCK-8實驗結(jié)果顯示,0.075～4.800 g/L 梔子-川芎凍干粉對RAW264.7細胞具有抑制效應,濃度越高,抑制效應越明顯,詳見圖1。本研究選用梔子-川芎凍干粉0.300 g/L作為后續(xù)實驗濃度。

圖1 不同濃度梔子-川芎凍干粉對RAW264.7細胞存活率的影響(n=3)

2.2 梔子-川芎藥對的降脂及抗炎效應 與空白對照組比較,模型組TC和FC水平明顯升高(P<0.01);與模型組比較,梔子-川芎凍干粉組TC和FC水平明顯下降(P<0.01)。詳見圖2。與空白對照組比較,模型組細胞上清液中TNF-α、IL-6和ICAM-1水平明顯升高(P<0.01);與模型組比較,梔子-川芎凍干粉組TNF-α、IL-6和ICAM-1表達水平明顯降低(P<0.01)。詳見圖3。

模型組與空白對照組比較,＊P<0.01;與模型組比較,# P<0.01。

模型組與空白對照組比較,＊ P<0.01;與模型組比較,# P<0.01。

2.3 梔子-川芎藥對逆轉(zhuǎn)ox-LDL誘導的甲基化變化 本研究應用MC-seq來確定梔子-川芎凍干粉是否可以改變泡沫細胞中全基因組DNA甲基化的狀態(tài)。熱圖直觀地在總體上顯示了3組樣本中基因的甲基化存在差異(見圖4)。進一步分析DMS在啟動子至轉(zhuǎn)錄起始位點區(qū)域(Promoter-TSS)的分布情況,模型組與空白對照組相比,模型組有8 421個DMSs,分別對應5 061個低甲基化和3 405個高甲基化基因位點(見圖5)。與模型組比較,梔子-川芎凍干粉組有8 395個DMSs,分別有4 257個高甲基化基因位點和4 138個低甲基化基因位點(見圖6)。

圖4 3組間基因甲基化程度的總體差異

圖5 模型組與空白對照組的差異甲基化基因

對模型組與空白對照組以及梔子-川芎凍干粉組與模型組差異甲基化(聚焦于啟動子區(qū)域)進行兩兩比較后取交集,共發(fā)現(xiàn)有7 669個DMSs,對應6 016個基因。具體來說,與空白對照組比較,模型組中有3 435個低甲基化的基因(4 315個DMSs)經(jīng)過梔子-川芎凍干粉處理后變?yōu)楦呒谆?見圖7)。有2 581個高甲基化基因(3 049個DMSs)通過梔子-川芎凍干粉處理后變?yōu)榈图谆?見圖8)。表明梔子-川芎凍干粉可以逆轉(zhuǎn)泡沫細胞中ox-LDL誘導的DNA甲基化變化。此外,對梔子-川芎凍干粉誘導的高甲基化與低甲基化基因分別進行KEGG分析,發(fā)現(xiàn)高甲基化基因涉及Ras信號通路、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信號通路、鈣信號通路等(見圖9),低甲基化基因涉及Rap1信號通路、Hippo信號通路、Wnt信號通路、PI3K-Akt信號通路等(見圖10)。

圖7 梔子-川芎凍干粉逆轉(zhuǎn)3 435個模型組低甲基化基因

圖8 模型組梔子-川芎凍干粉逆轉(zhuǎn)2 581個高甲基化基因

圖9 梔子-川芎凍干粉干預后轉(zhuǎn)為高甲基化基因的KEGG分析

圖10 梔子-川芎凍干粉干預后轉(zhuǎn)為低甲基化基因的KEGG分析

2.4 梔子-川芎凍干粉對泡沫細胞RNA表達的影響 RNA-seq檢測分析發(fā)現(xiàn)梔子-川芎凍干粉對泡沫細胞的基因表達存在影響。主成分分析(principal component analysis,PCA)顯示,3組內(nèi)樣本具有良好的一致性且組間有明顯差異(見圖11),熱圖(見圖12)也發(fā)現(xiàn)3組之間的基因表達存在差異。對組間差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs)進行可視化展示,與空白對照組比較,模型組有1 344個DEGs,包括874個低表達基因和470個高表達基因(見圖13)。與模型組比較,梔子-川芎凍干粉組有634個DEGs,分別對應302個高表達基因上調(diào),332個低表達基因(見圖14)。

圖11 PCA分析

圖12 RNA-seq熱圖

圖13 模型組與空白對照組DEGs分布

圖14 梔子-川芎凍干粉組與模型組DEGs分布

對模型組與空白對照組,梔子-川芎凍干粉組與模型組DEGs進行兩兩比較后取交集,共確定119個DEGs。具體而言,ox-LDL處理后上調(diào)的39個DEGs經(jīng)梔子-川芎凍干粉處理后下調(diào),下調(diào)的80個DEGs經(jīng)梔子-川芎凍干粉處理后上調(diào)。表明梔子-川芎凍干粉可以逆轉(zhuǎn)ox-LDL誘導的基因表達變化。

2.5 DNA甲基化與RNA表達譜關聯(lián)分析 DNA甲基化在基因轉(zhuǎn)錄中起著重要的調(diào)節(jié)作用。本研究對梔子-川芎凍干粉對誘導的基因表達變化與DNA甲基化進行關聯(lián)分析。與模型組相比,梔子-川芎凍干粉組分別有29個低甲基化高表達基因和33個高甲基化低表達基因,詳見圖15。KEGG分析提示這些基因涉及Focal adhesion信號通路、PI3K-Akt信號通路、晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(AGE-RAGE)信號通路等,詳見圖16。GO分析顯示涉及白細胞介素-1的產(chǎn)生、血管生成、腫瘤壞死因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)等生物學過程,詳見圖17。

圖15 梔子-川芎凍干粉組與模型組 DNA甲基化與RNA表達譜關聯(lián)分析散點圖

圖16 梔子-川芎凍干粉組與模型組低甲基化高表達基因以及高甲基化低表達基因的KEGG分析氣泡圖

圖17 梔子-川芎凍干粉組與模型組低甲基化高表達基因以及高甲基化低表達基因的GO分析條形圖

3 討 論

他汀類藥物是當前治療動脈粥樣硬化類疾病的主要手段。然而臨床研究也發(fā)現(xiàn),部分病人在服用他汀類藥物治療過程中出現(xiàn)的肌肉疼痛或血糖升高等副作用限制了該類藥物的使用[12],并且有相當部分病人在接受他汀類藥物治療后仍不可避免地出現(xiàn)了急性心腦血管事件[13]。近年來,從瘀毒致病理論出發(fā)創(chuàng)立的活血解毒法抗動脈粥樣硬化研究受到眾多中醫(yī)研究者的關注。已有的眾多研究表明,與單純活血化瘀或解毒中藥相比,解毒活血中藥具有更強的抗動脈粥樣硬化效應[14-15]。與既往研究結(jié)果一致,本研究中活血解毒中藥梔子-川芎藥對能夠明顯降低泡沫細胞中膽固醇與炎性因子水平,顯示出了較強的抗動脈粥樣硬化效應。

既往大量的研究表明,DNA異常基因甲基化在動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展中扮演重要角色,是動脈粥樣硬化的重要治療靶標。Kumar等[16]發(fā)現(xiàn)ox-LDL通過誘導人Kruppel樣因子2(endothelial Kruppel-like factor 2,KLF2)高甲基化導致該基因下游的表達降低,最終加重內(nèi)皮細胞的炎癥反應,引發(fā)內(nèi)皮細胞功能紊亂。另一方面,動脈粥樣硬化存在基因異常的低甲基化。Aavik等[17]運用高通量技術發(fā)現(xiàn),與9例正常人相比,22例動脈粥樣硬化斑塊病人存在3 997個異常的高甲基化基因,同時伴有782個異常的低甲基化基因。本研究還發(fā)現(xiàn),與空白對照組相比,模型組存在大量異常的甲基化基因,進一步證明了異?；蚣谆莿用}粥樣硬化重要的分子機制。與此同時,本研究發(fā)現(xiàn),梔子-川芎藥對能部分恢復ox-LDL誘導的基因異常甲基化水平,異常高甲基化基因[血小板源性生長因子受體α多肽(platelet-derived growth factor receptor alpha,PDGFRα)、纖維連接蛋白1(fibronectin-1,FN1)及Ⅰ型膠原蛋白α2(collagen type I alpha,COL1A2)、酪氨酸蛋白激酶受體B4(Ephb4)等]與異常低甲基化基因[YAM1、硫酯酶超家族成員4(THEM4)、神經(jīng)型一氧化氮合酶(NOS1)等]被梔子-川芎藥對逆轉(zhuǎn),說明梔子-川芎藥對能夠雙向調(diào)控基因甲基化。KEGG分析發(fā)現(xiàn),這些被逆轉(zhuǎn)甲基化的基因涉及Ras信號通路、PI3K-Akt信號通路、Hippo信號通路、Wnt信號通路等。

DNA甲基化調(diào)控基因的表達,因而在生命活動中占有重要地位。本研究運用RNA-seq觀察梔子-川芎藥對調(diào)控基因甲基化后的下游效應。經(jīng)ox-LDL誘導后,出現(xiàn)了異常的DEGs,包括874個低表達基因和470個高表達基因。分別進行兩兩比較后取交集(模型組與空白對照組,梔子-川芎凍干粉組與模型組),發(fā)現(xiàn)共有119個DEGs可被梔子-川芎藥對逆轉(zhuǎn)。DNA甲基化在基因轉(zhuǎn)錄中起著至關重要的作用,啟動子區(qū)域高甲基化可引起下游基因的低表達。相反,低甲基化可誘導基因的高表達。在對梔子-川芎藥對誘導的基因表達變化與DNA甲基化進行關聯(lián)分析時發(fā)現(xiàn),與模型組相比,梔子-川芎凍干粉組分別有29個低甲基化高表達基因和33個高甲基化低表達基因,充分證明梔子-川芎藥對可通過調(diào)節(jié)基因甲基化進而調(diào)控基因的表達。KEGG富集分析顯示上述基因參與Focal adhesion信號通路、PI3K-Akt信號通路、AGE-RAGE信號通路等,涉及的基因包括PDGFRα、FN1及COL1A2等。

進一步分析發(fā)現(xiàn),梔子-川芎凍干粉干預后,PDGFRα、COL1A2、FN1均呈高甲基化低表達的狀態(tài)。既往研究表明,PDGFRα被激活后可誘導血管平滑肌細胞(VSMCs)的增殖和遷移,引發(fā)新內(nèi)膜病變形成和動脈粥樣硬化[18]。Thankam等[19]研究發(fā)現(xiàn),高脂血癥豬模型頸動脈血管中PDGFRα的表達明顯上調(diào),提示該基因與動脈粥樣硬化的進展密切相關。此外,研究發(fā)現(xiàn),動脈粥樣硬化病變中COL1A2與FN1的表達明顯上調(diào),提示上調(diào)的COL1A2與FN1可能與心血管風險增加相關[20-21]。因此,推測梔子-川芎藥對可能通過提高PDGFRα、COL1A2和FN1基因的啟動子區(qū)域甲基化水平進而引起下游的表達,從而起到抗動脈粥樣硬化的作用。

綜上所述,體外研究發(fā)現(xiàn)梔子-川芎藥對具有明顯的抗動脈粥樣硬化效應,其機制可能與雙向調(diào)控DNA異常甲基化進而影響下游基因的表達有關。研究篩選到的PDGFRα、COL1A2、FN1等基因可能是梔子-川芎藥對抗動脈粥樣硬化的潛在治療靶點,為未來進一步深入研究奠定了基礎。